李齊激　南　瑩　楊　艷　王道平　楊小生

貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州　貴陽　550002

?

HPLC法測定藥食兩用植物刺梨中刺梨苷的含量

李齊激南瑩楊艷王道平楊小生

貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室，貴州貴陽550002

【摘要】目的：建立藥食兩用植物刺梨中刺梨苷的含量測定方法。方法：刺梨以75%乙醇水浴回流提取，采用Pntulips TM BP-C18(4.6 mm×250mm，5 μm)色譜柱，乙腈-0.05 %三氟醋酸溶液(27∶73)為流動相，流速1 ml/min，檢測波長208 nm，柱溫30℃，進樣量為10μl。結(jié)果：刺梨苷在0.23～2.3μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為97.82 %，RSD為2.44 %(n=6)。結(jié)論：利用HPLC建立了藥食兩用植物刺梨中刺梨苷的含量測定方法，經(jīng)方法學驗證，該法簡便、準確、穩(wěn)定，為藥食兩用植物刺梨的合理開發(fā)利用提供質(zhì)量評價依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】刺梨；刺梨苷；HPLC

刺梨為薔薇科植物繅絲花RoseroxburghiiTratt的果實，廣泛分布于暖溫帶及亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布在四川、云南和貴州三省，其中又以貴州野生與栽培資源最為豐富[1-2]。刺梨具有消食健脾，收斂止瀉的功效，主要用于治療積食腹脹，泄瀉等疾病[3]。研究表明，三萜和黃酮類成分為刺梨的主要活性物質(zhì)，并在增強免疫力、延緩衰老、抗動脈粥樣硬化、健胃消食等方面均具有較好的活性[4-6]。作為藥食兩用植物，1994版、2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》和2004年衛(wèi)生部食品新資源品種17號公告先后收錄該品種，目前在食品、保健用品、醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。但其質(zhì)量控制方法仍處于空白，尤其是在醫(yī)藥、保健用品應(yīng)用領(lǐng)域。課題組結(jié)合前期研究發(fā)現(xiàn)的活性三萜類成分[7]，選擇其中較具有代表性的活性三萜—刺梨苷進行含量測定，旨在建立藥食兩用植物刺梨的質(zhì)量控制方法，為該植物藥材及其產(chǎn)品開發(fā)提供品質(zhì)評價與檢測方法參考。

1儀器與材料

1.1儀器Agilent 1100高效液相色譜(含柱溫箱、可見-紫外檢測器、四元泵、在線脫氣機和自動進樣器，美國安捷倫科技有限公司)；電子天平(Mettler Toledo，26115102-0)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；ZK-82A 型真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2材料刺梨苷對照品為實驗室自制，經(jīng)NMR、MS等光譜數(shù)據(jù)確定其化學結(jié)構(gòu)，通過HPLC純度檢測為98.91%；乙腈為色譜純(天津市科密歐化學試劑有限公司)，三氟醋酸為分析純(天津市光復(fù)精細化工研究所)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3藥材刺梨藥材于2014年8月采自貴州龍里縣，經(jīng)貴州大學安華明教授教授鑒定為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghii Tratt的果實(刺梨)，標本憑證(201408003)保存于貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱：Pntulips TM BP-C18(4.6 mm×250mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.05 %三氟醋酸溶液(27∶73)；柱溫：25 ℃；流速：1 ml/min；檢測波長：208 nm；進樣量：10μl。在此色譜條件下，理論板數(shù)按刺梨苷峰計算≥3 000，與其他峰分離度>1.5。色譜圖詳見圖1。

2.2對照品溶液的配置取刺梨苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.23 mg的溶液，即得。

2.3供試品溶液的配置取刺梨粗粉(過三號篩)約5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加75 %乙醇100 ml，水浴回流提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮近干，加適量蒸餾水溶解，再用乙酸乙酯萃取至無色，合并乙酸乙酯萃取層，減壓濃縮近干，立即加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至至100 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密吸取2.2項下對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μl，分別注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X，mg)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=270.71X+9.7049，R2=0.9998。結(jié)果表明，刺梨苷在0.23～2.3μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5精密度考察精密吸取“2.2”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD為1.38 % (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗稱取同一批次(20150801)刺梨樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD為1.91 %(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性考察取同一批次(20150801)刺梨供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h時按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定。結(jié)果峰面積RSD為2.61 %(n=6)，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率試驗稱取已知含量的刺梨樣品(20150801)6份，每份約2.5 g，分別加入刺梨苷4.4 mg，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，計算回收率，測定結(jié)果見表1。

