叢波，張加廷，韓龍，丁一，徐訓(xùn)安，姚旺林，張仲文

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，北京100039；2.武警總醫(yī)院骨四科，北京100039）

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兔軟骨細(xì)胞的分離及其與Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜共培養(yǎng)實驗研究*

叢波1，張加廷2，韓龍2，丁一2，徐訓(xùn)安1，姚旺林1，張仲文2

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，北京100039；2.武警總醫(yī)院骨四科，北京100039）

摘要：目的探討體外分離兔軟骨細(xì)胞的方法并觀察其與Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜共培養(yǎng)時的生物活性。方法取4周齡的新西蘭大耳兔，處死后在無菌條件下取關(guān)節(jié)軟骨。通過胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化軟骨細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞特點，制作細(xì)胞爬片行甲苯胺藍(lán)染色。將第3代兔軟骨細(xì)胞與Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜共培養(yǎng)，噻唑藍(lán)（MTT）法和糖胺聚糖含量測定法檢測軟骨細(xì)胞在膠原膜上的細(xì)胞活性，掃描電鏡觀察軟骨細(xì)胞在復(fù)合膠原膜上的生長情況。結(jié)果分離出的原代軟骨細(xì)胞初為卵圓形，貼壁后變成三角形或多邊形，可被甲苯胺藍(lán)染色。軟骨細(xì)胞在Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜上生長良好。結(jié)論兩部酶法可獲得大量軟骨細(xì)胞，MTT法和掃描電鏡證實軟骨細(xì)胞可在復(fù)合膠原膜上正常擴(kuò)增。

關(guān)鍵詞：軟骨細(xì)胞；復(fù)合膠原膜；胰蛋白酶；Ⅱ型膠原酶；細(xì)胞活性；軟骨缺損

軟骨缺損在臨床上比較常見，發(fā)病率高達(dá)5%。關(guān)節(jié)腔清理術(shù)、微骨折術(shù)等方法治療效果并不理想。因此，以軟骨細(xì)胞移植為代表的組織工程技術(shù)越來越受重視。軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞的重要來源，歷來備受關(guān)注［1-3］。本研究采取兩步酶法獲取原代兔軟骨細(xì)胞，通過顯微鏡觀察、細(xì)胞爬片染色等途徑了解其生物特點。將第3代兔軟骨細(xì)胞接種到Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜上，噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法和糖胺聚糖含量測定法檢測其細(xì)胞活性，掃描電鏡觀察其生長情況，為日后軟骨細(xì)胞移植提供了一定的實驗基礎(chǔ)［4］。

1　材料與方法

1.1實驗材料與試劑

4周齡新西蘭大耳兔1只，由北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場提供，許可證號為SCXK（京）2011-0010。磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）（北京雷根生物技術(shù)有限公司），改良Eagle培養(yǎng)液達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）/F12（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Gibco公司），青霉素-鏈霉素混合溶液（北京雷根生物技術(shù)有限公司），0.25%胰蛋白酶（北京雷根生物技術(shù)有限公司），0.2%Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司），MTT（北京雷根生物技術(shù)有限公司），二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（北京索萊寶公司），4%多聚甲醛、1%甲苯胺藍(lán)染液（北京雷根生物技術(shù)有限公司），無水乙醇（北京化工廠）。

