葉長虹　林　霖　褚以忞　吉　猛　曾　欣　林　勇&

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院消化內(nèi)科1(200003)　上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院內(nèi)鏡室2

血清miR-192和miR-29a在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應(yīng)用價值*

葉長虹1#林霖1#褚以忞2#吉猛1曾欣1林勇1&

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院消化內(nèi)科1(200003)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院內(nèi)鏡室2

背景：早期診斷肝硬化并予早期干預(yù)可阻止病情進(jìn)展，避免或延緩肝硬化失代償發(fā)生。篩選血清學(xué)無創(chuàng)標(biāo)記物是肝硬化臨床診斷和評估研究的重要內(nèi)容。目的：評價血清miR-192和miR-29a在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應(yīng)用價值。方法：通過文獻(xiàn)檢索和real-time PCR篩選驗證發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者血清中差異表達(dá)明顯的miRNAs——miR-192和miR-29a，以real-time PCR檢測兩者在120例肝硬化患者和76名健康對照者血清中的表達(dá)水平；二元logistic回歸建立兩者聯(lián)合檢測診斷肝硬化的數(shù)學(xué)模型，ROC曲線評估診斷效能。結(jié)果：肝硬化組血清miR-192表達(dá)水平顯著高于對照組，血清miR-29a表達(dá)水平則顯著低于對照組(P<0.001)。由兩者聯(lián)合檢測數(shù)學(xué)模型計算得到的風(fēng)險評分診斷肝硬化的價值明顯優(yōu)于單一指標(biāo)檢測[ROC曲線下面積(AUC)：0.968對0.887和0.933]，且優(yōu)于臨床常用肝硬化血清學(xué)無創(chuàng)診斷指標(biāo)APRI、FIB-4和ARR(AUC： 0.796、0.793和0.571)。血清miR-192、miR-29a表達(dá)水平以及兩者聯(lián)合檢測的風(fēng)險評分與肝硬化Child-Pugh分級顯著相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：miR-192、miR-29a以及兩者聯(lián)合檢測的風(fēng)險評分可作為肝硬化無創(chuàng)診斷和評估新的血清分子標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞血清；生物學(xué)標(biāo)記；肝硬化；無創(chuàng)診斷；miR-192；miR-29a

肝硬化是各種慢性肝病的終末期改變，可能誘發(fā)門靜脈高壓和肝功能衰竭，并導(dǎo)致各種并發(fā)癥[1]。目前，肝硬化在全球常見死因中居第14位，在發(fā)達(dá)國家中的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢[2]。失代償期肝硬化病情進(jìn)展迅速、預(yù)后差，且缺乏有效治療手段，而早期診斷肝硬化并予早期干預(yù)可阻止病情進(jìn)展，避免或延緩肝硬化失代償發(fā)生[2]。肝活檢是肝硬化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但有發(fā)生出血、肝臟損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥的風(fēng)險，并存在取樣以及檢查者誤差，應(yīng)用受到一定限制[3]。因此，探索更為方便、有效、無創(chuàng)的臨床指標(biāo)以代替肝活檢用于肝硬化的早期診斷成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。

微RNA(microRNAs, miRNAs)是一組由18～24個堿基組成的非蛋白質(zhì)編碼小分子RNA，可作用于靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs不僅穩(wěn)定存在于組織細(xì)胞中，一些miRNAs在血清中亦有穩(wěn)定表達(dá)，并與腫瘤以及多種慢性疾病相關(guān)，可作為諸多疾病診斷、治療和預(yù)后評估的生物學(xué)標(biāo)記物[5]。本研究通過文獻(xiàn)檢索和血清miRNAs檢測，篩選出在肝硬化患者血清中差異表達(dá)較明顯的miR-192和miR-29a并加以驗證，并進(jìn)一步評價兩者在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應(yīng)用價值。

資料與方法

一、文獻(xiàn)檢索和miRNAs篩選驗證

以 “miRNA”、“l(fā)iver cirrhosis”、“l(fā)iver fibrosis”等為關(guān)鍵詞檢索PubMed，以“微RNA”、“肝硬化”、“肝纖維化”等為關(guān)鍵詞組合檢索中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫，檢索年限為2000年1月—2014年6月，獲取有關(guān)肝硬化、肝纖維化患者血清差異表達(dá)miRNAs的文獻(xiàn)，篩選肝硬化相關(guān)候選miRNAs。

