郭滿(mǎn)，陳進(jìn)宏，張浩，李偉漢

（1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院，河南南陽(yáng)473000；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海200040）

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膽寧片對(duì)膽汁骨橋蛋白的影響

郭滿(mǎn)1，陳進(jìn)宏2，張浩1，李偉漢1

（1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院，河南南陽(yáng)473000；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海200040）

摘要：目的探討中藥膽寧片對(duì)膽固醇結(jié)石形成的預(yù)防作用及機(jī)制。方法建立骨橋蛋白（OPN）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）快速檢測(cè)法，分別檢測(cè)正常人群、膽固醇以及膽色素結(jié)石患者血清及膽汁中的OPN濃度。另取60例術(shù)后診斷為膽固醇結(jié)石患者按隨機(jī)序貫原則等分為膽寧片治療組、熊去氧膽酸治療組及對(duì)照組。觀(guān)察膽寧片對(duì)患者膽汁OPN濃度的影響。結(jié)果膽固醇結(jié)石患者血清及膽汁中OPN濃度低于正常人群以及膽色素結(jié)石患者（P＜0.05）；膽寧片治療2周后，膽固醇結(jié)石患者血清及膽汁中OPN濃度明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論膽寧片能提高血清和膽汁中抑成核因子OPN的濃度，進(jìn)而降低患者罹患膽固醇結(jié)石的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：膽寧片；酶聯(lián)免疫吸附；骨橋蛋白

膽汁中膽固醇成核是結(jié)石形成的始要環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)膽汁中存在促/抑成核因子的動(dòng)態(tài)平衡，一旦平衡被打破將導(dǎo)致膽汁中膽固醇析出、結(jié)晶進(jìn)而形成結(jié)石［1］。本課題組從前期研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）具有抑制膽固醇成核的作用。作者進(jìn)一步觀(guān)察中藥膽寧片對(duì)膽汁抑成核因子OPN濃度的影響，探討其預(yù)防膽固醇結(jié)石形成的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

膽寧片產(chǎn)自上海中藥一廠(chǎng)，熊去氧膽酸片產(chǎn)自上海信誼制藥總廠(chǎng)，OPN酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，辣根過(guò)氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，96孔酶標(biāo)板及酶標(biāo)儀購(gòu)自上海華美公司。

1.2方法

1.2.1建立OPN ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)采用倍比稀釋法將包被液純化的OPN抗體依次加到酶標(biāo)板中，每孔100μl，37℃包被2 h后，用2%牛血清白蛋白37℃封閉2 h后拍凈。將系列稀釋度OPN標(biāo)準(zhǔn)品依次加入酶標(biāo)板孔，每孔100μl，45℃反應(yīng)1h后拍凈。接著每孔加入HRP 100μl（1∶40稀釋?zhuān)?7℃反應(yīng)1 h后每孔加入新鮮酶標(biāo)底物液100μl，37℃下置暗處15 min，加終止液，取450 nm波長(zhǎng)濾光片，于酶標(biāo)儀上讀取每孔光密度值（optical density，OD），建立OPN濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，推導(dǎo)曲線(xiàn)方程。

1.2.2膽石組與正常人群組血清及膽汁OPN含量檢測(cè)膽固醇結(jié)石、膽色素結(jié)石和正常人群組各10例，采集血清及術(shù)中膽管內(nèi)膽汁各2 ml。膽石癥患者膽汁在肝膽系結(jié)石手術(shù)時(shí)抽取，正常人群組血清及膽汁標(biāo)本來(lái)自于腹部外傷行剖腹探查術(shù)患者。本研究中所有標(biāo)本采集均獲得患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)授權(quán)。膽汁標(biāo)本按照Strasberg所述的方法［2］，分裝于無(wú)菌管中，4℃、15 000 g離心15 min，去除雜質(zhì)，加入膽汁保存液（0.05%氯霉素、3 mmol/L疊氮鈉、1 mmol/L亮抑酶肽和5 mmol/L依地酸鈉）置于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。血清及膽汁中OPN濃度采用已建立的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組60例膽固醇結(jié)石患者按照隨機(jī)序貫原則分為3組。入選病例為本院2012年6月-2014年6月行膽囊切除并膽管探查術(shù)患者，術(shù)后均帶T管。膽固醇結(jié)石分類(lèi)按肉眼觀(guān)察及傅氏法。膽寧片治療組口服膽寧片5片/次，3次/d；熊去氧膽酸片治療組口服熊去氧膽酸片50 mg/次，2次/d；對(duì)照組除采用前兩組術(shù)后常規(guī)治療外不附加其他任何治療。前兩組患者術(shù)后第2天起開(kāi)始服用藥物，共計(jì)2周時(shí)間，分別于術(shù)后1、3、7和14 d采取膽汁和血清，用以上方法測(cè)定OPN濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)分析用單因素方差分析（組間比較用LSD法）及重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1OPN濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