1.2實驗方法

1.2.1兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代取4周齡新西蘭大耳兔1只，耳緣靜脈注射水合氯醛致死，剪除四肢毛發(fā)，碘伏浸泡0.5 h。常規(guī)鋪單，取出四肢放入無菌彎盤中，無菌敷料包裹。在超凈工作臺上仔細(xì)分離肩、髖、膝關(guān)節(jié)處的軟骨，注意分離表面肌肉、肌腱、半月板、滑膜等組織。用眼科剪將軟骨剪成碎片，PBS緩沖液沖洗3次后，置入裝有等體積0.25%胰蛋白酶的小燒杯中，與磁力攪拌器一起置于培養(yǎng)箱中37℃恒溫消化0.5 h。向燒杯內(nèi)加入等體積培養(yǎng)液終止消化。取出后放入15 ml離心管中，1 300 r/min離心5 min，棄上清液。將軟骨碎片取出放入裝有等體積0.2%Ⅱ型膠原酶的燒杯中，置于培養(yǎng)箱中37℃恒溫消化2 h。向燒杯內(nèi)加入等體積培養(yǎng)液終止消化。取出后放入15 ml離心管中，1 300 r/ min離心5 min，吸取上清液。將上清放入15 ml離心管中，1 800 r/min離心8 min。棄上清，加6 ml培養(yǎng)液（89%DMEM/F12+10%胎牛血清+1%雙抗）于離心管中，小心吹打，使細(xì)胞均勻分散在培養(yǎng)液中，之后將其一起移入25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（5%二氧化碳CO2，37℃）。如小燒杯內(nèi)殘留軟骨塊較多，可重復(fù)上述步驟進(jìn)行二次消化。原代細(xì)胞培養(yǎng)2 d后給予換液，以后隔日換液。取細(xì)胞懸液滴于細(xì)胞計數(shù)器中，按照如下公式對軟骨細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。每毫升DMEM/F12培養(yǎng)液中的細(xì)胞總數(shù)=4大格細(xì)胞總數(shù)/4×104×稀釋倍數(shù)。滴少許臺盼藍(lán)染液于細(xì)胞計數(shù)器中，活細(xì)胞細(xì)胞壁完整不被染色，而死細(xì)胞則被染成藍(lán)色。細(xì)胞存活率=4大格活細(xì)胞數(shù)/4大格細(xì)胞總數(shù)×100%。當(dāng)軟骨細(xì)胞融合至＞80%時，細(xì)胞呈現(xiàn)鋪路石樣改變，此時可將細(xì)胞傳代培養(yǎng)。用3 ml吸管吸出原培養(yǎng)液，PBS緩沖液漂洗3次以后，加入2 ml 0.25%胰蛋白酶搖晃培養(yǎng)瓶消化細(xì)胞約2 min，直至顯微鏡下觀察細(xì)胞呈皺縮狀或呈瀑布狀落下為止。終止消化后，吹打瓶底。將培養(yǎng)瓶內(nèi)液體移入15 ml離心管中1 800 r/min離心8 min，留取沉淀物，棄上清。再次加入6 ml培養(yǎng)液同法離心，以保證徹底去除胰蛋白酶，防止細(xì)胞消化過度。棄上清，吸取6 ml培養(yǎng)液于離心管中，吹打混合均勻后移入25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2軟骨細(xì)胞爬片甲苯胺藍(lán)染色將第3代軟骨細(xì)胞懸液放入有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d后細(xì)胞貼于蓋玻片上，此時細(xì)胞爬片制作成功。取出細(xì)胞爬片，PBS緩沖液沖洗爬片3次，4%多聚甲醛溶液固定10 min。將爬片放入干凈培養(yǎng)皿中，滴入適量0.1%甲苯胺藍(lán)染液浸泡4 h。無水乙醇沖洗3 min，干燥后顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)之前的消毒、浸泡用眼科剪將Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜修剪成大小合適的圓形材料，75%乙醇浸泡5 h，PBS緩沖液沖洗3次，每次約15 min。放于24孔板中，加入適量DMEM/F12培養(yǎng)液浸泡1 d，將粗糙面向上。

1.2.4MTT法檢測軟骨細(xì)胞在Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜上的細(xì)胞活性取2 ml 0.25%胰蛋白酶消化第3代軟骨細(xì)胞后，將細(xì)胞濃度調(diào)至1×105個/ml接種于4塊96孔培養(yǎng)板中，每個培養(yǎng)板分為兩組，分別為細(xì)胞組、細(xì)胞和膠原膜共培養(yǎng)組。每組放置10個樣本，每2天換1次液。先后取第2、4、6和8天的培養(yǎng)板，加入5 mg/ml的MTT液10μl/孔，培養(yǎng)箱孵育4 h后加DMSO，100μl/孔，恒溫?fù)u床振蕩10 min后在酶標(biāo)儀490nm波長處測吸光度值（optical density，OD）。

