趙錫武　劉　鑫　榮　輝　于興勝　劉　通　楊長生　趙廷寶

濟南軍區(qū)總醫(yī)院脊髓修復科　濟南　250031

神經干細胞和骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷效果與機制對比

趙錫武劉鑫榮輝于興勝劉通楊長生趙廷寶△

濟南軍區(qū)總醫(yī)院脊髓修復科濟南250031

【摘要】目的比較神經干細胞和骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷的機制及實驗效果。方法選擇40只Wistar成年大鼠做脊髓半橫切模型，隨機分為神經干細胞注射組，骨髓間充質干細胞注射組，磷酸鹽緩沖液注射組和假手術組，每組10只。對比4組大鼠移植后的運動功能和脊髓損傷的修復情況。結果神經干細胞注射組各個時間點的BBB評分明顯高于骨髓間充質干細胞注射組，且2組BBB評分明顯高于磷酸鹽緩沖液注射組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；神經干細胞和骨髓間充質干細胞移植后的第8周，MRI顯示空洞明顯縮小，信號強度正常，能看到完整的脊髓，脊髓切片中能看到被標記的NSCs及BMSCs。結論脊髓損傷大鼠通過靜脈注射NSCs和BMSCs均能改善運動功能，但NSCs治療效果更為明顯，應將兩種方法結合起來，進一步提高治療效果。

【關鍵詞】神經干細胞；骨髓間充質干細胞；脊髓損傷；大鼠；BBB評分

脊髓損傷為中樞神經系統(tǒng)的嚴重創(chuàng)傷，很難自我修復，干細胞移植是最為有效的治療方法[1]。相關實驗證明，神經干細胞(NSCs)可以促進損傷脊髓的修復，但涉及到倫理學、來源等問題，應用數(shù)量受到限制[2]。骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植對脊髓損傷有一定治療作用，而且BMSCs可以從患者自身體內獲得，不涉及倫理學方面的問題。本組研究對選擇的40例成年Wistar大鼠建立脊髓半橫切模型，分別采用神經干細胞和骨髓間充質干細胞移植進行治療，現(xiàn)將具體實驗過程和結果介紹如下。

1實驗材料和方法

1.1BMSCs的取材和培養(yǎng)實驗材料：WISTAR大鼠、75%酒精、Hanks液、MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、凍存液、超凈工作臺、LSI90型臺式離心機、電子精密天平、CO2恒溫培養(yǎng)箱、過濾網、倒差顯微鏡、培養(yǎng)瓶、手術中所用的器械和無菌醫(yī)用工具等。

取材、分離及培養(yǎng)：(1)處死WISTAR大鼠，全身浸入75%酒精中進行皮膚消毒，浸泡5 min后取出，置于無菌培養(yǎng)皿中轉移到超凈工作臺。(2)更換無菌手套，器械行消毒滅菌處理。(3)剪開皮膚，分離筋膜并離斷股骨和脛骨，將表面肌肉和筋膜游離出來，浸入Hanks液中，再取出對側脛骨與股骨。(4)更換無菌手套后用無菌鑷從Hanks液中取出雙側股骨及脛骨，放到無菌紗布上，將Hanks液擦干。(5)將骨髓腔暴露出來，吸取BMSCs培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔和4根長骨，收集沖洗液過濾后將過濾液進行收集。(6)過濾液離心去上清，加入5 mL培養(yǎng)基混勻沉淀。(7)將細胞懸液進行稀釋后接種到75 mL培養(yǎng)瓶中，防到37 ℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(8)進行原代第2代及后代培養(yǎng)，每隔72 h進行換液，收集、凍存或繼續(xù)接種培養(yǎng)好的細胞。

根據(jù)國際細胞治療學會的標準進行鑒定：可以貼壁生長；有特異的表面抗原表達；具有多向分化潛能。光鏡下能看見培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長；第3代和第9代細胞可以檢測出有特異細胞表面標記表達；誘導劑成功后，用油紅及ALP鈣-鉆法分別進行染色，鑒定細胞種類。

1.2NSCs的分離培養(yǎng)實驗材料：手術器械、培養(yǎng)皿、超凈工作臺、過濾網、恒溫搖床和離心機等和骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)材料一樣，另外有WISTAR雌、雄大鼠、苦味酸、酒精、蒸餾水、0.01 M PBS液(磷酸鹽緩沖液)、解剖顯微鏡、微鑷、DMEM/F12培養(yǎng)基等。

孕鼠繁殖：在小鼠四肢、背部等部位進行標記，配置苦味酸液，將成年大鼠以雄雌1∶2的比例合籠，第2天檢查陰栓，如果在雌鼠陰道口看到乳白色的同體即為“陰栓”。取材、分離和培養(yǎng)：取孕12～13 d的WISTAR大鼠并處死，放入超凈工作臺之前的步驟和BMSCs一致；將孕鼠腹膜、腹腔、盆腔等臟器分別暴露出來；將孕鼠子宮放入平皿中，浸入預冷0.01 M PBS中；將胎鼠取出，放入另外一個平皿中，浸入預冷0.01 M PBS中；將胎腦分離，用PBS沖洗后剝除腦膜，將全腦組織剪碎后放入試管中，用0.125%的胰酶和DNA酶放到37 ℃的恒溫搖床消化5 min；制成單細胞懸液離心10 min，棄除上清液，進行重懸后過濾，調整細胞密度后接種到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)；當發(fā)現(xiàn)細胞形成懸浮神經球時表明培養(yǎng)成功；進行接種傳代，5～7 d傳代1次，然后收集、凍存或繼續(xù)接種培養(yǎng)。

