姜曉靜，孫秀柱，朱化彬，杜衛(wèi)華，郝海生，趙學(xué)明，王棟，劉巖

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綠色熒光蛋白放射免疫分析試劑盒的研制

姜曉靜*，孫秀柱*，朱化彬，杜衛(wèi)華，郝海生，趙學(xué)明，王棟，劉巖

作者單位：100193 北京，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所（姜曉靜、朱化彬、杜衛(wèi)華、郝海生、趙學(xué)明、王棟、劉巖）；712100 陜西楊凌，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院（姜曉靜、孫秀柱）

*同為第一作者

綠色熒光蛋白（GFP）于 1962 年在一種學(xué)名為Aequorea Victoria 的水母中發(fā)現(xiàn)，包含 238 個(gè)氨基酸殘基［1-2］。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)吸收藍(lán)光的部分能量，發(fā)出綠色熒光。GFP 常用于標(biāo)記某些特定的 RNA、內(nèi)源性代謝產(chǎn)物以及靶蛋白［3］，可通過(guò)熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀察，也可通過(guò)熒光激活細(xì)胞，分選分離細(xì)胞［4］。這一活體生物標(biāo)記［5］特性，使得 GFP 成為實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞、組織、器官不可或缺的工具［6］，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)中也得到了廣泛的應(yīng)用［7-12］。

目前，對(duì) GFP 的檢測(cè)方法分為定性檢測(cè)及定量檢測(cè)。定性檢測(cè)包括熒光觀察［13］、免疫組化［14-16］、Western blot等［17-19］，定量檢測(cè)可以通過(guò) ELISA 方法。但通過(guò) ELISA 方法定量檢測(cè) GFP 含量［20-22］，顯色時(shí)間不容易控制，檢測(cè)靈敏度受到免疫反應(yīng)顯色精確度的限制。對(duì)于少量 GFP 殘留的檢出率低，不利于精確檢測(cè)［23］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制原理，研制了一種高靈敏度的GFP 放射免疫檢測(cè)試劑盒，最低檢測(cè)限位 1 pg/ml。本試劑盒的一抗使用濃度低，樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，實(shí)驗(yàn)效率高，樣品檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)現(xiàn)大批量樣品的 GFP 殘留監(jiān)控具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

緩沖液 A：0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PBS）pH 7.2；緩沖液 B：1% 牛血清白蛋白、0.1% 冷海魚皮膠、0.05% 疊氮鈉、0.1 mol/L PBS pH 7.2；GFP 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó) Vector公司；綠色熒光蛋白多克隆抗體（GFP 多抗）購(gòu)自美國(guó)Chemicon 公司，用 0.1 mol/L PBS（pH 7.2）稀釋，稀釋比例為 1∶4000。PR 分離劑由驢抗兔二抗（1∶1000 稀釋）、6% 聚乙二醇（PEG）、γ 球蛋白、0.1 mol/L PBS（pH 7.2）組成，其中驢抗兔二抗購(gòu)于北方生物技術(shù)研究所；標(biāo)準(zhǔn)品溶液為 9 個(gè)濃度梯度，分別為 1、2、4、8、16、32、64、128 和 256 pg/ml；CG-12 型 γ 計(jì)數(shù)器為美國(guó)德普公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1綠色熒光蛋白的標(biāo)記GFP 與放射性碘的結(jié)合采用氯胺-T 法進(jìn)行［24］。將 5 μg GFP 溶于 100 μl 的磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）中，加入約 37 mol/L MBq Na125I，磁力攪拌器下加入 15 μl 氯胺-T（1 μg/μl），反應(yīng) 1 min 后加入 5 μl 偏重亞硫酸鈉（2 μg/μl）終止反應(yīng)，繼續(xù)攪拌60 s，G-25 凝膠柱層析分離純化。反應(yīng)溫度為 20 ℃。最終得到125I-GFP 放射性活度約 20 000 cpm/100 μl。

1.2.2綠色熒光蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的配置臨用前吸取 GFP 標(biāo)準(zhǔn)品（1.024 ng/μl）1 μl，加 2 ml 緩沖液 A 溶解，濃度為512 pg/ml，作為 S10，另取試管 9 支，編號(hào) S9～ S1，各加緩沖液 A 1 ml，從 S10中取 1 ml 加到 S9，依次倍比稀釋至 S1，S9～ S1試管的濃度分別為 256、128、64、32、16、8、4、2、1 pg/ml。

1.2.3綠色熒光蛋白放射免疫分析程序在聚苯乙烯試管上編號(hào)，包括總管（T 管）、非特異管（NSB 管）、零結(jié)合管（S0管）、標(biāo)準(zhǔn)管（S1～ S9管）、樣本管（U 管），以上試管必須雙管標(biāo)號(hào)；向 S1～ S9管加入 200 μl 標(biāo)準(zhǔn)品、100 μl GFP 多克隆抗體及 100 μl125I-GFP；向 U 管加入200 μl 待測(cè)樣本、100 μl GFP 多克隆抗體及 100 μl125I-GFP；向 NSB 管加入 200 μl 緩沖液 A、100 μl 緩沖液 B 及 100 μl125I-GFP；向 S0管加入 200 μl 緩沖液 A、100 μl GFP 多克隆抗體及 100 μl125I-GFP；充分混勻，放置4 ℃ 24 h，每管分別加入 PR 分離劑 500 μl，充分混勻，室溫放置 20 min，4 ℃ 條件下，3500 r/min 離心 25 min，吸棄上清，測(cè)各管沉淀 cpm 數(shù)。