收集2011年7月—2011年10月上海長征醫(yī)院消化內(nèi)科診治的20例肝硬化患者的血清樣本，用于候選miRNAs的篩選驗證，其中男性12例，女性8例，年齡42～69歲。肝硬化組入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18周歲，性別不限；②有肝功能受損和(或)門靜脈高壓的臨床表現(xiàn)，經(jīng)臨床、影像學(xué)或肝活檢確診為肝硬化。肝硬化組排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個月內(nèi)發(fā)生各種感染、消化道出血；②確診或懷疑合并惡性腫瘤(含原發(fā)性肝細(xì)胞癌)，AFP≥20 ng/mL者須經(jīng)CT、MRI等影像學(xué)檢查排除肝臟腫瘤；③有嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病，如淋巴瘤、白血病等或結(jié)締組織?。虎苡忻黠@心、肺、腎臟疾?。虎軭IV或梅毒陽性；⑥妊娠或哺乳期女性。同期收集體檢中心20名健康志愿者的血清樣本作為對照組，其中男性12例，女性8例，年齡41～69歲。對照組入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18周歲，性別不限；②有完整病史資料和實驗室、輔助檢查結(jié)果。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：①各種急慢性肝病，包括肝功能指標(biāo)異常、HBsAg或HBV DNA陽性、HCV抗體或HCV RNA陽性、自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝病；②長期大量飲酒或近2周內(nèi)大量飲酒；③同肝硬化組排除標(biāo)準(zhǔn)①～⑥。血清樣本采集過程符合倫理要求并獲得知情同意，所采集樣本以real-time PCR行miRNAs表達(dá)檢測(方法見下文)。

二、血清miR-192、miR-29a在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應(yīng)用

1. 一般資料：收集2012年1月—2014年11月上海長征醫(yī)院消化內(nèi)科診治的肝硬化患者120例，其中男性62例，女性58例，年齡35～73歲。同期收集體檢中心76名健康志愿者作為對照組，其中男性36例，女性40例，年齡35～70歲。肝硬化組和對照組入選和排除標(biāo)準(zhǔn)同miRNAs篩選驗證步驟。采集兩組臨床資料，計算臨床常用肝硬化血清學(xué)無創(chuàng)診斷指標(biāo)，包括AST/血小板比值指數(shù)(AST/PLT ratio index, APRI)、基于四因素的肝纖維化指數(shù)(fibrosis index based on the 4 factors, FIB-4)和AST/ALT比值(AST/ALT ratio, AAR)。血清樣本和臨床資料采集過程符合倫理要求并獲得知情同意。肝功能分級采用Child-Pugh分級，根據(jù)血清總膽紅素(total bilirubin, TBIL)、白蛋白(albumin, ALB)、凝血酶原時間(prothrombin time, PT)、腹水和肝性腦病情況，分為A、B、C三級。

2. Real-time PCR檢測miRNAs表達(dá)：取350 μL血清，加入內(nèi)參cel-miR-238(2 μmol/L)1 μL(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，以mirVanaTMPARISTMRNA and Native Protein Purification Kit(AmbionTM, Thermo Fisher Scientific Inc.)提取總RNA，95 ℃預(yù)熱洗脫液100 μL溶解，檢測質(zhì)量后-80 ℃冰箱保存。

以PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(TAKARA BIO INC.)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。5 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中含3 μL總RNA、1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶混合物、0.5 μL cel-miR-238逆轉(zhuǎn)錄引物、0.5 μL miR-192或miR-29a逆轉(zhuǎn)錄引物(表1)。反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

表1　miR-192、miR-29a和內(nèi)參引物以及內(nèi)參序列

采用Applied Biosystems 7900HT快速實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific Inc.)行real-time PCR，所用試劑盒為SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TAKARA BIO INC.)。總反應(yīng)體系10 μL，內(nèi)含2×SYBR Green熒光混懸液5 μL、各miRNAs forward引物和通用reverse引物各0.2 μL(表1)、cDNA 0.8 μL、去RNA酶水3.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。2-ΔΔCt法計算目的miRNAs相對表達(dá)量。每一樣本設(shè)3個復(fù)孔，結(jié)果取均值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

