黃帥，郭慧慧，王璐璐，韓燕星，蔣建東

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miRNAs與腫瘤

黃帥，郭慧慧，王璐璐，韓燕星，蔣建東

作者單位：100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所（黃帥、郭慧慧、王璐璐、韓燕星、蔣建東），醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（黃帥、蔣建東）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長 19 ～ 24 nt 的單鏈、內(nèi)源性非編碼 RNA，其序列高度保守。成熟 miRNA的轉(zhuǎn)錄生成首先是在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng) RNA 多聚酶 II 和（或）多聚酶 III 的作用形成初始 miRNA（pri-miRNA），然后在核內(nèi)切酶 Drosha Rnase III 作用下，去除 pri-miRNA 的5'-cap 和 3'-poly（A） 結(jié)構(gòu)形成含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體 miRNA （pre-miRNA），再經(jīng)由 Ran-GTP/Exportin-5 受體將pre-miRNA 從核內(nèi)輸出到細(xì)胞質(zhì)，在胞質(zhì)經(jīng) Dicer 酶和解螺旋酶作用后形成單鏈成熟 miRNA；成熟 miRNA 被RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）如 Argonaute 核蛋白家族包裹，形成 miRNA 沉默復(fù)合體（miRNP），miRNP 可以與靶基因 mRNA 的 3'-UTR互補(bǔ)配對，使 mRNA 發(fā)生降解或轉(zhuǎn)錄抑制，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用［1］。單一 miRNA 可調(diào)控多個靶基因，一個靶基因也可由多個 miRNAs 共同調(diào)控，這些靶基因大多數(shù)參與了機(jī)體分化，細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等生理過程。最新研究還發(fā)現(xiàn)另一類內(nèi)源性長非編碼 RNA（long uncoding RNA，lncRNA）可調(diào)控靶基因 mRNA 表達(dá)，也可作為競爭性內(nèi)源 RNA（ceRNA）拮抗 miRNA 的轉(zhuǎn)錄抑制作用［2］（圖1）。

最早報道 miRNA 是在 1993 年，科學(xué)家在秀麗短桿線蟲體內(nèi)得到，分析發(fā)現(xiàn)它包含約 21 個非編碼核苷酸序列，部分序列能與 lin-14 mRNA 的 3'-UTR 互補(bǔ)配對結(jié)合，抑制 lin14 蛋白合成，取名為 lin-4［3-4］。后來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 在多種動植物體內(nèi)都存在，截至 2014 年 6 月，miRBase 數(shù)據(jù)庫報道的 miRNAs 總數(shù)已達(dá) 28 645 個。越來越多的研究證實(shí)，在人類多種疾病如腫瘤、心血管疾病和代謝性疾病等病理過程中，miRNAs 的表達(dá)均出現(xiàn)異常。

可以說 miRNAs 參與了腫瘤整個發(fā)生、發(fā)展過程，它與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲、分布及自噬凋亡、腫瘤血管形成、腫瘤微環(huán)境代謝和干細(xì)胞分化等有著密切關(guān)系。miRNAs 可作為腫瘤抑制因子，影響調(diào)節(jié)癌蛋白如 MYC、RAS、HMG1、BCL-2 等的表達(dá)，產(chǎn)生腫瘤抑制作用，如 let-7可以抑制 RAS 基因而發(fā)揮腫瘤抑制作用；miRNAs 也可作為腫瘤因子調(diào)控抑癌蛋白如 p53、p21、BAX 等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，如 BIC/miR-155 可抑制 BCl-2 蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)換成為致瘤基因［5］。此外，miRNAs 同時在機(jī)體腫瘤免疫調(diào)節(jié)和基因修復(fù)機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用。本文對與幾種重要腫瘤密切相關(guān)的 miRNAs 作一綜述。

圖1　miRNA 的成熟過程及作用機(jī)制

1　白血病相關(guān) miRNAs

慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）是發(fā)生在成年人中最常見的一類白血病，其中 miRNAs 參與腫瘤發(fā)生的報道最早見于 CLL。急性髓系白血病（AML）也是成人中最常見的急性白血病，目前已報道多個 miRNAs與 AML 的發(fā)生密切相關(guān)。

