畢軍，王強(qiáng)，孫文

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Vero細(xì)胞微載體放大培養(yǎng)技術(shù)研究

畢軍，王強(qiáng)，孫文

作者單位：430081 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院（畢軍、王強(qiáng)）；200080 上海聆海生物科技有限公司（畢軍）；430207 武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司（孫文）

目前，國內(nèi)大部分疫苗企業(yè)仍采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)工藝來生產(chǎn)病毒性疫苗，該方法存在細(xì)胞密度低、病毒滴度低、勞動強(qiáng)度大等缺點。20 世紀(jì) 70 年代，建立了微載體/生物反應(yīng)器培養(yǎng)動物細(xì)胞的工藝［1］，把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)兩種培養(yǎng)工藝融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點，使得動物細(xì)胞工業(yè)化的大規(guī)模、高密度培養(yǎng)，以滿足生物技術(shù)發(fā)展的需要，而細(xì)胞微載體放大培養(yǎng)就是其中的關(guān)鍵技術(shù)之一［2］。

本文通過胰酶消化微載體上 Vero 細(xì)胞，實現(xiàn)了 5 L 到 50 L 生物反應(yīng)器的放大培養(yǎng)，為后續(xù)更大規(guī)模的生物反應(yīng)器培養(yǎng) Vero 細(xì)胞，生產(chǎn)病毒性疫苗奠定基礎(chǔ)并積累經(jīng)驗。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株Vero細(xì)胞，編號為 CCL-81，來自美國典型菌種保藏中心（ATCC）。

1.1.2微載體Cytodex-1 購于美國 GE Healthcare 公司，經(jīng) PBS 水化處理后使用。生物反應(yīng)器應(yīng)用中，微載體密度為 10 g/L。

1.1.3主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)基 DMEM 購自美國 Gibco公司，加 8% ～ 10% 小牛血清，pH 7.0 ～ 7.2；細(xì)胞消化液為 0.25% 胰酶加 0.01% EDTA，其中胰酶購自美國 Gibco公司；EDTA 購自美國 Sigma 公司。

1.1.4主要設(shè)備C-Bio 型生物反應(yīng)器為法國 Sysbiotech公司產(chǎn)品，工作體積 5 L 和 50 L。

1.2方法

1.2.15 L 生物反應(yīng)器 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)取 2 ～ 4 瓶生長良好的 10 L 轉(zhuǎn)瓶 Vero 細(xì)胞，加入細(xì)胞消化液，待細(xì)胞層松散、細(xì)胞圓縮時，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)充分搖勻分散、合并，制成細(xì)胞懸液。

以 2.0 × 105個/ml 的細(xì)胞密度接種于 5 L 生物反應(yīng)器。補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液至罐體工作體積（5 L）。設(shè)定控制溫度37 ℃、pH 7. 2、攪拌 40 ～ 50 r/min、溶氧 50% ～ 60% 進(jìn)行灌流培養(yǎng)，灌流速度為 0 ～ 2 培養(yǎng)體積/d。每天取樣，檢測細(xì)胞密度和活率。

1.2.25 L 生物反應(yīng)器細(xì)胞收獲微載體細(xì)胞匯合率達(dá)到80% 以上時，關(guān)閉生物反應(yīng)器各控制參數(shù)，系統(tǒng)終止培養(yǎng)。待微載體細(xì)胞充分沉降后，排出培養(yǎng)液上清。加入含 EDTA 的 PBS（無 Ca2+、Mg2+）溶液，洗滌微載體細(xì)胞 3 次，每次清洗10 ～ 20 min。

漂洗后，加入細(xì)胞消化液消化微載體細(xì)胞。消化期間，取樣觀察，待 80% 細(xì)胞脫離微載體時，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化。同時打開攪拌，速度為 100 r/min。5 min 后，停止攪拌。待微載體沉降后，收集 Vero 細(xì)胞懸液。

1.2.350 L 生物反應(yīng)器 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)將收集的 Vero細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入至 50 L 生物反應(yīng)器內(nèi)。細(xì)胞接種密度，每1 個微載體對應(yīng)有 5 個以上 Vero 細(xì)胞。補(bǔ)加細(xì)胞培養(yǎng)液至罐體工作體積（50 L）。設(shè)定控制溫度 37 ℃、pH 7.2、攪拌 40 ～ 60 r/min、溶氧 50% ～ 60% 進(jìn)行灌流培養(yǎng)，灌流速度為 0 ～ 2 培養(yǎng)體積/d。每天取樣，檢測細(xì)胞密度和活率。

2　結(jié)果

表1　5 L 和 50 L 生物反應(yīng)器中的細(xì)胞數(shù)量和密度

2.15 L 生物反應(yīng)器 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)

以 2.0 × 105個/ml 的細(xì)胞密度接種于 5 L 生物反應(yīng)器中，培養(yǎng) 120 h 后，95% 以上微載體上細(xì)胞匯合度達(dá)到95% 以上，細(xì)胞密度可達(dá)到 9.5 × 106個/ml 左右（表1），有部分微載體之間出現(xiàn)細(xì)胞匯合及球連球（圖1）。此時，Vero 細(xì)胞已經(jīng)貼滿微載體表面，細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞活率保持在 95% 以上，收集 Vero 細(xì)胞懸液（圖2），準(zhǔn)備接種于 50 L 生物反應(yīng)器。

細(xì)胞消化前，5 L 生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞總數(shù)為 4.75 × 1010個，經(jīng) PBS 漂洗和胰酶消化后，實際收集的細(xì)胞總數(shù)3.14 × 1010個（表1），Vero 細(xì)胞收獲率約為 66%，細(xì)胞活率約為 80%。

