王惠敏，楊燕，田雷瑜，周文龍，王偉

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酵母UDP-葡萄糖合成途徑的優(yōu)化及黃酮葡萄糖苷的合成

王惠敏，楊燕，田雷瑜，周文龍，王偉

【摘要】

目的研究在釀酒酵母細胞內高表達大腸桿菌 UDP-葡萄糖合成途徑的 2 個關鍵酶對工程酵母細胞的葡萄糖苷化反應活性的影響。

方法利用 PCR 方法獲得大腸桿菌磷酸葡萄糖變位酶（PGM）和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（GalU）基因，構建整合型表達載體，轉化酵母；同時共表達具有催化黃酮葡萄糖苷化的 UDP-葡萄糖轉移酶，研究搖瓶培養(yǎng)條件下 PGM 和 GalU 基因的表達對工程細胞生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化的影響。

結果在酵母細胞內表達大腸桿菌 UDP-葡萄糖合成途徑的 2 個關鍵酶 PGM 和 GalU，提高了組合表達 UDP-葡萄糖轉移酶的工程菌生物催化合成野黃芩素-7-O-葡萄糖苷的效率，表明 PGM 和 GalU 基因的高表達能促進 UDP-葡萄糖的合成；所構建的工程菌也能催化木犀草素、柚皮素、白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素 A、黃芩素、槲皮素以及大豆黃酮等黃酮類化合物的葡萄糖苷化。

結論組合表達大腸桿菌 PGM 和 GalU 基因能促進酵母細胞內 UDP-葡萄糖的合成，進而提高了工程細胞催化合成黃酮葡萄糖苷的效率。

【關鍵詞】黃酮類；尿苷二磷酸葡糖；釀酒酵母菌；葡糖磷酸變位酶；葡糖轉移酶類

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術， 2016， 11（3）：229-235

作者單位：100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室/國家衛(wèi)生和計劃生育委員會天然藥物生物合成重點實驗室

黃酮類化合物廣泛存在于自然界，具抗氧化、抗腫瘤、抗炎和免疫調節(jié)等生物活性，在植物體內多以游離或與糖結合成苷的形式存在［1-2］；大多數(shù)在水相中溶解度低，限制其藥物劑型的開發(fā)。目前提高黃酮類化合物溶解度的主要手段是對其糖苷化修飾，其糖苷化修飾研究最多的是葡萄糖苷化反應?；瘜W修飾法需要對黃酮的酚羥基先進行?；Ｗo，然后與活化的糖基供體（如糖基三氯乙酰亞胺酯）進行糖苷化反應，最后再高選擇性地脫去保護基團獲得黃酮糖苷化產物［3］。這種葡萄糖苷化的化學修飾反應步驟復雜，收率低，副產物多，難以進行規(guī)?；糯蠛蜕a，不具有生產實用價值。

微生物轉化法和酶法進行葡萄糖苷化修飾，反應條件溫和，無需進行保護和脫保護反應，立體和區(qū)域選擇性高，可以定向高效地生物催化黃酮苷元的葡萄糖苷化［4-5］。酶促催化需要添加活化的糖基供體 UDP-葡萄糖（uridine diphosphate glucose），由于此前體分子價格較貴，目前該法也僅用于糖基轉移酶的功能鑒定，難以實現(xiàn)反應的放大；而利用僅高表達 UDP-葡萄糖轉移酶的工程菌直接進行生物催化，由于細胞自身合成活化的 UDP-葡萄糖水平較低，導致生物催化合成葡萄糖苷化產物的水平較低。最近，為提高工程細胞生物催化糖苷化反應的效率，研究報道通過調節(jié)胞內的 UDP-葡萄糖生物合成途徑，提高細胞合成 UDP-葡萄糖的水平；同時高表達 UDP-葡萄糖轉移酶，較大幅度地提高了糖苷化產物的合成水平［6-7］。