1.1慢性淋巴細(xì)胞白血病

1.1.1miR-15/16 簇miR-15/16 成簇定位在 13q14.3 基因中，而大多數(shù)的 CLL 病例中出現(xiàn) 13q14.3 基因缺失，因此， miR-15 和 miR-16 呈現(xiàn)缺失表達(dá)。miR-15/16 簇可作用到靶基因 BCL-2 的 3'-UTR，抑制 BCL-2 的表達(dá)，BCL-2 作為促癌基因可以拮抗腫瘤細(xì)胞的凋亡，在多種白血病、淋巴瘤等中高表達(dá)。同時，miR-16 能夠識別結(jié)合 AU序列富集區(qū)域，通過與靶基因如 MCL1、WNT3A、CCND 和CCNE 的結(jié)合區(qū)互補(bǔ)配對，影響周期蛋白穩(wěn)定性，減少其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。因此，miR-15/16 簇作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用［6］。

將轉(zhuǎn)染 miR-15/16 表達(dá)載體的MEG-01細(xì)胞株移植到裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)過表達(dá) miR-15/16 后使得 MEG-01 腫瘤細(xì)胞的植入生長明顯受到抑制，檢測 PDCD4、RAB21、IGSF4、SCAP2 和 BCL-2 的 mRNA 和蛋白表達(dá)均降低［7］；分別過表達(dá) miR-15 或 miR-16 后可使 TP53 表達(dá)量降低 52% 和 62%，miR-15/16 同時高表達(dá)可使 TP53 表達(dá)量減少 82%。同時有研究發(fā)現(xiàn)，在 13 號染色體和 3 號染色體上，miR-15/16 簇的兩個同源物（miR-15a/16-1 和miR-15b/16-2）的上游區(qū)存在 TP53 的結(jié)合位點(diǎn)，TP53 可直接激活 miR-15/16 簇兩個同源物的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［8］。

1.1.2miR-150對 CLL 患者的淋巴結(jié)組織進(jìn)行 miRNA原位雜交，發(fā)現(xiàn) miR-150 在淋巴細(xì)胞增殖中心區(qū)（PC）的外周表達(dá)量高，而在 PC 區(qū)域幾乎無表達(dá)［9］。與健康人相比，在 CLL 患者的 B 細(xì)胞和血清中，miR-150 均上調(diào)表達(dá)，且在細(xì)胞和血清中 miR-150 的高表達(dá)狀態(tài)與腫瘤惡性程度大、預(yù)后差具有相關(guān)性。這是由于大量淋巴細(xì)胞循環(huán)進(jìn)入血液，使血清中 miR-150 水平高［10］。高表達(dá) miR-150 同時可抑制調(diào)節(jié) GRB2 相關(guān)結(jié)合蛋白 1（GAB1）和叉頭蛋白P1（FOXP1）的表達(dá)，GAB1 和 FOXP1 是 B 細(xì)胞受體信號分子，決定了 B 細(xì)胞的存活和增殖。因此，miR-150 是CLL 重要的腫瘤抑制性 miRNA 和預(yù)后診斷標(biāo)志物［11］。

1.2急性髓系白血病

1.2.1miR-155利用多變量 Cox 模型分析發(fā)現(xiàn)，AML患者血清 miR-155 的高表達(dá)與總生存率差具有相關(guān)性［12］。MiR-155 作用到靶基因如 PU.1、JUN 和 CEBP-β，可抑制髓系細(xì)胞分化。在 FMS 樣酪氨酸激酶受體 3（FLT3）突變的 AML 患者血清中，miR-155 上調(diào)表達(dá) 8.353 倍，而分化基因 PU.1、JUN、CEBP-β 表達(dá)分別下調(diào) 0.36%、0.22% 和 0.26%［13-14］。一些天然結(jié)構(gòu)改造化合物，如 silvestrol 可以降低 FLT3 的表達(dá)，間接抑制 miR-155 水平，發(fā)揮抗髓細(xì)胞瘤活性［15］。此外，由于 miR-155 的宿主基因上游存在兩個 p65 和一個 STAT5 的結(jié)合位點(diǎn)，作為癌基因miR-155 受到 NF-κB（p65）和 STAT5 的調(diào)控，激活 p65或同時轉(zhuǎn)染 STAT5 能夠啟動 miR-155 的表達(dá)，使髓細(xì)胞分化受抑制，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和存活［16］。

1.2.2miR-181分析 30 例 AML 血樣標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，miR-181a 的表達(dá)與急性髓系白血病的形態(tài)分型具有一定相關(guān)性，在 M4 和 M5 型中 miR-181 的表達(dá)水平低于 M1 和 M2 型。miR-181a 的表達(dá)與急性髓系的基因分型也有相關(guān)性，相比基因正常型（CN-AML），在基因異常型急性髓系白血病（CA-AML）中，miR-181 呈高表達(dá)。因此，miR-181可作為 AML 分類的標(biāo)志物［17］。