表1　回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.9樣品測定取不同批次刺梨樣品約5g，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液各2份，再按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算樣品中刺梨苷的含量，結(jié)果3批樣品(20150801、20150802、2015080)中刺梨苷的含量分別為0.176、0.180、0.183 mg/g。

3討論

3.1檢測指標的選擇刺梨總?cè)茷樵撝参锏闹饕钚猿煞?，在惡性腫瘤、糖尿病方面效果較好，具有較高的應(yīng)用價值和良好的應(yīng)用前景[7-9]。試驗綜合考察了其中3種活性三萜刺梨苷、野薔薇苷、arjunetin的色譜條件、含量高低和代表性，最終選擇了分離度較好，含量較高，且尤具代表性的刺梨苷作為質(zhì)量控制的檢測指標。

3.2提取條件的考察通過比較超聲、索氏回流、冷浸及水浴回流提取，結(jié)果刺梨苷含量高低依次為水浴回流>索氏回流>冷浸>超聲。其次，還比較了甲醇、乙醇、水作為溶劑的提取效果，結(jié)果三者提取含量變化較小，水提取含量稍高但雜質(zhì)峰較多，且分離度較差，考慮到經(jīng)濟、環(huán)保，確定選擇以乙醇為溶劑，最終通過單因素考察最終確定以75%乙醇進行提取。最后，還比較了乙酸乙酯萃取次數(shù)對含量的影響，發(fā)現(xiàn)以水-乙酸乙酯體積比為1∶2時重復(fù)萃取3次可萃取完全。

參考文獻

[1]中國植物志編輯委員會.中國植物志(37卷)[M].北京:科學出版社,1998:452.

[2]貴州植物志編輯委員會.貴州植物志(7卷)[M].貴陽:貴州人民出版社,1982:223.

[3]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準[M].貴陽:貴州科學技術(shù)出版社,2003：230

[4]戴支凱,余麗梅,楊小生,等.刺梨三萜化合物CL1體外抗人子宮內(nèi)膜腺癌作用[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(7):1656-1658.

[5]秦晶晶,李齊激,薛琰,等.刺梨總?cè)铺崛》椒捌洇?葡萄糖苷酶抑制活性研究[J].食品工業(yè)科技,2014,10(33):186-189.

[6]趙轉(zhuǎn)地,張愛華,洪峰.刺梨及其產(chǎn)品的營養(yǎng)及保健藥用價值研究進展[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學,2007,24(1):82-84.

[7]楊小生,馬琳,梁冰,等.刺梨果活性提取物及其制備方法、檢測方法和應(yīng)用[P].中國專利:ZL201110080922,2013-03-20.

[8]南瑩,李齊激,馬琳,等.紫外分光光度法測定刺梨總?cè)婆c總黃酮含量[J].遵義醫(yī)學院學報,2012,35(6):473-476.

[9]秦晶晶,李齊激,薛琰,等.刺梨總?cè)铺崛》椒捌洇?葡萄糖苷酶抑制活性研究[J].食品工業(yè)科技,2014,10(33):186-189.

Determination of kaiiichigeside F1 from the medical and edible plants of Rose roxburghii by HPLC

LI QijiNAN YinYANG YanWANG DaopinYANG Xiaosheng

Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002, China

Abstract:Objective To establish a HPLC method for determining kaiiichigeside F1 in the medical and edible plants of Rose roxburghii by HPLC. Methods The assay of 75% ethanol extract of Rose roxburghii was detected on PntulipsTM BP-C18 (4.6 mm×250mm, 5 μm) column with acetonitrile-0.05% Trifluoroacetic acid as mobile phase at flow rate of 1 ml·min-1. The detection wavelength was set at 208 nm, the volume was 10 μl and the column temperature was 30℃. Results The linear ranges of kaiiichigeside F1 was 0.23～2.3μg. Their average recovery was 97.82 % (RSD=2.44 %, n=6). Conclusion The determination of kaiiichigeside F1 from the medical and edible plants of Rose roxburghii was firstly established by HPLC. The method was convenient, accurate, and stable, and can be used to evaluate the quality of Rose roxburghii.

Key words:Rose roxburghii; kaiiichigeside F1; HPLC

基金項目：貴州省科技重大專項([2013]6006-4)；貴州省科技農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(NY[2015]3005-1)；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊建設(shè)項目(2013-4006)；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)計劃(2015-4027)。

作者簡介：李齊激，助理研究員，主要從事民族藥質(zhì)量標準及創(chuàng)新藥物研究。E-mail:leeqiji@163.com

【中圖分類號】R284.1

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)09-0022-03

(收稿日期：2016.03.21)