釀酒酵母作為真核單細胞生物，不僅具有原核生物（如大腸桿菌等）生長快、易培養(yǎng)和易于進行遺傳改造的優(yōu)點，還可以異源高表達 UDP-葡萄糖轉移酶進行葡萄糖苷化修飾［7］。但由于酵母細胞具有較強的葡萄糖苷酶水解活性［8-9］，限制了其進行生物催化合成葡萄糖苷產物的應用；酵母細胞糖苷水解酶對葡萄糖苷修飾的影響已另文報道。本研究以敲除葡萄糖苷酶基因的工程酵母細胞為基礎菌株，進行高表達大腸桿菌的 2 個參與 UDP-葡萄糖合成的關鍵酶，即葡萄糖-6 -磷酸變位酶（phosphoglucomutase，PGM）和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase，GalU），提高細胞內源性 UDP-葡萄糖水平；同時共表達已功能鑒定的黃芩 UDP-葡萄糖轉移酶，研究所構建工程菌具有催化黃酮類化合物葡萄糖苷化生物催化的活性。

1　材料與方法

1.1菌株和質粒

所使用菌株和構建的質粒見表1，其中宿主菌Escherichia coli Trans1-T1 購自北京全式金生物技術有限公司，酵母 W303-1b 為本實驗室保存。

1.2方法

1.2.1表達質粒構建

1.2.1.1含有 PGM 基因表達載體的構建以大腸桿菌的基因組 DNA 為模板，以 GenBank 注冊號 EG12144 的核酸序列為基礎設計合成引物（表2），利用 2 組引物 PGM_1/PGM_4 和PGM_2/PGM_3 進行巢式-PCR（Nested-PCR）擴增，得到長約為 1.6 kb 的 DNA 片段；然后用限制性內切酶 Nde I 和 Nhe I 酶切，再與用相同酶切的質粒 pδGAPh［10］進行 DNA 連接反應，該載體 pδGAPh 含有釀酒酵母三磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter，GAP）啟動子、釀酒酵母 δ 整合位點、釀酒酵母終止子（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）和可利用潮霉素 B（hygromycin B，HygB）進行篩選的 HygB 激酶標記基因，經 CaCl2轉化法轉化大腸桿菌 Trans1-T1，篩選獲得陽性克隆，即得到釀酒酵母整合型表達質粒 pδGAPh-PGM。

表1　本研究使用的菌株和質粒Table 1　Strains and plasmids used in this study

表2　本實驗使用的 PCR 擴增引物Table 2　PCR primers used in this study

1.2.1.2含有 GalU 基因表達載體的構建以GenBank 注冊號 NP_415752 的核酸序列為基礎設計合成 PCR 反應引物，采用與 PGM 基因片段相同的克隆方式，把 PCR 擴增獲得的 DNA 片段與經 Nde I 和 Nhe I 酶切的質粒 pδGAP'z 進行DNA 連接反應；其中質粒 pδGAP'z 是用引物TyR-ZH1/TyR-ZE1 和質粒 pPICZαA 為模板經PCR 擴增得到博來霉素篩選標記基因 sh ble，再置換質粒 pδGAP'g 上的標記基因 kanMX，該質粒載體 pδGAP'z 含有甲醇酵母 GAP 啟動子、釀酒酵母 δ 整合位點、釀酒酵母 PGK1 終止子和可用博來霉素抗性篩選標記基因 sh ble，經 CaCl2轉化法轉化大腸桿菌 Trans1-T1，篩選獲得陽性克隆，即得到釀酒酵母整合型質粒 pδGAP'z-GalU。