2.250 L 生物反應(yīng)器 Vero 細(xì)胞培養(yǎng)

以 6.3 × 105個/ml的細(xì)胞密度接種 50 L 生物反應(yīng)器中，培養(yǎng) 24 h 后，細(xì)胞密度為 4.3 × 105個/ml，較初始接種密度有明顯下降（表2）。培養(yǎng) 5 d 后，95% 以上微載體上細(xì)胞匯合度達(dá)到 95% 以上，細(xì)胞密度可達(dá)到 8.0 × 106個/ml 左右，有部分微載體之間出現(xiàn)細(xì)胞匯合及球連球（圖3）。此時，大部分微載體表面已經(jīng)貼滿 Vero 細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞活率保持在 95% 左右。

圖1　5 L 生物反應(yīng)器中，Vero 細(xì)胞微載體貼壁生長 5 d時的形態(tài)

圖2　微載體上經(jīng)胰酶消化后的 Vero 細(xì)胞

3　討論

細(xì)胞微載體的逐級放大工藝是工藝研究中的重點和難點。近年來我國對 Vero 細(xì)胞微載體放大技術(shù)的研究，主要以胰酶消化放大［3］和球轉(zhuǎn)球放大為主。球轉(zhuǎn)球逐級放大方式依賴于細(xì)胞和微載體的種類［4］。對于 Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)，高活率細(xì)胞從微載體上脫落，形成游離細(xì)胞的可能性極小，細(xì)胞與微載體之間黏附緊密，球與球之間的碰撞接觸往往導(dǎo)致微載體間的黏連，且黏連后的微載體是很難分離的。另外還有細(xì)胞的轉(zhuǎn)移效率低、微載體利用率不高和細(xì)胞生長不同步等問題，使得球轉(zhuǎn)球的放大方式無法滿足大規(guī)模細(xì)胞制備的生產(chǎn)要求。

圖3　50 L 生物反應(yīng)器中，Vero 細(xì)胞微載體貼壁生長 5 d時的形態(tài)

表2　50 L 生物反應(yīng)器中不同批次的細(xì)胞密度（× 105個/ml）

利用胰酶將細(xì)胞從微載體上消化下來，可以獲得大量游離種子細(xì)胞。在漂洗和消化過程中，有約 1/3 的損失。經(jīng)分析，其原因可能有：一是在漂洗過程中，微載體及細(xì)胞經(jīng)攪拌與 PBS 充分混合，微載體上部分細(xì)胞因自身貼壁不牢固，在過程中會脫落或受損；二是在胰酶消化過程中，胰酶長時間作用在細(xì)胞表面，會造成部分細(xì)胞膜受損或破裂，從微載體上提前脫落；三是在液體的排放過程中，因攔截裝置未能有效地阻攔游離懸浮細(xì)胞，造成部分細(xì)胞流失。

在操作過程中存在如下問題：進(jìn)行 PBS 換洗漂洗，因需篩網(wǎng)截流，液體排出速度較慢，時間較長，會損傷細(xì)胞，影響細(xì)胞活率。因細(xì)胞培養(yǎng)液中含有大量血清，經(jīng)換洗后，仍有部分血清殘留，會中和部分胰蛋白酶，影響細(xì)胞消化效果。攔截篩網(wǎng)的過濾效率，會使胰酶作用細(xì)胞時間過長，造成細(xì)胞受損；另細(xì)胞懸浮中會有胰酶殘留，影響細(xì)胞活率和細(xì)胞貼壁能力。

于 50 L 反應(yīng)器中培養(yǎng) 24 h 后，細(xì)胞密度為 4.3 × 105個/ml，較初始接種密度有明顯下降。其原因可能是在進(jìn)行微載體細(xì)胞消化時，因胰酶消化作用時間過長，造成細(xì)胞膜受損、細(xì)胞活率下降、部分細(xì)胞的再貼壁能力下降，從而影響微載體上的可貼壁細(xì)胞數(shù)比初始接種時細(xì)胞數(shù)少。但已貼附在微載體上的細(xì)胞經(jīng)短暫靜置和自我修復(fù)，適當(dāng)延長細(xì)胞生長潛伏期后，即可重新恢復(fù)活率，進(jìn)入細(xì)胞生長對數(shù)期。培養(yǎng) 5 d 后，細(xì)胞密度即可達(dá)到 8.0 × 106個/ml。

本研究實現(xiàn)了 5 L 到 50 L 生物反應(yīng)器的 Vero 細(xì)胞微載體放大培養(yǎng)。也為后續(xù)由 50 L 生物反應(yīng)器到 300 ～500 L 生物反應(yīng)器的 Vero 細(xì)胞微載體放大培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)。采用微載體/生物反應(yīng)器系統(tǒng)高密度培養(yǎng) Vero 細(xì)胞，可以全面替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝，利于提高疫苗質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本。利用微載體/生物反應(yīng)器系統(tǒng)大規(guī)模、高密度培養(yǎng)技術(shù)和高滴度的病毒規(guī)?；囵B(yǎng)工藝，建立疫苗生物反應(yīng)器自動化生產(chǎn)技術(shù)平臺，可用于生產(chǎn)狂犬病疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、輪狀病毒滅活疫苗、風(fēng)疹疫苗、水痘疫苗、乙腦滅活疫苗等多種疫苗產(chǎn)品。

參考文獻(xiàn)

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·協(xié)會之窗·

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.015

通信作者：畢軍，Email：bijun_cn@163.com

收稿日期：2015-12-14