1.2.5糖胺聚糖水平檢測將第3代軟骨細(xì)胞懸液按照同一細(xì)胞濃度接種于4塊空白的96孔板和4塊含有Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜復(fù)合物的96孔培養(yǎng)板中，每組放置10個樣本，每2天換1次液。先后取第2、4、6和8天的軟骨細(xì)胞上清液，以兔糖胺聚糖酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測糖胺聚糖水平。

1.2.6掃描電鏡觀察軟骨細(xì)胞與Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜復(fù)合物取第3代軟骨細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至1× 105個/ml，與復(fù)合膠原膜在24孔板中共培養(yǎng)3 d。其中，第2和3天給予細(xì)胞換液。第3天換液后，將細(xì)胞膠原膜復(fù)合物從培養(yǎng)板中取出，PBS緩沖液漂洗3次，取2.5%戊二醛、1%鋨酸進(jìn)行固定，用不同濃度的乙醇進(jìn)行梯度脫水。樣品行臨界點干燥后，將其貼于樣品臺上噴金行掃描電鏡觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1軟骨細(xì)胞形態(tài)及存活率

原代軟骨細(xì)胞初為卵圓形，懸浮于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2 d后細(xì)胞貼壁生長，其余不能貼壁的細(xì)胞可通過換液去除。細(xì)胞貼壁以后，逐漸鋪展成多角形或梭形，伸出短小的突出。高倍鏡下觀察到軟骨細(xì)胞胞核清楚，為圓形、橢圓形。5 d后細(xì)胞融合至＞80%，呈集落性生長，呈現(xiàn)典型的鋪路石樣改變。分離的原代軟骨細(xì)胞濃度約為2.5×105個/ml，臺盼藍(lán)染色測定細(xì)胞存活率約為90%。傳代后的軟骨細(xì)胞開始時同樣為卵圓形，貼壁后變?yōu)樗笮位蚨嘟切?。而貼壁時間較原代細(xì)胞短，第3代軟骨細(xì)胞約36 h即可完成貼壁。隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞去分化現(xiàn)象明顯，細(xì)胞伸出偽足，3代以后的各代細(xì)胞增殖能力下降，傳代周期較前幾代長。見圖1。

2.2軟骨細(xì)胞爬片甲苯胺藍(lán)染色

軟骨細(xì)胞均被染色，細(xì)胞輪廓清晰。細(xì)胞核深染，細(xì)胞質(zhì)淺染，兩者分界清晰。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)散在藍(lán)紫色異染顆粒。見圖2。

圖1　軟骨細(xì)胞形態(tài)觀察（×400）

圖2　軟骨細(xì)胞爬片甲苯胺藍(lán)染色

2.3MTT法檢測軟骨細(xì)胞在Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜上的細(xì)胞活性

MTT法測得細(xì)胞組與共培養(yǎng)組第2、4、6和8天的OD值?？梢钥闯觯浌羌?xì)胞無論是單獨培養(yǎng)還是與膠原膜共培養(yǎng)都能很好地增殖，4 d以內(nèi)細(xì)胞增殖速度較快，此后速度減慢。且同一天共培養(yǎng)組的OD值要高于細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖3。

2.4糖胺聚糖水平檢測

從細(xì)胞組與共培養(yǎng)組第2、4、6和8天的糖胺聚糖水平可見，復(fù)合膠原膜共培養(yǎng)4 d以內(nèi)的軟骨細(xì)胞分泌較多的糖胺聚糖，細(xì)胞活性較高，且膠原膜能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，兩組的糖胺聚糖水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這與MTT法得出的結(jié)論一致。見表2和圖4。

2.5掃描電鏡觀察軟骨細(xì)胞與Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜復(fù)合物

掃描電鏡觀察到復(fù)合膠原膜的孔徑均一，平均為100μm左右。軟骨細(xì)胞鋪展在復(fù)合膠原膜上，生長良好，部分細(xì)胞伸出偽足，呈現(xiàn)出聚集生長的趨勢。高倍鏡下觀察到細(xì)胞膜表面的微絨毛和突起等結(jié)構(gòu)，符合軟骨細(xì)胞的基本特征。見圖5。

表1　兩組的OD值比較?。╪=10，±s）

表1　兩組的OD值比較?。╪=10，±s）

組別　　第2天　　第4天　　第6天　　第8天細(xì)胞組　0.673±0.388 0.802±0.322 0.832±0.237 0.845±0.576共培養(yǎng)組1.071±0.564 1.239±0.442 1.259±0.658 1.265±0.447 t值　1.838　2.527　1.931　1.822 P值　0.041　0.021　0.069　0.085