ELISA法得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白系列稀釋吸光度，建立曲線(xiàn)方程：Y=0.037X（Y：吸光度；X：OPN濃度mg/mL，相關(guān)系數(shù)r=0.99）。

2.2ELISA法檢測(cè)膽石癥及正常人群組血清和膽汁中OPN濃度

膽固醇結(jié)石組、膽色素結(jié)石組和正常人群組血清OPN濃度依次為（41.30±6.46）、（47.50±4.79）和（47.81±7.27）ng/ml，方差齊性檢測(cè)表明方差齊（P= 0.890），單因素方差分析結(jié)果表明組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011）。其中膽固醇結(jié)石組患者血清OPN濃度低于膽色素結(jié)石組和正常人群組（P= 0.003）；而膽色素結(jié)石組和正常人群組OPN濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.656）。3組患者膽汁檢測(cè)結(jié)果與之相似。見(jiàn)表1。

2.3藥物對(duì)膽固醇結(jié)石患者OPN濃度的影響

重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，3組患者血清和膽汁中OPN濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.013和0.010）。膽寧片組與對(duì)照組血清和膽汁中OPN濃度組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003和0.004）；而熊去氧膽酸組與對(duì)照組血清和膽汁中OPN濃度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.570和0.659）。膽寧片組血清和膽汁中OPN濃度隨著治療時(shí)間的推移而逐漸升高，時(shí)間越長(zhǎng)，上升越明顯，自服藥第7天開(kāi)始，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009和0.007）。見(jiàn)表2、3。

表1　3組OPN濃度比較（n=10，ng/ml，±s）

表1　3組OPN濃度比較（n=10，ng/ml，±s）

注：1）與正常人群組比較，P=0.003；2）與正常人群組比較，P= 0.656

組別膽固醇結(jié)石組膽色素結(jié)石組正常人群組血清　　膽汁41.30±6.461）　67.30±9.482）47.50±4.79　79.42±8.71 47.81±7.27　82.20±10.27

表2　膽寧片對(duì)血清OPN濃度的影響（n=20，ng/ml，±s）

表2　膽寧片對(duì)血清OPN濃度的影響（n=20，ng/ml，±s）

注：1）與第1天比較，P=0.009；2）與第1天比較，P=0.004

組別　　第1天　　第3天　　第7天　　第14天膽寧片組　42.50±7.12 43.18±8.03 46.35±7.531）51.26±6.932）熊去氧膽酸組　41.81±6.65 42.17±6.35 41.57±8.72 42.03±8.52對(duì)照組　40.95±7.83 42.05±8.43 41.87±5.85 41.87±7.75

表3　膽寧片對(duì)膽汁OPN濃度的影響（n=20，ng/ml，±s）

表3　膽寧片對(duì)膽汁OPN濃度的影響（n=20，ng/ml，±s）

注：1）與第1天比較，P=0.007；2）與第1天比較，P=0.002

組別　　第1天　　第3天　　第7天　　第14天膽寧片組　68.37±8.32 72.13±7.75 79.65±9.131）83.50±8.432）熊去氧膽酸組　71.01±7.85 72.67±8.27 70.87±7.82 73.15±7.76對(duì)照組　69.75±9.21 71.93±6.49 73.01±6.75 71.80±10.25

3　討論

膽石癥是造成膽道系統(tǒng)急危重癥的重要原因。近年來(lái)，由于生活方式的改變，我國(guó)膽石癥的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，且多為膽固醇性結(jié)石［3］，因此研究膽固醇結(jié)石成石機(jī)制，有效預(yù)防和治療膽固醇結(jié)石具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。已有研究表明，膽固醇結(jié)石的形成與膽汁促/抑成核平衡體系失調(diào)、膽道動(dòng)力學(xué)功能紊亂等因素有關(guān)。其中膽汁促/抑成核平衡體系失調(diào)造成膽固醇異常成核是結(jié)石形成的關(guān)鍵步驟［4］。關(guān)于膽汁中促/抑成核因子的研究，現(xiàn)已取得大量的成果。其中促成核因子黏蛋白、α1-酸性糖蛋白、抑成核因子載脂蛋白A1等都已得到學(xué)界公認(rèn)［5-8］。本課題組前期研究中作者觀(guān)察到，OPN能抑制膽固醇結(jié)晶形成，延緩膽固醇結(jié)晶出現(xiàn)，并且抑制由鈣離子誘導(dǎo)的膽固醇促成核效應(yīng)，使膽固醇/磷脂泡更加穩(wěn)定，抑制磷脂泡的動(dòng)態(tài)變化及膽固醇析出，從而降低膽固醇結(jié)石的發(fā)生［9］。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)OPN參與膽囊膽固醇結(jié)石形成的整個(gè)過(guò)程，與其他促成核因子具有拮抗作用［10］。本研究中作者發(fā)現(xiàn)，膽固醇結(jié)石患者血清及膽汁中OPN濃度明顯低于正常人群，且經(jīng)抗膽結(jié)石藥物膽寧片治療后膽固醇結(jié)石患者血清及膽汁中OPN濃度明顯升高，該結(jié)果與筆者前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPN的抑成核作用相吻合。