1.2.1.3含有 SbGT34 表達載體的構建以含有黃芩 UDP-葡萄糖轉移酶基因的質粒 pTWIN1BUGT34 為模板，用引物 SBUGT_N1/SBUGT_X1 經 PCR 擴增獲得的已完成功能鑒定的黃芩 UDP-葡萄糖基轉移酶基因片段，經 Nde I 和 Xba I 雙酶切并亞克隆到 pδGAPg［10］載體，經 CaCl2轉化法轉化大腸桿菌 Trans1-T1，篩選獲得陽性克隆，即得到 pδGAPg-SbGT34 整合型表達載體。

1.2.2釀酒酵母感受態(tài)細胞制備及 LiAc 轉化方法參照 LiAc 轉化法［11］制備酵母感受態(tài)細胞和DNA 轉化，把轉化體系涂布于含有相應抗生素的YPD 平板上篩選，在 30 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3 d。將獲得的菌株轉接于含高濃度抗生素的篩選平板上進行高拷貝整合陽性克隆復篩。

1.2.3陽性克隆的鑒定目的基因轉化酵母細胞，篩選獲得陽性克隆，然后采用酵母基因組 DNA提取試劑盒提取基因組 DNA。通過 PCR 鑒定確定目的基因是否整合進入宿主的基因組中，最后再以各基因的特異引物對純化的 PCR 擴增片段進行測序驗證。

1.2.4大腸桿菌糖代謝途徑 PGM 和 GalU 基因對工程菌催化黃酮底物轉化率的影響把已構建的表達質粒 pδGAPh-PGM、pδGAP'z-GalU 和pδGAPg-SbGT34 用限制性內切酶 Not I 進行線性化，然后轉化酵母細胞 W303-1b/ES。以獲得的工程菌W303-1b/ES/PeG/SbGT34 為實驗組，工程菌W303-1b/ES/SbGT34 為對照組鑒定 PGM 和GalU基因的表達對工程菌催化黃酮底物轉化率的影響。以野黃芩素為底物鑒定提高 UDP-葡萄糖合成水平的工程菌對黃酮底物糖苷化催化活性的變化，具體做法如下：①挑取單克隆接種于 YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min，培養(yǎng)至 OD600到 3.0 左右。②按 1% 的接種量轉接到 SC 合成液體培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min 培養(yǎng)約 10 h。③用 SC 培養(yǎng)基調節(jié)生物量，使得初始 OD600為 1.0，然后把工程細胞 1 ml 分裝于 5 ml 反應瓶中，每種工程菌3 個平行實驗，每個反應瓶中加入野黃芩素為反應底物，使得野黃芩素的終濃度為 0.2 mmol/L，30 ℃，165 r/min 反應。④分別于反應 3、6、12、24、48、 72、96 h 取出 3 個平行實驗的反應瓶，樣品冷干后用 500 μl 甲醇萃取 3 次。把 3 次甲醇萃取液完全揮干后，再用 1 ml 甲醇溶解萃取物，經 0.22 μm濾膜過濾后進行 HPLC 分析。

1.2.5工程菌對不同黃酮類底物的生物催化利用工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 對不同黃酮類化合物包括木犀草素、柚皮素、白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素 A、野黃芩素、黃芩素、槲皮素以及大豆黃酮等進行生物催化，實驗方法與 1.2.4 相同。

1.2.6黃酮葡萄糖苷化產物的分析和結構鑒定生物催化產物冷干濃縮，用甲醇溶解后直接利用 HPLC 系統(tǒng)進行分析，C18 色譜柱為 Mightysil RP-18 GP（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相 A 和B 為 H2O（0.05% 三氟乙酸）和乙腈，流速為1 ml/min；洗脫梯度為 0 ～ 25 min（10% ～ 35% B）、25 ～ 27 min（35% ～ 100% B）、27 ～ 32 min（100% B）、32 ～ 35 min（100% ～ 10% B）、35 ～ 40 min（10% B）。采用 HPLC-ESI-MS/MS 以負離子掃描模式進行產物的質譜分析。