一、候選miRNAs的篩選驗證

應(yīng)用所設(shè)定的關(guān)鍵詞檢索PubMed、中國知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫，共得到有關(guān)肝硬化、肝纖維化患者血清差異表達(dá)miRNAs的文獻(xiàn)233篇，文獻(xiàn)中與肝硬化、肝纖維化相關(guān)的血清差異表達(dá)miRNAs主要包括miR-21、miR-122、miR-571、miR-155、miR-194、miR-29a、miR-370、miR-192、miR-652。設(shè)計針對上述9個候選miRNAs的引物序列，取用于候選miRNAs篩選驗證的肝硬化患者和對照者的血清樣本各20例，以real-time PCR進(jìn)行檢測鑒定，結(jié)果顯示肝硬化組miR-192、miR-571表達(dá)明顯上調(diào)，miR-29a、miR-155、miR-652表達(dá)明顯下調(diào)，其中miR-192、miR-29a在兩組間表達(dá)差異較為明顯(圖1)。

肝硬化組與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖19個候選血清miRNAs在肝硬化組與對照組間的差異表達(dá)

二、血清miR-192、miR-29a在肝硬化無創(chuàng)診斷中的應(yīng)用價值

1. 一般資料：肝硬化組和對照組一般資料見表2。肝硬化病因：乙型肝炎63例，丙型肝炎9例，自身免疫性肝炎8例，血吸蟲性肝病10例，酒精性15例，原發(fā)性膽汁性肝硬化8例，肝豆?fàn)詈俗冃?例，隱源性5例；肝硬化Child-Pugh分級：A級47例，B級39例，C級34例。與對照組相比，肝硬化組TBIL明顯升高，ALT、AST有所升高，ALB、PLT、纖維蛋白原(FIB)下降，PT延長，國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)增高，APRI、FIB-4值分別為1.710±0.162和6.345±0.484，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩組間凝血酶時間(TT)、AAR值無明顯差異(P>0.05)。

表2　肝硬化組和對照組一般資料比較

2. 血清miR-192、miR-29a表達(dá)水平：real-time PCR檢測結(jié)果顯示，肝硬化組血清miR-192表達(dá)水平顯著高于對照組，約為對照組的3.39倍(P<0.001)(圖2A)，血清miR-29a表達(dá)水平則顯著低于對照組，約為對照組的16.9%(P<0.001)(圖2B)。

除乙型肝炎外，本組由其他病因?qū)е碌母斡不龜?shù)偏少，為明確血清miR-192、miR-29a表達(dá)變化是否與肝硬化病因有關(guān)，本研究進(jìn)一步比較了兩者在乙型肝炎和非乙型肝炎肝硬化組間的表達(dá)情況，結(jié)果顯示兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

3. 血清miR-192、miR-29a診斷效能分析：ROC曲線分析顯示，以1.502為界值，血清miR-192診斷肝硬化的敏感性為84.17%，特異性為86.84%，ROC曲線下面積(AUC)為0.887(圖4A)；以0.287為界值，血清miR-29a診斷肝硬化的敏感性為89.17%，特異性為86.84%，AUC為0.933(圖4B)，兩者對肝硬化均有較高的診斷價值。

采用二元logistic回歸推導(dǎo)出血清miR-192和miR-29a聯(lián)合檢測診斷肝硬化的新數(shù)學(xué)模型：風(fēng)險評分=1.978-11.320×miR-29a+1.183×miR-192。ROC曲線分析顯示，以1.431為界值，風(fēng)險評分>1.431診斷肝硬化的敏感性為87.50%，特異性為97.37%，AUC為0.968(圖4C)，診斷價值明顯優(yōu)于單一指標(biāo)檢測，尤其是在診斷特異性方面。APRI、FIB-4、AAR三項臨床常用血清學(xué)無創(chuàng)診斷指標(biāo)診斷肝硬化的AUC分別為0.796、0.793和0.571(圖4D、4E、4F)，診斷價值均低于血清miR-192、miR-29a兩者單獨或聯(lián)合檢測(表3)。