膽寧片是由大黃、虎杖、青陳皮等制成的純中藥制劑，具有消炎、利膽、防石、溶石、抗肝臟脂肪變性、改善結(jié)石患者膽囊切除術(shù)后不適癥狀等功能［11-12］。研究表明，膽寧片不僅可以提高膽汁中膽鹽、磷脂的濃度，促進(jìn)膽固醇溶解，降低膽汁游離膽紅素濃度，改善膽汁成石熱力學(xué)平衡紊亂［13］；同時(shí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)膽寧片還可以上調(diào)鈉離子-牛磺膽酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白3、多藥耐藥蛋白2、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶A1和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1的表達(dá)，有效改善膽汁瘀積，減輕肝膽系病理?yè)p害［14］。此外還有研究表明膽寧片可以降低和改變膽汁中33.5 kD泡蛋白等促成核因子含量和結(jié)構(gòu)，從而降低膽汁成核趨勢(shì)［15］。本研究中作者發(fā)現(xiàn)膽寧片可以提高膽石癥患者血清及膽汁中抑成核因子OPN的濃度，從而起到溶石和防石的作用。由此認(rèn)為，膽寧片是一種針對(duì)膽結(jié)石形成過(guò)程的多靶點(diǎn)、多作用機(jī)制的有效純中藥制劑。

膽汁中OPN來(lái)源目前仍不十分明確。Imano等［16］研究發(fā)現(xiàn)，OPN在肝內(nèi)結(jié)石患者的肝內(nèi)膽管、腺體及結(jié)石中都有較強(qiáng)表達(dá)。Ichikawa等［17］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)石患者的膽囊壁有較強(qiáng)的OPN表達(dá)，也有較多高表達(dá)OPN的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。本課題組前期研究中作者發(fā)現(xiàn)［18］，膽囊結(jié)石患者的膽囊上皮細(xì)胞發(fā)生變性，而纖維化或萎縮的上皮細(xì)胞表達(dá)更多的OPN和整合素，且膽囊結(jié)石患者血清OPN濃度較正常人低，膽汁中OPN和鈣離子濃度降低。由此筆者認(rèn)為，膽固醇結(jié)石患者體內(nèi)OPN可能來(lái)源于肝臟、膽囊上皮細(xì)胞的分泌等途徑。膽寧片提高患者體內(nèi)OPN濃度，初步推測(cè)可能與其促進(jìn)膽系上皮細(xì)胞OPN合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及酶類(lèi)活性等相關(guān)，其確切的機(jī)制仍有待更深入的研究。

本研究中作者發(fā)現(xiàn)3組受試者血清與膽汁中OPN濃度結(jié)果一致：即膽固醇結(jié)石患者血清及膽汁中OPN濃度明顯低于正常人群和膽色素結(jié)石患者。由此筆者設(shè)想通過(guò)ELISA法檢測(cè)血清中OPN濃度，以幫助篩選易罹患膽固醇結(jié)石的高危人群，或?yàn)槿苁戭?lèi)藥物的臨床療效評(píng)判提供參考依據(jù)，但該設(shè)想的可靠性和有效性以及OPN濃度界定位點(diǎn)等仍有待于進(jìn)一步研究。

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（申海菊 編輯）

Effect of Danning tablets on osteopontin in bile

Man Guo1，Jin-hong Chen2，Hao Zhang1，Wei-han Li1
（1. Nanyang Central Hospital，Nanyang，Henan 473000，China；2. Huashan Hospital of Fudan University，Shanghai 200040，China）

Abstract:Objective To investigate the mechanism of Danning tablets in the prevention of cholesterol lithogenesis. Methods A rapid method for detection of anti-nucleating factor osteopontin（OPN）was established. OPN concentrations were detected in serum and bile of the normal group，cholesterol-gallstone group and pigmental-gallstone group. Another group of cholesterol-gallstone patients（n= 60）were randomly divided into Danning group，sodium cholate group and control group；and the changes of OPN in serum and bile were observed using ELISA kits. Results The concentrations of OPN in serum and bile in the cholesterol-gallstone patients were significantly higher than those in the pigmental-gallstone and normal groups（P ＜0.05）. After treatment with Danning tablets for 2 weeks，the serum and bile OPN concentrations significantly increased in the cholesterol-gallstone patients（P ＜0.05）；but this increase was not found in the other two groups. Conclusions Danning tablets can raise the concentrations of anti-nucleating factor OPN in serum and bile，thereby reduce the risk of cholesterol gallstone formation.

Keyword:Danning tablet；enzyme-linked immunosorbent assay；osteopontin

中圖分類(lèi)號(hào)：R285；R575.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.07.007

文章編號(hào)：1005-8982（2016）07-0029-04

收稿日期：2015-07-05