2　結果

2.1釀酒酵母工程菌的構建

利用限制性內切酶 Not I 線性化處理質粒pδGAPh-PGM 和 pδGAP'z-GalU，然后轉化入基礎工程酵母菌株 W303-1b/ES（E 表示 EXG1 基因敲除，S 表示 SPR1 基因敲除），利用含有潮霉素和博來霉素的 YPD 固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，經篩選獲得的陽性克隆用 YPD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后提取陽性克隆的基因組 DNA，對所整合的 PGM 和GalU 基因進行 PCR 鑒定，結果如圖1A 和 1B所示，陰性對照菌基因組沒有 DNA 擴增條帶，陽性對照質粒和陽性克隆都有預期長度的 DNA 片段擴增，再對獲得的 DNA 片段純化并進行 DNA測序驗證，即獲得工程菌株 W303-1b/ES/PeG（Pe表示表達大腸桿菌 PGM 基因，G 表示表達大腸桿菌 GalU 基因）。

利用限制性內切酶 Not I 線性化質粒pδGAPg-SbGT34，同樣采用 LiAc 轉化法分別轉化釀酒酵母細胞 W303-1b/ES 和 W303-1b/ES/PeG，利用含有 G418 的固體 YPD 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，經篩選獲得的陽性克隆用 YPD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后提取陽性克隆的基因組 DNA，對所整合的SbGT34 基因進行 PCR 鑒定，如圖1C 所示，工程菌株 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 的 3 個陽性克隆和陽性對照質粒均有預期大小的 DNA 片段擴增，陰性對照有一個較小的非特異性 DNA 片段擴增；再對獲得的 DNA 片段純化并進行 DNA 測序驗證，即獲得工程菌株 W303-1b/ES/PeG/SbGT34。采用同樣的酵母轉化方法，篩選獲得對照工程菌株W303-1b/ES/SbGT34。

M：DNA 標準分子量；1：陰性對照；2：陽性對照；3 ～ 5：陽性克隆M： DNA ladder； 1： Negative control； 2： Positive control； 3 - 5： Positively engineered strains圖1　工程酵母基因組整合的目的基因的 PCR 鑒定（A：PGM DNA 片段；B：GalU DNA 片段；C：SbGT34 DNA 片段）Figure 1　PCR verification results of genetically engineered strains with integration of three heterologous genes （A： PGM DNA fragments； B： GalU DNA fragments； C： SbGT34 DNA fragments）

圖2　工程菌 W303-1b/ES/SbGT34 和 W303-1b/ES/PeG/ SbGT34 生物催化合成野黃芩素-7-O-葡萄糖的相對活性比較Figure 2　Differences in the level of scutellarein 7-O-glucoside produced by strains W303-1b/ES/SbGT34 and W303-1b/ES/PeG/SbGT34 over time

圖3　釀酒酵母工程菌株合成野黃芩素-7-O-葡萄糖苷的生物合成途徑Figure 3　Schematic diagram of biosynthetic pathway of scutellarein 7-O-glucoside in engineering Saccharomyces cerevisiae

2.2異源高表達 PGM 和 GalU 基因提高工程菌W303-1b/ES/PeG/SbGT34 的葡萄糖苷反應活性

由于酵母細胞不具有催化黃酮類化合物葡萄糖苷化反應的活性，在酵母細胞直接表達具有催化黃酮葡萄糖苷化的 UDP-葡萄糖轉移酶 SbGT34，以野黃芩素（0.2 mmol）為底物檢測其催化活性，其生物催化合成的野黃芩素-7-O-葡萄糖苷的轉化率約 37%；酵母細胞本身具有葡萄糖苷酶水解活性，能水解糖苷化產物，導致產物的積累水平較低。于是敲除酵母細胞葡萄糖苷水解酶基因，使得野黃芩素的轉化率提高到 76%，該研究結果已經另文發(fā)表。

