劉冠花，王金清，邱宜農(nóng)

［1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院口腔科，甘肅蘭州730050；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所（固體潤(rùn)滑國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），甘肅蘭州730000］

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鈦合金表面納米氧化鋅薄膜的體外細(xì)胞毒性研究*

劉冠花1，王金清2，邱宜農(nóng)1

［1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院口腔科，甘肅蘭州730050；2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所（固體潤(rùn)滑國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），甘肅蘭州730000］

摘要：目的評(píng)價(jià)鈦合金表面納米氧化鋅薄膜對(duì)細(xì)胞毒性的作用。方法觀察小鼠胚胎成纖維L-929細(xì)胞在含納米氧化鋅薄膜的鈦合金析出液中的生長(zhǎng)情況，采用噻唑藍(lán)比色法測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度值，并計(jì)算出相對(duì)的細(xì)胞增殖率，進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)。結(jié)果各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞形態(tài)無(wú)異常，增值率＞80%，細(xì)胞毒性等級(jí)為1級(jí)。結(jié)論鈦合金表面納米氧化鋅薄膜對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)毒害作用。

關(guān)鍵詞：鈦合金；納米氧化鋅；細(xì)胞毒性；噻唑藍(lán)比色法；生物相容性

種植技術(shù)是修復(fù)牙列缺損、缺失的重要方法，在臨床上應(yīng)用越來(lái)越廣泛。種植體周圍炎是種植修復(fù)的主要并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致種植失敗的主要原因［1］，源于種植體基臺(tái)與牙齦袖口間的細(xì)菌感染。減少基臺(tái)周圍細(xì)菌定植及繁殖成為防治種植體周圍炎的關(guān)鍵。種植體基臺(tái)的主要材料為鈦或鈦合金，其本身不具有抗菌性。前期筆者通過(guò)溶膠-凝膠法在種植體基臺(tái)表面構(gòu)建一層納米氧化鋅抗菌膜［2］，起到良好的抗菌殺菌作用。本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)納米氧化鋅涂層對(duì)細(xì)胞的毒性作用。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

小鼠胚胎成纖維L-929細(xì)胞，由中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)提供，達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）及小牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，雙抗噻唑藍(lán)（美國(guó)Amresco公司），二甲基亞砜（Dimethylsulphoxide，DMSO）（美國(guó)Amresco公司），0.25%胰酶消化液。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（瑞士Tecan公司），生物安全柜（HFsafe-1200，上海力申科學(xué)儀器有限公司），氣體培養(yǎng)箱（HF160W，上海力申科學(xué)儀器有限公司），Olympus IX-71倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Coster公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1浸提液的制備參照試件表面積與浸提介質(zhì)體積之比為0.5～6.0 cm2/ml，按1.0 cm2/ml的浸提比例將高溫高壓消毒后的實(shí)驗(yàn)組鈦片（表面含納米氧化鋅涂層）和陰性對(duì)照組鈦片（表面不含涂層）分別浸泡在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24 h后制成各組材料的浸提液，放入4℃冰箱保存［3］。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛的L-929細(xì)胞傳代48h，制成1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液，分注于3個(gè)96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，每一板設(shè)3組（實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組），每一組接種8孔，置于培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳CO2）培養(yǎng)。24 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入100μl的含納米氧化鋅涂層的鈦片浸提液，陰性對(duì)照組每孔分別加入100μl不含涂層的鈦片浸提液，空白對(duì)照組每孔分別加入100μl新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)觀察及噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)3個(gè)96孔板分別培養(yǎng)24、48和72 h后終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前均在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化和生長(zhǎng)狀況并攝影，然后每孔加入5 g/L噻唑藍(lán)溶液20μl，繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，吸棄原液，每孔加入DMSO 150μl，置于振蕩器上振蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔的吸光度值（A490）。

1.2.4細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)細(xì)胞相對(duì)增殖率（the relative growth rate，RGR）的計(jì)算公式［4］：RGR=實(shí)驗(yàn)組A值/陰性對(duì)照組A值/空白對(duì)照組A值。美國(guó)藥典中細(xì)胞相對(duì)增殖率與細(xì)胞毒性分級(jí)如下［5］：0級(jí)為RGR≥100%；1級(jí)為RGR 80%～100%；2級(jí)為RGR 50%～80%；3級(jí)RGR為30%～50%；4級(jí)為RGR 0%～30%。當(dāng)RGR≥80%，即毒性級(jí)別≤1級(jí)時(shí)，樣品對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)毒害作用；反之，對(duì)細(xì)胞的增殖有毒害作用。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組吸光度值（A值）用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，每個(gè)時(shí)間段各組組間比較及各組3個(gè)時(shí)間點(diǎn)A值比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)細(xì)胞毒性計(jì)算公式和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)直接計(jì)算并評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞的毒性。

2　結(jié)果

2.1培養(yǎng)72 h細(xì)胞形態(tài)