MiR-181 也是 AML 診斷預(yù)后的標(biāo)志物，低表達(dá)miR-181 的 CN-AML 患者總生存期較長和無疾病事件生存率高，是良好預(yù)后的重要標(biāo)志。而在 CA-AML 患者中，miR-181 高表達(dá)是預(yù)后良好的重要標(biāo)志，這與 miR-181 調(diào)控靶基因 HOXA7、HOXA9、HOXA11 和 PBX3 的表達(dá)有關(guān)。HOXAs 和 PBX3 代表著 AML 預(yù)后不良，總生存期短。過表達(dá) miR-181 可降低內(nèi)源性的 HOXAs 和 PBX3的表達(dá)。MiR-181 還可以抑制白血病細(xì)胞的存活和增殖，促進(jìn)其凋亡，延長白血病的發(fā)生周期，抑制白血病的發(fā)生和進(jìn)展［18］。

也有報道稱 miR-181 可抑制調(diào)節(jié)白血病抑制因子（LIF）表達(dá)，LIF 在人類胚胎移植中起重要作用，可影響卵巢功能，降低受孕率。Emx2 能結(jié)合到 miR-181 的啟動子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄激活 miR-181 表達(dá)，因而通過抑制 Emx2 的表達(dá)，可直接升高 LIF 水平［19］。同時由于 miR-181 也能夠降低靶基因 PRKCD、CTDSPL 和 CAMKK1 水平，使髓系細(xì)胞的分化受到抑制。因此采取降低 miR-181 表達(dá)，誘導(dǎo)髓系細(xì)胞分化也是治療 AML 的新策略［20］。

2　實(shí)體腫瘤相關(guān) miRNAs

2.1肺癌

在全世界范圍內(nèi)肺癌致死率高，5 年總生存率僅有15%。其生存率與診斷時間密切相關(guān)，多數(shù)患者診斷時已到晚期，因此尋找早期診斷標(biāo)志物對于提高患者生存率具有重要意義。研究者們發(fā)現(xiàn)，miRNAs 可作為肺癌早期診斷的標(biāo)志物，包括其在血清、血漿、組織、分泌物等中的表達(dá)。

2.1.1Let-7 家族Let-7 家族共有 12 個同源物，Takamizawa 等［21］首次發(fā)現(xiàn) let-7 家族在肺癌組織中低表達(dá)。選用 20 種肺癌細(xì)胞株檢測發(fā)現(xiàn)，其中的 12 株（60%）細(xì)胞 let-7 的降低幅度大于 80%。同樣，在 16 例術(shù)后患者肺癌組織中有 7 例（44%）let-7 的降低幅度大于 80%。此外，let-7 的低表達(dá)與肺癌患者術(shù)后生存期縮短也有一定的相關(guān)性（P = 0.03）。

通過構(gòu)建載體體外過表達(dá) let-7 家族，能夠抑制肺癌細(xì)胞生長，利用體外轉(zhuǎn)染過表達(dá) let-7 的 A549和 H460 細(xì)胞株建立肺癌移植瘤模型，證實(shí) let-7 能夠減緩腫瘤的生長。這是由于 let-7 通過減少靶蛋白 G12D 表達(dá)，導(dǎo)致 Kras癌基因發(fā)生突變概率降低［22］。另一方面，RAS 蛋白在肺癌組織中高度表達(dá)，分析發(fā)現(xiàn)，RAS mRNA 的 3'-UTR 存在let-7 的互補(bǔ)序列。通過體外雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，let-7可調(diào)控 RAS 的表達(dá)，因此可以認(rèn)為，let-7 作為抑制性miRNA，抑制 RAS 靶蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，影響肺癌的發(fā)生［23］。

2.1.2miR-138與非小細(xì)胞肺癌癌旁組織相比，腫瘤組織中 miR-138 低表達(dá)，與體外肺癌細(xì)胞株中表達(dá)一致。MiR-138 可作用于靶基因 EZH2 介導(dǎo)抑制肺癌細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞 G1/S 周期阻滯，誘導(dǎo)凋亡，發(fā)揮抑制腫瘤活性［24］。EZH2 是一種甲基化蛋白，在致癌劑尿烷誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型中同樣顯著性高表達(dá)［25］。同時，miR-138 也能夠作用到 H2AX，致使肺癌細(xì)胞的 DNA 損傷修復(fù)能力受到嚴(yán)重破壞［26］。