酵母細胞自身合成的 UDP-葡萄糖參與能量代謝、細胞壁合成等重要的生理活動，在細胞內積累水平較低。本研究通過高表達大腸桿菌的 2 個參與 UDP-葡萄糖合成的關鍵酶 PGM 和 GalU 用來提高工程細胞的 UDP-葡萄糖的合成水平，結果表明這 2 個功能酶的表達使得野黃芩素的轉化率提高到 84%（圖2），間接地證實了 PGM 和 GalU基因的高表達能夠提高細胞內的 UDP-葡萄糖水平。因此，工程細胞內高表達的 2 個異源的 UDP-葡萄糖合成酶（PGM 和 GalU）和 UDP-葡萄糖轉移酶（SbGT34）形成了一個完整的生物催化葡萄糖苷化反應的代謝途徑（圖3）。

2.3代謝產物的結構鑒定

以最適的黃酮化合物-野黃芩素為目標分子詳細地研究了工程酵母細胞生物催化的效率，然后以標準野黃芩素-7-O-葡萄糖苷為參照對其葡萄糖苷化產物進行結構鑒定。反應產物經 HPLC 分析獲得保留時間為 13.4 min 的產物（圖4）。再利用HPLC-ESI-MS/MS 在負離子模式進行掃描，可以獲得母分子離子峰 m/z = 447［M-H］-和糖基斷裂產生的碎片離子 m/z = 285［M-H-162］-（圖5）。

2.4不同黃酮類化合物的葡萄糖苷化

利用工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 對其他黃酮類化合物如木犀草素、柚皮素、白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素 A、野黃芩素、黃芩素、槲皮素以及大豆黃酮等進行了生物催化活性分析，結果表明工程菌體內催化與體外酶促催化結果基本一致，對不同底物的葡萄糖苷化效率不同，其中對野黃芩素催化效率最高（圖6）。

圖4　生物催化產物野黃芩素-7-O-葡萄糖的 HPLC 分析（A：野黃芩素-7-O-葡萄糖苷標準；B：野黃芩素底物；C：工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 催化野黃芩素的反應產物）Figure 4　HPLC analysis of scutellarein 7-O-glucoside biosynthesized through whole-cell biocatalysis （A： Standard scutellarein-7-O-glucoside； B： Standard scutellarein； C： Products of strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 with scutellarein as a substrate）

圖5　生物催化產物野黃芩素-7-O-葡萄糖的質譜分析Figure 5　Scutellarein-7-O-glucoside was detected in negative ionisation mode

圖6　工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 催化不同黃酮葡萄糖苷的合成Figure 6　Biotransformation of flavones into respective glucosides using the engineering strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 as biocatalyst

3　討論

利用生物催化法進行藥物的葡萄糖苷化反應，反應條件溫和，立體和區(qū)域選擇性高，是一個具有巨大潛力的藥物結構修飾技術。目前無論是酶法還是單一表達 UDP-葡萄糖轉移酶的工程菌，生物催化合成葡萄糖苷都受限于 UDP-葡萄糖供體的添加，致使難以規(guī)模化放大。為解決 UDP-葡萄糖供應不足的難題，在大腸桿菌工程菌中進行 UDP-葡萄糖生物合成途徑的調控，提高了細胞內 UDP-葡萄糖合成的水平，進而促進葡萄糖苷化產物的積累［7， 12-13］。盡管在酵母細胞已有文獻報道了 UDP-葡萄糖轉移酶的表達［8， 14-15］，但工程細胞催化合成葡萄糖苷效率較低，其中一個限制因素是細胞自身具有葡萄糖苷酶活性，可逆地水解葡萄糖苷化產物，最終導致工程酵母細胞合成葡萄糖苷的滴度較低［8-9］。另一個潛在的限制因素是酵母細胞合成UDP-葡萄糖的水平較低。研究組已完成了酵母細胞葡萄糖苷酶的基因敲除，使得工程細胞葡萄糖苷的轉化效率有了大幅度提高。本研究目的是探索提高酵母細胞內 UDP-葡萄糖的水平對工程細胞葡萄糖苷反應活性的影響。研究結果表明在酵母細胞內表達大腸桿菌參與 UDP-葡糖合成的 2 個關鍵酶PGM 和 GalU，使得模式分子野黃芩素-7-O-葡萄糖苷的合成效率得到進一步提高，間接地證實在酵母細胞內大腸桿菌 PGM 和 GalU 的表達能促進宿主細胞 UDP-葡萄糖的合成，為利用工程酵母細胞生物催化合成葡萄糖苷類的藥物結構修飾提供了理論和實踐借鑒。