4. 血清miR-192、miR-29a與肝硬化嚴(yán)重程度的相關(guān)性：Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析顯示，血清miR-192、miR-29a表達(dá)水平以及兩者聯(lián)合檢測的風(fēng)險評分與肝硬化Child-Pugh分級顯著相關(guān)(miR-192：P=0.021，rs=0.211；miR-29a：P=0.004，rs=-0.259；聯(lián)合檢測風(fēng)險評分：P=0.009，rs=0.238)(圖5)。

圖2　血清miR-192、miR-29a在肝硬化組與對照組間的差異表達(dá)

圖3　血清miR-192、miR-29a在乙型肝炎與非乙型肝炎肝硬化組間的差異表達(dá)

圖4　不同血清學(xué)無創(chuàng)指標(biāo)診斷肝硬化AUC比較

圖5　血清miR-192、miR-29a表達(dá)水平以及兩者聯(lián)合檢測風(fēng)險評分與肝硬化Child-Pugh分級的相關(guān)性

討論

近年肝硬化發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重危害人類健康。肝硬化的早期診斷和評估是臨床工作中的難點，目前尚缺乏特異性、敏感性俱佳的血清學(xué)無創(chuàng)診斷方法，篩選血清學(xué)無創(chuàng)標(biāo)記物是肝硬化臨床診斷和評估研究的重要內(nèi)容。晚近研究表明，多種纖維化疾病患者外周血中存在穩(wěn)定表達(dá)的miRNAs，篩選并鑒定出一個或數(shù)個在肝纖維化/肝硬化患者血清中特異且穩(wěn)定表達(dá)的miRNA作為無創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)記物具有很高的臨床應(yīng)用價值。然而目前血清miRNAs檢測方法尚有待改進(jìn)，特別是缺乏穩(wěn)定、可靠的內(nèi)參照物用于校準(zhǔn)血清miRNAs檢測值。既往研究中，RNU6B(U6)常被用作血清miRNAs real-time PCR檢測的內(nèi)參照物，但其血清表達(dá)水平個體差異較大且在肝纖維化患者中常較健康對照者顯著下調(diào)，并不適用于人肝硬化相關(guān)血清miRNAs檢測值的校準(zhǔn)[6]。為建立準(zhǔn)確的參照標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)研究者建議插入外源性RNA(spiked-in RNA)[7-9]。本研究于提取總RNA前在待測血清樣本中加入非人類同源的人工合成秀麗線蟲cel-miR-238作為血清miRNAs檢測的內(nèi)參照物[10-11]，前期實驗結(jié)果顯示加入的外源性cel-miR-238在個體間表達(dá)穩(wěn)定，是相對理想的內(nèi)參照物，可明顯提高血清miRNAs real-time PCR檢測的準(zhǔn)確性。

miR-192和miR-29均為與纖維化明顯相關(guān)的miRNA，miR-29尚與多種惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等關(guān)系密切，起抑癌基因作用。研究表明，在CCl4或膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，miR-29家族(包括miR-29a、miR-29b、miR-29c)表達(dá)均顯著下調(diào)；在小鼠肝星狀細(xì)胞(HSCs)中過表達(dá)miR-29可抑制HSCs活化及其細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)[12-14]。關(guān)于miR-192在肝纖維化中作用的研究不多，但其參與腎纖維化進(jìn)程已得到證實。研究發(fā)現(xiàn)miR-192可通過作用于E-box抑制劑Zeb1/2以及調(diào)控其他腎臟miRNAs增加膠原基因表達(dá)；抑制糖尿病小鼠腎臟miR-192可上調(diào)Zeb1/2，從而抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、纖維連接蛋白和膠原基因表達(dá)，減少膠原合成，阻止腎纖維化進(jìn)程[15-17]。

