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磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表達載體的構(gòu)建及在細胞中的表達

2016-06-23 13:49程華方向東崔碩吳萌張昭軍李澤夏
生物技術(shù)通報 2016年5期
關鍵詞:蛋白聚糖肌醇真核

程華方向東崔碩吳萌張昭軍李澤夏

(1.河北省科學院生物研究所,石家莊 050081;2.中國科學院北京基因組研究所,北京 100101)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3真核表達載體的構(gòu)建及在細胞中的表達

程華1方向東2崔碩1吳萌1張昭軍2李澤夏2

(1.河北省科學院生物研究所,石家莊 050081;2.中國科學院北京基因組研究所,北京 100101)

構(gòu)建載體表達人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)蛋白,用以獲得抗GPC3單克隆抗體。用PCR技術(shù)擴增GPC3基因,利用酶切位點將該序列插入p3XFLAG-CMV-14載體,構(gòu)建pCMV-gpc3表達載體。通過脂質(zhì)體將該載體轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中,利用Western blot技術(shù)檢測最終結(jié)果。收集穩(wěn)定表達的細胞,破碎,通過親和層析柱,獲得純度較高的GPC3蛋白。成功構(gòu)建pCMV-gpc3真核表達載體,轉(zhuǎn)染至HEK293細胞后,經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達的單克隆細胞系;Western blot分析結(jié)果表明目的蛋白高效表達。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3;真核表達;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染;親和純化

磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一個家族,參與調(diào)控個體發(fā)育、細胞增殖和分化等過程[1-3]。有研究表明,Glypican-3與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切,特別是在肝細胞癌中特異性高表達,是一種潛在的肝癌血清學和組織學重要診斷標志物[4-12]。另外,近期的研究表明GPC3不但能夠用于肝癌的診斷,而且具有抑制肝癌細胞系生長的功能[13],該發(fā)現(xiàn)為肝癌的特異性治療提供了新的思路。

本研究利用真核表達載體和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),獲得了穩(wěn)定表達Glypican-3的單克隆細胞系。通過大量培養(yǎng)、細胞破碎和親和純化,獲得了一定數(shù)量的GPC3蛋白,為進一步研究GPC3的分子生物學特性和功能奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、菌株與質(zhì)粒 含GPC3基因的質(zhì)粒由德國洪堡大學病理學研究所Lage博士惠贈;克隆菌株E.coli DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;克隆載體pMD18-T購自寶生物公司;人胚胎腎細胞HEK293購自國家實驗細胞共享平臺;表達載體p3XFLAG-CMV-14購自Sigma公司。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRΙ和BamHΙ、T4連接酶、Pfu DNA聚合酶均購自New England Biolabs公司;DNA分子質(zhì)量標準和凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司;蛋白質(zhì)分子量標準購自美國熱電公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Life公司;ANTI-FLAG? M1 Agarose Affinity Gel及ANTIFLAG抗體購自Sigma公司;兔抗人GPC3蛋白和兔抗人β-actin抗體購自美國ABcom公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG抗體購自北京華美公司;細胞培養(yǎng)板、DMEM培養(yǎng)基,胎牛血清,均購自美國GIBCO公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 根據(jù)GPC3的基因閱讀框序列設計擴增引物,上游引物:5'-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3'(下劃線部分為EcoR Ι酶切位點);下游引物:5'-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3'(下劃線部分為BamH Ι酶切位點)。使用上述引物,以含GPC3基因的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。PCR擴增條件:95℃預變性5 min;95℃變性60 s,60℃退火60 s,72℃延伸2 min,共35個循環(huán);72℃延伸15 min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 重組質(zhì)粒pMD18-gpc3的構(gòu)建及鑒定 將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收,連入pMD18-T載體,產(chǎn)物用T4連接酶在16℃水浴中連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α菌株,篩選陽性克隆,獲得重組表達質(zhì)粒pMD18-gpc3。

1.2.3 重組質(zhì)粒pCMV-gpc3的構(gòu)建及鑒定 將質(zhì)粒pMD18-gpc3和質(zhì)粒p3XFLAG-CMV-14分別用EcoR Ι和BamH Ι雙酶切,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。取含有酶切位點的目的基因和經(jīng)雙酶切的p3XFLAG-CMV-14用T4連接酶在16℃水浴中連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α菌株,篩選陽性克隆,獲得重組表達質(zhì)粒pCMV-gpc3。