所構建的工程菌 W303-1b/ES/PeG/SbGT34 不僅可以催化野黃芩素發(fā)生葡萄糖苷化反應，也對其他黃酮類化合物具有較高的催化活性。工程細胞催化的這些黃酮類化合物如白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素 A、野黃芩素、黃芩素和大豆黃酮僅合成單一的葡萄糖苷；而催化柚皮素體系產生了 2 個葡萄糖苷產物；黃酮分子母核含有 3-羥基或 3'，4'-二羥基的槲皮素和木犀草素則被催化產生 3 個和 4 個葡萄糖苷產物，這些葡萄糖苷化合物結果還需要進一步鑒定。

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www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（3）：229-235

Optimization of biosynthetic pathway of uridine diphosphate glucose in yeast for production of flavonoid glucosides

WANG Hui-min， YANG Yan， TIAN Lei-yu， ZHOU Wen-long， WANG Wei

【Abstract】

ObjectiveTo investigate the effect of expression of phosphoglucomutase and UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase ［two key enzymes in the pathway of synthesizing uracil diphosphate glucose （UDP-glucose）］ from Escherichia coli on glucosylation capacity of engineering yeast.

MethodsIn order to up-regulate the biosynthetic pathway of UDP-glucose of Saccharomyces cerevisiae， the two genes encoding phosphoglucomutase （PGM） and UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase （GalU） of E. coli were amplified by PCR and then inserted into the yeast integration vectors. The resulting plasmids were linearized by restriction enzyme Not I and transformed into the engineering strain. The integration expression plasmid pδGAPg-SbGT34 with a UDP-glucose flavonoid glucosyltransferase gene cloned from Scutellaria baicalensis Georgi was also constructed and further integrated into the basic engineering strain W303-1b/ES/PeG. The effect of high expression of PGM and GalU on production of flavonoid glucosides was investigated using the engineered strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 as whole-cell biocatalyst under the flask culture condition.

ResultsThe engineering strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 with the high expression of PGM and GalU genes involving the biosynthesis of UDP-glucose together with the glucosyltransferase was successfully constructed. Its production of scutellarein 7-O-glucoside was further improved in comparison with that of strain W303-1b/ES/SbGT34. It is indicated that the expression of heterologous PGM and GalU genes of E. coli contributes to the synthesis of endogenous UDP-glucose of engineering strain. The resulting strain W303-1b/ES/PeG/SbGT34 also glucosylated the flavonoids such as luteolin， naringenin， chrysin， wogonin， orohylin A， baicalein， quercetin and daidzein.

ConclusionThe synthesis of endogenous UDP-glucose of yeast was boosted through the co-expression of PGM and GalU genes isolated from E. coli， which improves the glycosylation capacity of the engineered strain along with expression of a UDP-glucose falvonoid glucosyltransferase.

【Key words】Flavores；Uridine diphosphate glucose；Saccharomyces cerevisiae；Phosphoglucomutase；Glucosyltransferase Author Affiliation: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of National Health and Family Planning Commission， Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， 100050 Beijing， China

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.006

基金項目：國家自然科學基金（81072562）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301002）

通信作者：王偉，Email：wwang@imm.ac.cn

收稿日期：2016-04-05

Corresponding Author:WANG Wei， Email： wwang@imm.ac.cn