血清中的 miR-138 水平可作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后診斷標(biāo)志物。miR-138 可通過靶向 3-磷酸肌醇依賴的蛋白激酶 1（PDK1）抑制腫瘤細(xì)胞的代謝、增殖和存活。在 100 名非小細(xì)胞肺癌患者血清中，miR-138 表達(dá)顯著低于正常人血清水平［（2.47 ± 1.23）vs（4.46 ± 1.32），P ＜ 0.001］，相反，PDK1 的表達(dá)顯著升高［（3.90 ± 1.38）vs（1.13 ± 0.34），P ＜0.001］，miR-138 低表達(dá)且 PDK1 高表達(dá)的患者占 48%，這部分患者的總生存數(shù)是最少的［27］。

此外，血清中的 miR-138 水平可能還與某些治療的敏感性相關(guān)。在吉非替尼耐藥模型株 PC9GR 里，miR-138 呈現(xiàn)低表達(dá)，而 G 蛋白偶聯(lián)受體 124（GPR124）高表達(dá)，兩者同時影響 PC9GR 對吉非替尼敏感性。miR-138-5p 能夠抑制 GPR124 表達(dá)，降低 GPR124 的表達(dá)或升高miR-138，可有效克服吉非替尼耐藥出現(xiàn)［28］。此外，miR-138還可以抑制 SENP1 表達(dá)，改善放射性治療的敏感性［29］。

2.2肝癌

肝癌是致死率位居第二的癌癥，其發(fā)病因素包括酒精性和非酒精性脂肪肝、遺傳性因素和 HBV、HCV 長期慢性感染引發(fā)的肝炎等。

2.2.1miR-34a采用 75 份臨床肝癌組織標(biāo)本驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)，miR-34a 的表達(dá)顯著降低，且與端粒酶的活性和端粒長度具有一定的相關(guān)性。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá) miR-34a 能抑制端粒酶活性，縮減端粒長度，迫使細(xì)胞呈現(xiàn)衰老表型，這是由于 miR-34a 作用到靶基因 c-MYC 和 FOXM1，這兩個基因參與了活化維持端粒長度和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的端粒逆轉(zhuǎn)錄酶的轉(zhuǎn)錄過程，因而使 miR-34a 間接抑制端粒逆轉(zhuǎn)錄酶的生成［30］。

在肝癌細(xì)胞，如 Huh7、HepG2 和 Bel7402 中，過表達(dá) miR-34a 能夠同時降低 CDK6、CCND1、FOXP1、c-MET 和 CCNE 水平，引起細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡［31-32］。某些小分子化合物可通過 miR-34a 介導(dǎo)其抗腫瘤活性。如 Rubone 可作為miR-34a 的調(diào)節(jié)子，增強(qiáng) p53 與 miR-34a 啟動子區(qū)域的親和力，升高 miR-34a 的表達(dá)；而在 p53 基因敲除的 Hep3b肝癌細(xì)胞株中，Rubone 的抗腫瘤活性消失，也證實(shí)了Rubone 的抗腫瘤活性與 p53 基因及其調(diào)控的 miR-34a相關(guān)［33］。

2.2.2miR-21與人肝癌癌旁組織相比，肝癌組織中高表達(dá) miR-21。高表達(dá) miR-21 的肝癌患者 5 年生存率低，僅有 40.2%，而低表達(dá) miR-21 的肝癌患者為 70.7%，且高表達(dá)組患者的 5 年無瘤生存期也相對較短，為 17.4%，而低表達(dá)組患者為 57.3%。

與原代正常肝細(xì)胞相比，肝癌細(xì)胞中 miR-21 和HMGB1 同時高表達(dá)，并證實(shí) HMGB1 可依賴 IL-6/STAT3信號途徑激活調(diào)控 miR-21 的表達(dá)。升高 miR-21 水平能夠抑制 RECKs 和 TIMP3 的表達(dá)，后兩者是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的抑制劑，所以 miR-21 的水平升高間接抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移［34］。

在肝癌患者（30 例）的血清外泌體中，miR-21 的表達(dá)顯著高于正常人（5.57 倍）的水平，同時高于無外泌體的血清和全血清中的水平（1.62 倍和 3.98 倍）。這種高表達(dá)與肝癌臨床病理分級具有一定的相關(guān)性，但與年齡、性別和有無 HBV 感染無關(guān)［35］。

同時，miR-21 通過靶向 Aurora-A 激酶，可降低細(xì)胞毒類化療藥物在肝癌治療中的敏感性。Aurora-A 是促進(jìn)有絲分裂紡錘體的中心體復(fù)制和分離的激酶之一，沉默Aurora-A 也能夠同時降低 miR-21 表達(dá)。由于 miR-21 抑制 PTEN 的表達(dá)，消除 PTEN 對 PI3K/Akt 信號通路的負(fù)調(diào)控作用，使得 PI3K/Akt 通路激活，間接導(dǎo)致 BCL-2 家族蛋白表達(dá)減少，影響肝癌細(xì)胞凋亡。同時還發(fā)現(xiàn)，NF-κB激活 miR-21 啟動子區(qū)域，促進(jìn) miR-21 表達(dá)［36］。

