謝一泓，黎丹戎

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適用于多細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)孔板的研制

謝一泓，黎丹戎

作者單位：122000 遼寧，朝陽市中心醫(yī)院腫瘤內科（謝一泓）；530021南寧，廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)學院（黎丹戎）

細胞微環(huán)境即細胞生長所處的內環(huán)境，由多因素組成，對細胞的生物學特性和功能起重要作用，不僅影響細胞的正常生理過程，也影響細胞的病理過程。

體外細胞培養(yǎng)是進行基礎研究、藥物研發(fā)的重要途徑，但單一細胞培養(yǎng)與體內環(huán)境相差很大［1-2］，因此會影響細胞的生長狀態(tài)、功能特性等，使體內外研究結果不一致。細胞共培養(yǎng)即將不同種類細胞混合共同培養(yǎng)，主要有兩種方法：直接共培養(yǎng)和間接共培養(yǎng)。直接共培養(yǎng)體系［3］是將 2 種或2 種以上的細胞按一定比例同時接種于同一培養(yǎng)器材內，不同類型的細胞之間直接接觸培養(yǎng)。間接共培養(yǎng)體系，即將2 種或 2 種以上的細胞分別接種于不同的載體上，然后將這兩種載體置于同一培養(yǎng)環(huán)境之中，即不同種類的細胞共用同一種培養(yǎng)系統(tǒng)而不直接接觸，如 Transwell 小室共培養(yǎng)皿［4］。

現(xiàn)有的共培養(yǎng)技術存在一定的不足及局限性，直接共培養(yǎng)體系的多種細胞培養(yǎng)后無法分離進行后續(xù)研究，不能滿足實驗需求。間接共培養(yǎng)體如 Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)，只能進行兩種細胞共培養(yǎng)，無法實現(xiàn)多細胞共培養(yǎng)，且兩種細胞中有一種生長在膜上，進行后續(xù)實驗不便。為使體外研究能夠更好地反映體內情況，滿足實驗需求，研制適用于多細胞共培養(yǎng)孔板成為當務之急。該孔板有利于細胞間信號傳遞和細胞因子相互作用，為細胞的生長及生物學功能的發(fā)揮提供適宜的微環(huán)境，可更加準確模擬體內環(huán)境。

1　材料與方法

1.1材料

細胞共培養(yǎng)孔板，包括若干個相互連接的培養(yǎng)孔、活塞、聚碳酸酯隔膜，活塞采用硅膠或與培養(yǎng)板材質相同材料制作，細胞共培養(yǎng)孔板材質采用國際通用的具有較好光學性能、透明性和生物相容性的聚苯乙烯制作。

1.2方法

本細胞共培養(yǎng)孔板包括若干個相互連接的培養(yǎng)孔，相鄰的培養(yǎng)孔之間設有通孔，通孔可由活塞密封，活塞上設有手柄方便裝卸，使用時根據(jù)實驗需求，可卸下 1 個或多個活塞，使培養(yǎng)孔之間互通，達到培養(yǎng)液互通，從而各細胞分泌或代謝產物實現(xiàn)相互影響，相互作用；同時通孔處還可安裝隔膜進行懸浮細胞相關實驗。用于開展多細胞共培養(yǎng)后分泌或代謝產物的變化研究或針對某一特定靶細胞生物學變化的研究。

圖1　細胞共培養(yǎng)六孔板模型圖

2　結果

圖1 為細胞共培養(yǎng)六孔板，通過活塞的開閉或聚碳酸酯膜的作用實現(xiàn)共培養(yǎng)目的，用于研究人淋巴管內皮細胞（HLEC）、人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的不同微環(huán)境對卵巢癌淋巴結高轉移細胞（SKOV3-PM4）的影響，為闡明卵巢癌轉移發(fā)展機制提供理論依據(jù)［5-6］。以細胞共培養(yǎng)六孔板為例，A 細胞為 HLEC 細胞，C 細胞為 SKOV3-PM4 細胞，E 細胞為 HUVEC細胞。在實驗中，如需要觀察 HLEC細胞對 SKOV3-PM4 細胞的影響，可打開 A、C 細胞培養(yǎng)孔的通孔，實現(xiàn)兩者的共培養(yǎng)；如需要觀察 HUVEC 細胞對 SKOV3-PM4 細胞的影響，可打開 C、E 細胞培養(yǎng)孔的通孔，實現(xiàn)兩者的共培養(yǎng)；如需要觀察 HLEC 和 HUVEC細胞對 SKOV3-PM4 細胞的共同影響，可打開 A、C 和 C、E 細胞培養(yǎng)孔的通孔，實現(xiàn)三者的共培養(yǎng)。共培養(yǎng)一定時間后，可顯微鏡下觀察 SKOV3-PM4 的形態(tài)變化，提取其RNA 和蛋白質進行基因及蛋白水平表達變化的研究，提取其培養(yǎng)基上清與單獨培養(yǎng)的癌細胞培養(yǎng)基上清相比，測其分泌蛋白的變化情況；還可加入成纖維細胞等進行共培養(yǎng)。同時可進行多組實驗的觀察比較，如 A、C、E 培養(yǎng) HLEC 細胞，B 培養(yǎng) SKOV3-PM4 細胞，D 培養(yǎng)過表達 SPARC 基因的 SKOV3-PM4 細胞［7］，F(xiàn) 培養(yǎng)卵巢癌細胞 SKOV3 （SKOV3-PM4 細胞的親本細胞），共培養(yǎng)一定時間后，可做集落形成、劃痕實驗等測定癌細胞增殖、遷移能力變化，可用于研究基因干預對癌細胞的生物學作用。在共培養(yǎng)環(huán)境下，進行藥物干預、研發(fā)、減毒增效研究，比藥物對單一細胞的研究實驗更貼近體內環(huán)境，提高準確性。同理，通孔處安裝隔膜可進行懸浮細胞相關實驗。

細胞共培養(yǎng)孔板可進行多細胞在同一培養(yǎng)體系、同一時間培養(yǎng)，并實現(xiàn)對其分泌或代謝產物的功能及作用機制的后續(xù)研究，對靶細胞可達到由點及面，有針對性的研究。同時，還可進行體外單藥或多藥相關作用的研究。

3　討論

本細胞共培養(yǎng)孔板可根據(jù)不同實驗的需求，組裝為不同類型和規(guī)格?？蓪崿F(xiàn)多種細胞非接觸共培養(yǎng)，有利于細胞與細胞、細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間進行物質交換，相互影響，相互作用，從而實現(xiàn)模擬體內環(huán)境的作用。同時，不會造成不同細胞之間的污染與混雜，易于收獲細胞，有助于后續(xù)進行相關功能機制的研究，并可用于體外細胞藥物研究，具有準確、可控及方便使用等優(yōu)勢。

經市場調查分析顯示，本培養(yǎng)孔板屬新產品，功能及優(yōu)勢符合科研實驗需求，因此有廣闊的發(fā)展應用前景。但此技術尚不成熟，還存在一些問題，如培養(yǎng)液的流動性等方面，還需進一步的優(yōu)化探索及實踐。

參考文獻

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·協(xié)會之窗·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.016

通信作者：謝一泓，Email：xieyihongxyh@sina.com

收稿日期：2015-10-19