圖3　兩組的OD值比較

表2　兩組的糖胺聚糖含量比較?。╪=10，μg/ml，±s）

表2　兩組的糖胺聚糖含量比較　（n=10，μg/ml，±s）

組別　　第2天　　第4天　　第6天　　第8天細(xì)胞組　14.13±3.12 23.28±3.26 23.96±2.97 24.11±3.59共培養(yǎng)組　18.43±2.17 27.32±2.78 28.13±3.14 29.47±2.75 t值　3.270　3.165　3.051　3.748 P值　0.004　0.005　0.007　0.002

圖4　兩組糖胺聚糖含量比較

圖5　軟骨細(xì)胞膠原膜復(fù)合物的掃描電鏡圖

3　討論

酶在軟骨細(xì)胞的分離過程中起著至關(guān)重要的作用。胰蛋白酶可去除混于軟骨塊中的滑膜和結(jié)締組織等，保證Ⅱ型膠原酶能更好地與組織塊接觸。胰蛋白酶消化獲取的軟骨細(xì)胞純度較高，混入其中的雜質(zhì)較少。軟骨細(xì)胞具有貼壁的特性，而雜質(zhì)并不貼壁，可通過換液的方式去除雜質(zhì)。Ⅱ型膠原酶的主要作用是把細(xì)胞基質(zhì)中的膠原纖維降解成低分子短鏈多肽，從而將軟骨細(xì)胞分離出來。值得強(qiáng)調(diào)的是，無論是胰蛋白酶還是Ⅱ型膠原酶，在使用時一定要注意控制好時間和濃度，否則對軟骨細(xì)胞會有所損傷。一般而言，胰蛋白酶的作用時間約為0.5 h，Ⅱ型膠原酶的作用時間約為2 h。在Ⅱ型膠原酶進(jìn)行第2次消化時可加入適量胎牛血清，這樣可降低膠原酶對細(xì)胞的毒性，對細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。軟骨細(xì)胞適合在溫度為37℃、二氧化碳濃度為5%的環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)液的pH需調(diào)至7.3左右，培養(yǎng)液中需含有胎牛血清和維生素C，以保證細(xì)胞正常增殖并維持細(xì)胞活性［5-6］。軟骨細(xì)胞貼壁后一般隔天換液。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液由紅色變?yōu)辄S色時說明培養(yǎng)液中的營養(yǎng)已被耗盡，對細(xì)胞生長不利，需立即換液。

自軟骨細(xì)胞移植技術(shù)問世以來，如何獲取數(shù)量充足、表型穩(wěn)定的種子細(xì)胞一直是困擾眾多學(xué)者的一個難題。研究表明，軟骨細(xì)胞傳至3代以后，細(xì)胞會失去原有的形狀，細(xì)胞表型發(fā)生改變，發(fā)生去分化［7］。如何解決軟骨細(xì)胞的去分化問題是組織工程領(lǐng)域的難點，但細(xì)胞聚集培養(yǎng)就能很好地解決這一問題。由于軟骨細(xì)胞不斷地分泌生長因子，在聚集培養(yǎng)的過程中，局部生長因子濃度升高，有利于細(xì)胞維持表型［8］。同時，細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)之間進(jìn)行信號傳導(dǎo)，有利于細(xì)胞恢復(fù)表型。故在軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)時，一定要注意接種的密度，防止因密度過低發(fā)生去分化［9-11］。對組織工程而言，選擇表型穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞是至關(guān)重要的。軟骨細(xì)胞傳至5代后呈長梭形，此時可斷定細(xì)胞的表型發(fā)生改變［12］。因此，軟骨細(xì)胞移植一般用3代以內(nèi)的軟骨細(xì)胞。