在中國，HBV 感染是誘發(fā)導(dǎo)致肝癌的主要因素之一，這是由于 HBV 自身編碼的 X 蛋白（HBx）通過上調(diào) IL-6磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子 STAT3，引起 miR-21 高表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌發(fā)生［37］。

3　其他腫瘤相關(guān) miRNAs

3.1miR-143/145 家族

miR-143/145 家族在多種腫瘤中發(fā)揮重要抑瘤作用。有研究證實(shí)，在乳腺癌、結(jié)腸癌中，miR-143/145幾乎無表達(dá)，這是由于 Dicer 酶在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控 pre-miRNA 成熟的過程被阻斷，直接降低了 miR-143/145 表達(dá)。通過體外過表達(dá) miR-143/145，可降低靶基因 ERBB3 的表達(dá)，抑制乳腺癌的生長和侵襲；也可減少 IGF1R 的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長［38-39］。在子宮內(nèi)膜癌組織中，miR-143/145 家族呈下調(diào)表達(dá)，而其靶基因 DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶 3B （DNMT3B）呈高表達(dá)，預(yù)示了子宮內(nèi)膜癌預(yù)后診斷差［40］。在脂肪瘤組織中 miR-143/145 家族也是低表達(dá)的，過表達(dá)miR-143/145 可通過影響細(xì)胞周期調(diào)控，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡，抑制脂肪瘤的生長［41］。

3.2miR-124

抑制性肝細(xì)胞核因子 4α（HNF4α）是能夠?qū)е赂伟┑囊活惣?xì)胞因子，通過結(jié)合到 miR-124 的啟動子區(qū)域，啟動miR-124 的表達(dá)。升高 miR-124 可以通過降低靶基因IL6R 水平，間接影響 STAT3 活性［42］。在膠質(zhì)瘤中 miR-124可調(diào)節(jié) PTBP1 的表達(dá)，誘導(dǎo)祖細(xì)胞分化成熟［43］。同時，miR-124 可以協(xié)同 miR-147 和 miR-193 作用于 EGFR驅(qū)動的細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)相關(guān)蛋白如 RB1、p27、CDK4 等，影響乳腺癌細(xì)胞周期分裂和增殖［44］。

表1　幾種重要的腫瘤相關(guān) miRNAs

4　展望

綜上所述，無論是作為診斷標(biāo)志物還是未來用作治療工具，miRNAs 在腫瘤中都發(fā)揮著重要作用。由于不同miRNAs 在各類腫瘤的表達(dá)及其作用靶點(diǎn)存在差異，決定了其發(fā)揮的作用不同（表1）。如前述，miR-181 可作為 AML分類和預(yù)后診斷的標(biāo)記物，miR-138 是非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后診斷標(biāo)記物，也是腫瘤治療耐藥的標(biāo)記物。目前，在精準(zhǔn)醫(yī)療新形勢指導(dǎo)下，探尋研發(fā)用于診治腫瘤的生物類藥物或調(diào)控 miRNAs 的低毒性天然活性類藥物勢必會成為研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)。由于腫瘤疾病的復(fù)雜性和多樣性，且對其發(fā)生預(yù)警、發(fā)病因素、病理機(jī)制、診斷分類和治療方案的研究尚未完全明確，這也就決定了腫瘤的診斷和治療比較棘手。miRNAs 作為內(nèi)源性物質(zhì)，在機(jī)體自身發(fā)育、分化和疾病發(fā)生過程中發(fā)揮作用，標(biāo)志性 miRNAs 能夠及早提示機(jī)體的狀態(tài)變化，受低毒性天然活性類藥物調(diào)控性 miRNAs 或直接治療性 miRNAs 能夠逃脫機(jī)體免疫反應(yīng)，展現(xiàn)出良好的治療效果。同時鑒于 miRNAs 的組織分布廣泛性和作用多靶點(diǎn)的特性，決定了其對研究或治療各因素導(dǎo)致的腫瘤、開發(fā)新的抗腫瘤藥物、延長患者的生存時間和總生存率具有重要的臨床意義。

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技術(shù)與方法

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.013

基金項(xiàng)目：創(chuàng)新藥物非臨床藥物代謝及藥代/藥效研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（Z141102004414062）

通信作者：韓燕星，Email：hanyanxing@imm.ac.cn；蔣建東，Email：jiang.jdong@163.com

收稿日期：2016-03-04