2　結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用平衡法，數(shù)據(jù)分析采用世界衛(wèi)生組織放射免疫分析推薦的 Logit 標(biāo)準(zhǔn)曲線法。標(biāo)準(zhǔn)曲線法使用的計(jì)算參數(shù)及計(jì)算過(guò)程如下：

⑴每對(duì)試管（T、NSB、S0、S1～ S9、U）的平均計(jì)數(shù)：計(jì)數(shù) = 平均 cpm - 本底計(jì)數(shù)。

⑵非特異結(jié)合率：NSB% = NSB/T × 100%

⑶最大結(jié)合率：B0% =（B0- NSB）/T × 100%

⑷各標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管結(jié)合率：

B/B0% ＝（B - NSB）/（B0- NSB）× 100%，其中 B =標(biāo)準(zhǔn)管（或樣本管）雙管技術(shù)的均值；B0= 零標(biāo)準(zhǔn)（S0）雙管計(jì)數(shù)的均值；NSB = 非特異雙管計(jì)數(shù)的均值。

以上各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的 B/B0為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)濃度為橫坐標(biāo)，在 Logit-Log 雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)樣本的結(jié)合率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的樣品蛋白含量?；蛴勺詣?dòng) γ 計(jì)數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線上 S1、S2、S3、S4、S5及 S9樣品管的對(duì)應(yīng)自查值分別為 0.99、2.03、7.92、16.61、30.68 和 258.52 pg/ml，與實(shí)際加入濃度相符。B 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù) NSB% = 3.4%，B0/T = 51.04%，線性回歸 r = -0.99991，A = 1.65，B = -1.41，ED75= 2.45，ED50= 14.76，ED25= 89.02。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量數(shù)據(jù)如表1 所示。

圖1　Log-logit 雙對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)量數(shù)據(jù)

試驗(yàn)應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制原理，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的 GFP 和加入的125I-GFP 共同與一定量的特異性抗體產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)。125I-GFP 同抗體的結(jié)合量與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中 GFP 的含量呈一定的函數(shù)關(guān)系。用免疫分離試劑（PR）將結(jié)合部分（B）與游離部分（F）分離后，測(cè)定結(jié)合部分的放射性強(qiáng)度，并計(jì)算相應(yīng)結(jié)合率 B/B0。用已知標(biāo)準(zhǔn) GFP 含量與對(duì)應(yīng)結(jié)合率作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)結(jié)合率的待測(cè)樣品中 GFP 的含量。

3　討論

本試劑盒檢測(cè)靈敏度高，最低檢測(cè)限位 1 pg/ml，明顯高于商用試劑盒，如 Cell Biolabs 公司 GFP ELISA 試劑盒，靈敏度為 30 pg/ml［25-27］；Bioo Scientific 公司的 GFP ELISA 試劑盒，檢測(cè)范圍為 2 ～ 12 ng/ml［28-29］。同位素檢測(cè)靈敏度高于 ELISA 顯色反應(yīng)。

GFP 放射免疫試劑盒準(zhǔn)確性高，假陽(yáng)性率低。放射免疫檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)尤其體現(xiàn)在一些含有內(nèi)源性的酶和生物素的動(dòng)物組織中，如肝臟、脾臟、腎臟。在辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素的 ELISA 體系中，內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶或生物素會(huì)提高陰性樣本的讀值，引發(fā)假陽(yáng)性的 ELISA反應(yīng)。放射免疫試劑盒由于直接用同位素標(biāo)記抗原，與樣本中抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體，沒有生物素、過(guò)氧化物酶體系，從根源上避免了內(nèi)源性酶及生物素的假陽(yáng)性反應(yīng)，大大提高了檢測(cè)的效率。

樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單。體液樣本、細(xì)胞培養(yǎng)液可直接用于測(cè)定；組織樣本，無(wú)論是否含有內(nèi)源性酶及生物素，前處理步驟僅需組織總蛋白提取及總蛋白定量步驟，不需要對(duì)內(nèi)源性酶及生物素進(jìn)行屏蔽，減少溶液配制，精簡(jiǎn)操作步驟，節(jié)約時(shí)間，節(jié)約勞動(dòng)力。而 ELISA 試劑盒通常不包含內(nèi)源性酶及生物素抑制劑，需要使用者單獨(dú)配置。

本試劑盒測(cè)定通量高，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，提高實(shí)驗(yàn)效率，采用 CG-12 型 γ 放射免疫計(jì)數(shù)器可一次同時(shí)檢測(cè) 300 個(gè)試管，大大提高檢測(cè)效率。

本試驗(yàn)建立一種簡(jiǎn)便的、高靈敏度的綠色熒光蛋白放射免疫檢測(cè)方法。根據(jù)該法研制的放射免疫試劑盒檢測(cè)靈敏度為 1 pg/ml，檢測(cè)范圍為 1 ～ 256 pg/ml，一抗稀釋比例為1∶4000，可用于測(cè)定體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 GFP 蛋白表達(dá)豐度，也可用于測(cè)定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血液、器官、組織蛋白溶液中的GFP 殘留。

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·協(xié)會(huì)之窗·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.014

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31301977）；農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS06-2016）；西北農(nóng)林科技大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)費(fèi)（Z111021203）

通信作者：劉巖，Email：liuyan05@caas.cn

收稿日期：2015-11-04