可見(jiàn)各組細(xì)胞形態(tài)基本相似，呈梭性或多角形，部分圓形細(xì)胞的細(xì)胞核處于分裂期，表明細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。見(jiàn)圖1。

2.2各組A值與細(xì)胞毒性

2.2.1各組同一時(shí)間A值比較分別培養(yǎng)24、48、72 h后，各組間A值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為0.211、8.089和1.509，P值分別為0.811、0.067和0.244）（見(jiàn)表1），提示每個(gè)時(shí)間段各組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2各組3個(gè)時(shí)間段A值比較實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組3個(gè)時(shí)間段的A值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別380.171、625.354 和194.550，P值分別為0.000、0.000和0.002）。各組3個(gè)時(shí)間段的A值均呈線性關(guān)系（P=0.002），各組A值均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。見(jiàn)表1。

圖1　各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h形態(tài)圖（×100）

表1　各組3個(gè)時(shí)間段的A值（n=8，±s）

表1　各組3個(gè)時(shí)間段的A值（n=8，±s）

組別　24 h　48 h　72 h實(shí)驗(yàn)組　0.181±0.045　 0.409±0.065　 0.882±0.102陰性對(duì)照組　0.195±0.080　 0.428±0.075　 0.837±0.073空白對(duì)照組　0.201±0.106　 0.470±0.083　 0.934±0.111

2.2.3細(xì)胞增殖率和細(xì)胞毒性級(jí)別比較細(xì)胞的相對(duì)增殖率均＞80%，細(xì)胞毒性級(jí)別是1級(jí)（見(jiàn)表2），表明細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有受到抑制，鈦片表面納米氧化鋅涂層具有良好的細(xì)胞相容性。

表2　各組材料的細(xì)胞相對(duì)增殖率和細(xì)胞毒性級(jí)別

3　討論

氧化鋅是一種無(wú)機(jī)抗菌劑，作為添加成分主要應(yīng)用于皮膚科外用藥、日用化妝品、水消毒及紡織品防腐等方面［6-7］。納米氧化鋅與細(xì)菌微生物產(chǎn)生更廣泛的接觸面積［8］，其抗菌性能遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)的氧化鋅殺菌劑［9］，具有安全性高、效力持久和不易耐藥的特點(diǎn)［10］。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)是口腔新型材料生物相容性研究中重要的檢測(cè)指標(biāo)之一。噻唑藍(lán)比色法是一種檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)存活的方法，酶聯(lián)免疫比色分析法測(cè)定的吸光度值的大小可反映存活細(xì)胞數(shù)量的多少及細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱，因而吸光度值降低程度即可反映材料析出液的細(xì)胞毒性大?。?1-12］，由于該法簡(jiǎn)便、靈敏、結(jié)果客觀且重復(fù)性好，廣泛用于細(xì)胞毒性檢測(cè)。

本研究結(jié)果顯示納米氧化鋅薄膜組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可見(jiàn)圓形分裂期細(xì)胞，細(xì)胞增殖率＞80%，細(xì)胞毒性是1級(jí)，對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)毒害作用，利于細(xì)胞分化及功能表達(dá)，達(dá)到良好的鈦合金-組織界面［13］。但畢竟體外實(shí)驗(yàn)條件與真實(shí)人體口腔環(huán)境有較大差異，納米氧化鋅涂層能否應(yīng)用于臨床，還需要進(jìn)一步的生物學(xué)和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

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（申海菊 編輯）

In vitro cytotoxicity study of nano-ZnO thin film on surface of titanium alloy*

Guan-hua Liu1，Jin-qing Wang2，Yi-nong Qiu1
［1. Department of Stomatology，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of PLA，Lanzhou，Gansu 730050，China；2. Lanzhou Institute of Chemical Physics （State Key Laboratory of Solid Lubrication），Chinese Academy of Sciences，Lanzhou，Gansu 730000，China］

Abstract:Objective To evaluate the cytotoxicity of nano-ZnO thin film on titanium alloy. Methods The growth of L-929 cells in the culture solutions consisting of the ions released from nano-ZnO thin film on the surface of titanium alloy was observed. And the absorbance values of the cells were tested by MTT method. The relative growth rate of L-929 cells was calculated and the cytotoxicity of nano-ZnO thin film on the surface of titanium alloy was evaluated. Results The relative growth rate of each L-929 cell group was above 80%and the cytotoxicity grade was grade 1. Conclusions Nano-ZnO thin film on the surface of titanium alloy has almost no cytotoxicity.

Keywords:titanium alloy；nano-ZnO；cytotoxicity；MTT method；biocompatibility

中圖分類號(hào)：R783.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.07.001

文章編號(hào)：1005-8982（2016）07-0001-03

收稿日期：2015-10-30

*基金項(xiàng)目：中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所固體潤(rùn)滑國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（No：LSL-1309）

［通信作者］邱宜農(nóng)，E-mail：yinongqiu@hotmail.com；Tel：0931-899469