1.2.4 HEK293細胞的培養(yǎng) HEK293細胞培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。待細胞密度達到90%時,用0.05%胰蛋白酶進行消化傳代,傳代比例為1∶3。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將狀態(tài)良好的HEK293細胞以5×105個/孔的密度接種于6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng),待細胞密度達到80%-90%時進行轉(zhuǎn)染。用PBS沖洗3次,加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行,轉(zhuǎn)染時設立陰性組(p3XFLAG-CMV-14)和陽性組(pCMV-gpc3質(zhì)粒)。細胞轉(zhuǎn)染48 h后用含有0.5 mg/L G418、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基加壓篩選,采用有限稀釋法原理將細胞轉(zhuǎn)至96孔板,每孔1-2個細胞。待96孔板內(nèi)細胞增殖成團后,傳至細胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng),最終得到穩(wěn)定表達重組蛋白的單克隆細胞株pCMV-gpc3/293和陰性對照組pCMV-gpc3/NC。

1.2.6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后GPC3蛋白表達水平 待穩(wěn)定表達重組蛋白的細胞株和HEK293細胞生長至密度約90%時,收集細胞,裂解細胞提取細胞總蛋白,提取方法按照試劑盒說明書進行。BCA法測定蛋白濃度后,取適量蛋白進行SDS-PAGE電泳,參照文獻[14]的方法進行。

電泳結(jié)束后以恒壓90 V,利用半干轉(zhuǎn)移設備將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;將轉(zhuǎn)好的膜浸入封閉液(含5%(M/V)脫脂奶粉的TBST中,室溫輕搖封閉2 h;以購買的兔抗人GPC3蛋白抗體、兔抗人β-actin和ANTI-FLAG抗體為一抗,用封閉液按1∶1 000稀釋,室溫輕搖孵育2 h;TBST洗膜4次,每次孵育10 min;以HRP標記的羊抗兔IgG為二抗,用封閉液按1∶10 000稀釋,室溫輕搖孵育1 h;TBST洗膜4次,每次孵育10 min;ECL發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。

1.2.7 重組蛋白的分離純化及驗證 大量培養(yǎng)篩選到的單克隆細胞,參照文獻[14]的方法對細胞進行破碎,低溫離心取上清液按照ANTI-FLAG? M1 Agarose Affinity Gel試劑盒說明書進行純化。采用超濾的方法濃縮重組蛋白,取適量蛋白進行SDSPAGE電泳,Western blot檢測重組蛋白。

2 結(jié)果

2.1 GPC3基因的擴增

用PCR方法進行擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,其中以無菌水為模板的陰性對照組沒有出現(xiàn)擴增條帶,而以含GPC3基因的質(zhì)粒為模板,擴增到了一條長1 650 bp的片段,結(jié)果(圖1)與預期大小相一致。

圖1 GPC3基因PCR擴增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-gpc3和表達質(zhì)粒pCMV-gpc3進行EcoR Ι和BamH Ι雙酶切,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果(圖2)與預期大小相一致。質(zhì)粒pCMV-gpc3經(jīng)測序鑒定,測序結(jié)果表明插入片段與GenBank中公布的全序列中該片段完全一致,且以正確的方向插入到表達載體的克隆位點,真核表達載體質(zhì)粒pCMV-gpc3構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.3 Western blot檢測GPC3蛋白表達水平

以購買商業(yè)化兔抗GPC3多抗、兔抗人β-actin多抗和ANTI-FLAG抗體為一抗,進行Western blot分析鑒定,結(jié)果見圖3。在陽性細胞株pCMV-gpc3/293的總蛋白提取液中,無論是用兔抗GPC3多抗還是兔抗FLAG多抗,結(jié)果中都可以看到在65 kD左右的位置上有帶,而陰性細胞株pCMV-gpc3/ NC總蛋白則沒有任何顯色帶出現(xiàn),表明陽性細胞株pCMV-gpc3/293成功表達出GPC3蛋白。同時作為參照,陽性細胞株和陰性細胞株的β-actin蛋白表達基本一致。

圖3 GPC3蛋白表達Western blot分析

2.4 重組蛋白的表達和純化

將經(jīng)過純化及濃縮的重組蛋白及細胞破碎產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳,結(jié)果見圖4。由于真核細胞表達外源蛋白的水平較低,為了獲得一定量的重組蛋白,本研究大量培養(yǎng)細胞,從1014個細胞中提取純化到0.1 mg重組蛋白,鑒于得率太低,研究組計劃優(yōu)化培養(yǎng)條件,以獲得更高的得率和重組蛋白。從圖4中可以看出,經(jīng)過純化及濃縮后,得到了一個分子量約為65 kD的蛋白條帶,與Western blot檢測一致(圖5)。

3 討論

目前,我國惡性腫瘤已經(jīng)排在居民主要疾病死亡率的首位,成為影響人們健康的頭號殺手。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明2010年全國惡性腫瘤發(fā)病率為235.23/10萬。其中,肝癌(特別是原發(fā)性肝細胞癌)的死亡率僅次于胃癌,已經(jīng)成為我國的第二大癌癥[15]。發(fā)現(xiàn)并確定新的肝癌早期診斷、治療靶點具有重要的科學意義和臨床價值[16,17]。最近,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作為一種新的肝癌腫瘤標志物被國內(nèi)外研究人員提出。研究人員發(fā)現(xiàn)GPC3在多個腫瘤組織中特異表達,特別是在肝癌中的特異性高表達,使我們看到了其成為繼AFP后又一個肝癌腫瘤標志物的前景。