本實驗中筆者通過細(xì)胞形態(tài)觀察和甲苯胺藍(lán)染色對軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定［13-14］。軟骨細(xì)胞貼壁前為卵圓形，貼壁后變成三角形、梭形，呈集落性生長，符合軟骨細(xì)胞的形態(tài)［15］。甲苯胺藍(lán)是一種堿性染料，軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)均為酸性，能與甲苯胺藍(lán)的陽離子結(jié)合，細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被染成淺藍(lán)色。除此之外，因軟骨細(xì)胞可特異性分泌Ⅱ型膠原，故Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色也是很好的鑒定方法［16］。細(xì)胞線粒體內(nèi)含有琥珀酸脫氫酶，能把MTT還原為甲瓚，DMSO能將甲瓚溶解。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，用酶標(biāo)儀測得490 nm波長處的OD值與細(xì)胞數(shù)成正比。MTT法正是基于上述原理檢測細(xì)胞活性。筆者研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)4 d以內(nèi)細(xì)胞增殖較快，活性較高，與國外的文獻(xiàn)報道相符［17］。糖胺聚糖水平檢測與MTT法所得結(jié)論一致。

綜上所述，兩步酶法可成功分離出軟骨細(xì)胞，細(xì)胞雜質(zhì)較少，數(shù)量充足，表型穩(wěn)定，生物活性好，是組織工程很好的種子細(xì)胞來源［18］。筆者采用Ⅰ/Ⅱ型復(fù)合膠原膜作為支架材料，上層為Ⅱ型膠原膜，比較粗糙，利于細(xì)胞附著、生長；下層為Ⅰ型膠原膜，比較致密，可防止細(xì)胞流失。膠原膜在制備過程中需要使用多種試劑，也無法做到無菌操作?；瘜W(xué)試劑和細(xì)菌污染均可影響細(xì)胞生長，故膠原膜與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)之前需使用75%乙醇浸泡，然后用培養(yǎng)液浸泡，保證細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中沒有混入細(xì)菌和化學(xué)試劑。筆者發(fā)現(xiàn)，膠原膜和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時，同一天共培養(yǎng)組細(xì)胞的OD值要高于細(xì)胞組。在本實驗中，無論是MTT法還是糖胺聚糖含量測定都證實該結(jié)論。

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（申海菊 編輯）

Isolation of rabbit chondrocytes and their co-culture with typeⅠ/Ⅱcollagen membrane*

Bo Cong1，Jia-ting Zhang2，Long Han2，Yi Ding2，Xun-an Xu1，Wang-lin Yao1，Zhong-wen Zhang2
（1. Postgraduate Training Base，General Hospital of Armed Police Forces，Jinzhou Medical University，Beijing 100039，China；2. The Fourth Department of Orthopaedics，General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039，China）

Abstract:Objective To explore the method of isolating rabbit chondrocytes in vitro and observe their bioactivity when co-cultured with typeⅠ/Ⅱcollagen membrane. Methods Articular cartilage was taken under aespetic conditions after the New Zealand rabbits at 4 weeks of age were sacrificed. Chondrocytes were digested by trypsin and typeⅡcollagenase. The features of the chondrocytes were observed under inverted phase contrast microscope. The slides of cells were stained by toluidine blue. The third-generation rabbit chondrocytes were co-cultured with typeⅠ/Ⅱcollagen membrane. The growth of the chondrocytes on type Ⅰ/Ⅱcollagen membrane was observed by the method of MTT，test of glycosaminoglycan and scaning electron microscopy. Results The original-generation chondrocytes were oval in the beginning，then they were triangle or polygan. The chondrocytes could be stained by toluidine blue. They grew well on the typeⅠ/Ⅱcollagen membrane. Conclusions A large number of chondrocytes can be obtained by two-enzyme method. Chondrocytes can amplify normally on the typeⅠ/Ⅱcollagen membrane，which can be demonstrated by MTT method and scaning electron microscopy.

Keywords:chondrocyte；typeⅠ/Ⅱcollagen membrane；trypsin；typeⅡcollagenase；co-culture；bioactivity

中圖分類號：R329

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.07.002

文章編號：1005-8982（2016）07-0004-05

收稿日期：2016-01-07

*基金項目：首都臨床特色應(yīng)用研究項目（No：Z161100000516013）；武警總醫(yī)院一類課題（No：WZ2012016）

［通信作者］張仲文，E-mail：zhang6816151@163.com；Tel：13716151868