本研究結(jié)果證實，肝硬化患者的血清miR-192、miR-29a表達(dá)水平與健康對照者相比差異顯著，其中miR-192表達(dá)明顯上調(diào)，miR-29a表達(dá)明顯下調(diào)，兩者單獨或聯(lián)合檢測用于診斷肝硬化的價值明顯優(yōu)于APRI、FIB-4、AAR三項傳統(tǒng)肝硬化血清學(xué)無創(chuàng)診斷指標(biāo)。此外，本研究證實血清miR-192、miR-29a表達(dá)水平以及兩者聯(lián)合檢測的風(fēng)險評分與肝硬化嚴(yán)重程度有較好的相關(guān)性，可能成為評估肝硬化程度較為理想的臨床指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-192、miR-29a表達(dá)水平在乙型肝炎與非乙型肝炎肝硬化組間無明顯差異，表明兩者與肝硬化病因無直接聯(lián)系，而與病情進(jìn)展關(guān)系更為密切。

綜上所述，miR-192、miR-29a以及兩者聯(lián)合檢測的風(fēng)險評分可作為肝硬化無創(chuàng)診斷和評估新的血清分子標(biāo)記物。本研究在研究設(shè)計和方法學(xué)方面仍存在一定缺陷，如血清miRNAs的檢測僅在臨床確診肝硬化患者中進(jìn)行、納入的臨床樣本數(shù)量偏小、未能與肝活檢結(jié)果進(jìn)行比對等。后續(xù)研究將進(jìn)一 步關(guān)注包括miR-192、miR-29a在內(nèi)的血清miRNAs表達(dá)譜對不同程度肝纖維化和早期肝硬化的診斷價值。隨著臨床研究的不斷深入以及樣本量的逐步擴(kuò)大，血清miRNAs檢測將可能為肝硬化無創(chuàng)診斷提供新的臨床依據(jù)和研究方向。

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(2016-03-28收稿；2016-04-04修回)

Value of Serum miR-192 and miR-29a for Non-invasive Diagnosis of Liver CirrhosisYEChanghong1,LINLin1,CHUYimin2,JIMeng1,ZENGXin1,LINYong1.1DepartmentofGastroenterology,ShanghaiChangzhengHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai(200003);2DepartmentofEndoscopy,TongrenHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai

Correspondence to: LIN Yong, Email: linyongmd@163.com

Background: Diagnosis of liver cirrhosis in early stage with early intervention may stabilize disease progression, avoiding or delaying the occurrence of decompensation. Seeking non-invasive serum biomarkers is becoming an important topic in the diagnosis and assessment of liver cirrhosis. Aims: To study the value of serum miR-192 and miR-29a as non-invasive biomarkers for the diagnosis of liver cirrhosis. Methods: Differentially expressed serum miRNAs between patients with liver cirrhosis and healthy controls were screened through online literature retrieval and then confirmed by real-time PCR. Serum levels of two confirmed miRNAs, miR-192 and miR-29a were analyzed in 120 patients with liver cirrhosis and 76 healthy volunteers by real-time PCR. A mathematical model of combined detection of miR-192 and miR-29a for diagnosis of liver cirrhosis was established by binary logistic regression. The diagnostic performance of various non-invasive serum indicators was evaluated by ROC curve analysis. Results: Compared with healthy controls, expression level of serum miR-192 in cirrhotic patients was significantly increased and that of serum miR-29a was significantly reduced (P<0.001). The diagnostic performance of risk score obtained from mathematical model of combined detection of serum miR-192 and miR-29a was superior to that of single miRNA detection or other non-invasive serum indicators, such as APRI, FIB-4 and ARR, the areas under ROC curve of the above mentioned indicators were 0.968, 0.887, 0.933, 0.796, 0.793, and 0.571, respectively. Serum levels of miR-192, miR-29a and the risk score of their combined detection were significantly correlated with the stage of liver cirrhosis according to the Child-Pugh classification (P<0.05). Conclusions: Serum miR-192, miR-29a and the risk score of their combined detection might be novel non-invasive biomarkers for the diagnosis and assessment of liver cirrhosis.

Key wordsSerum;Biological Markers;Liver Cirrhosis;Non-Invasive Diagnosis;miR-192;miR-29a

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.05.003

*基金項目：國家自然科學(xué)基金(81170403，81370551)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(A類)

#共同第一作者，葉長虹，Email: ychdeyoujian@sohu.com；林霖， Email: linlin1989ll@126.com；褚以忞, Email: yimin_chu@163.com

&本文通信作者，Email: linyongmd@163.com