圖4 純化后GPC3蛋白SDS-PAGE電泳分析

圖5 純化后GPC3蛋白Western blot分析

Shirakawa等[18]利用免疫組化的方法對3種原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma HCC,intrahepatic cholangiocarcinoma ICC,combined hepatocellular and cholangiocarcinoma CHC)組織中的GPC3蛋白表達情況進行了分析,發(fā)現(xiàn)ICC病例組織中不表達GPC3蛋白,CHC病例中部分表達GPC3蛋白,而在HCC病例組織中大量表達78.3%(36/46),所以作者最終得出GPC3蛋白對于HCC具有特異性的結(jié)論。付順軍等[19]利用酶聯(lián)免疫和化學發(fā)光的方法,對健康者、肝硬化患者和肝癌確診病例血清中的GPC3和AFP含量進行了測定,發(fā)現(xiàn)健康者和肝硬化患者血清中的GPC3濃度無統(tǒng)計學差異。而肝癌患者血清中的GPC3濃度與健康者和肝硬化患者血清有顯著的差異,表明GPC3對肝癌有較高的敏感性和特異性。當GPC3以3 μg/L,AFP以20 μg/L為診斷界限時,GPC3的敏感性要高于AFP。Akutsu等[20]利用商品化的ELISA試劑盒檢測血清中的GPC3含量,發(fā)現(xiàn)健康者和乙肝患者的含量均低于閾值,HCC患者中有50%(32/64)的含量高于閾值,HCC的平均含量明顯高于非HCC。

為了探究GPC3與肝癌的關系,獲得具有自主知識產(chǎn)品的抗GPC3抗體,進而開發(fā)肝癌早期診斷方法,本研究成功構(gòu)建了真核表達載體pCMV-gpc3。經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,得到能夠穩(wěn)定表達GPC3的細胞株。最終通過高效表達、提取和純化等過程獲得了一定量純度較好的重組GPC3蛋白。選用真核表達載體p3XFLAG-CMV-14及HEK293細胞宿主是因為GPC3是一個糖蛋白,只有在真核細胞中進行表達,才能夠最接近于其天然的狀態(tài)。目前,已經(jīng)有多個研究小組利用HEK293細胞無基礎性表達GPC3的特性進行GPC3的相關研究[21,22],同時p3XFLAG-CMV系統(tǒng)是一種高效的真核表達系統(tǒng),該系統(tǒng)具有高效的強啟動子CMV啟動子,有利于目的蛋白的高效表達。并且表達的蛋白中含F(xiàn)LAG標簽,利用FLAG親和純化層析柱,能夠?qū)Ρ磉_產(chǎn)物進行純化,且純度非常高,有利于后續(xù)實驗的進行。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了真核表達載體pCMV-gpc3。經(jīng)過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染,得到能夠穩(wěn)定表達GPC3的細胞株。最終通過高效表達、提取和純化等過程獲得了一定量純度較好的重組GPC3蛋白。

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(責任編輯 李楠)

Construction of Eukaryotic Expression Vector for Glypican-3 and Its Expression in Cell

CHENG Hua1FANG Xiang-dong2CUI Shuo1WU Meng1ZHANG Zhao-jun2LI Ze-xia2
(1. Institute of Biology,Hebei Academy of Sciences,Shijiazhuang 050081;2. Beijing Institute of Genomics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101)

This work aims to construct the eukaryotic expression vector of glypican-3(GPC3)for acquiring anti-GPC3 monoclonal antibody. The GPC3 gene was amplified by PCR and was cloned into an expression vector p3XFLAG-CMV-14,and the expression vector pCMV-gpc3 was constructed. HEK293 cells were transfected with the vector by liposome,and the final results were detected by Western blot. The stably-expressed cells were collected and ground,and the high-purity GPC3 protein was obtained by affinity column. The eukaryotic expression vector of pCMV-gpc3 was constructed successfully. After the transfection to HEK293 cells,the monoclonal cell line of stablyexpressed was gained by G418 screening. Western blot analysis revealed that the target protein expressed markedly. A large number of GPC3 proteins were obtained via genetic engineering and purifying technology,which laid a foundation for the biological function and application of the protein as well as the preparation of monoclonal antibody.

glypican-3;eukaryotic expression;liposome transfection;affinity purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.05.019

2015-07-28

河北省科學院高層次人才資助項目(20150503LR62-9),河北省科學院科技計劃項目(13335)

程華,男,副研究員,研究方向:腫瘤早期診斷及相關機理;E-mail:cheng_hua@sina.com

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