鑒定：光鏡觀察細胞生長情況，檢測Nestin表達，放入10% FBS和多聚賴氨酸包被的玻片培養(yǎng)5 d，光鏡觀察玻片，檢測APC、MAP2的表達。

1.3Brdu標記BMSCs及NSCs第3代BMSCs和BMSCs進入對數(shù)生長期時，加入BrdU(終濃度10 mmol/L)，移植前將細胞制成PBS懸液，檢測BrdU陽性細胞率。

1.4實驗動物造模及干細胞移植動物分組：選擇Wistar成年雄性大鼠40只，體質量230～250 g，隨機分為NSCs注射組，BMSCs注射組，PBS注射組和假手術組，每組10只，其中假手術組不做任何處理，其他3組造模后脊髓分別移植NSCs、BMSC和注射PBS，均為尾靜脈注射。

大鼠脊髓損傷模型的制作和干細胞移植：將大鼠T9-11節(jié)段做好標記，更換無菌手套，進行消毒鋪巾；完全暴露T9-11節(jié)段并向頭尾各延長一節(jié)段，將T10棘突和椎板咬去，暴露脊髓；用虹膜刀片橫斷右側脊髓，充分止血后依次縫合各層組織，消毒后包扎傷口，術中密切觀察大鼠生命體征；術后補液、給予抗生素，每天為大鼠按摩膀胱，幫助大鼠恢復排尿功能。制備細胞懸液，術后第7～9天，對尾靜脈注射1 mL細胞懸液。

1.5術后評估運動功能評價：采用BBB運動功能評分，每周進行1次，共觀察8周。BBB滿分為21分，得分越低表示運動功能越差。影像學檢查：所有大鼠每周進行1次磁掃描觀察脊髓損傷的修復情況。組織學鑒定和免疫熒光染色：術后8周在光鏡下觀察組織切片，標本行冰凍切片，并行抗Br-dU、DAPI免疫熒光染色，觀察移植細胞的遷入情況。

2結果

2.14組大鼠術后各個時間點BBB評分的變化NSCs注射組、BMSCs注射組和PBS注射組大鼠的下肢功能均有不同程度的恢復。NSCs注射組的下肢功能恢復最好，各個時間點的BBB評分均明顯高于BMSCs注射組和PBS注射組，而BMSCs注射組又明顯高于PBS注射組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；3組大鼠BBB評分隨時間的推移，均有不同程度提高。見表1。

表1　4組大鼠術后各個時間點BBB評分變化±s，分)

注：和PBS組比較，aP<0.05；和BMSC組比較，bP<0.05

2.2機械通氣后的相關指標變化本組40只大鼠均造模成功，術后無死亡情況。MRI觀察脊髓損傷后第7天橫斷處有缺損和空洞明顯，信號較低。NSCs和BMSC移植后的第8周，MRI顯示空洞明顯縮小，信號強度正常，能看到完整的脊髓。脊髓損傷后第1周HE染色切片顯示受損節(jié)段的脊髓組織有較多空隙，第8周HE染色切片顯示，受損脊髓組織的空洞被炎性細胞、肉芽組織填充，可能有干細胞遷移到此處。

3討論

目前脊髓損傷最為有效的治療方法是干細胞移植，神經干細胞治療效果較好，但數(shù)量有限，而且存在倫理學的問題，因此要尋找新的干細胞來源才能從根本上解決這些問題。近年來，骨髓間充質干細胞對脊髓損傷的開始受到相關專家的重視，骨髓間充質干細胞能從自身的骨髓組織中提取到，還可從他人的捐贈中得到，來源比較廣泛，而且沒有倫理學方面的問題[3-4]。相關實驗研究已經證實，骨髓組織具有較強的再生能力，而且骨髓間充質干細胞具有多向分化的潛能，能向神經組織分化，促進脊髓損傷的修復，骨髓間充質干細胞還能保持干細胞特異性的分子標記，還具有自我更新的能力[5]。

本研究結果顯示，NSCs注射組和BMSCs注射組大鼠術后各個時間點的BBB評分明顯高于PBS注射組，而且NSCs注射組術后各個時間點的BBB評分最高，3組大鼠BBB評分隨時間的推移，均有不同程度的提高，研究結果提示，骨髓間充干細胞和神經干細胞均可以明顯的改善脊髓損傷大鼠的運動功能，神經干細胞組的恢復較骨髓間充干細胞組要好。本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然假手術組未經任何治療，但運動功能的一部分可以自行恢復，只是恢復程度較低[6]。但在人體當中，一旦脊髓受到損傷，患者運動和感覺功能會嚴重受損，且恢復非常緩慢，這和大鼠相比具有明顯的差別，因此提示進行相關研究時，要注意動物和人的差別，不能輕易將動物實驗結果推廣到人[7]。

BMSCs對脊髓損傷的修復機制目前普遍認為是由于以下幾個方面：BMSCs移植后分化為神經元使髓鞘重新產生，分泌神經營養(yǎng)因子[8]。研究[9]顯示，將BMSCs注射到長期癱瘓的大鼠，2個月后觀察到損傷的脊髓空洞被BMSCs標記的組織塊填充，而且表達神經元和神經膠質細胞的標記蛋白。另有研究[10]顯示，BMSCs移植到脊髓脫髓鞘的大鼠后，在體內能形成有功能的髓鞘細胞。

本組40只大鼠均造模成功，并全部成活，MRI顯示脊髓損傷后第7天橫斷處有缺損和空洞明顯，低信號。干細胞移植后的第8周，空洞明顯縮小，信號正常，并能看到完整的脊髓。脊髓損傷后第8周HE染色切片顯示，受損脊髓組織的空洞被炎性細胞、肉芽組織填充，此處可能有干細胞遷移。雖然BMSCs移植修復大鼠脊髓損傷的效果沒有NSCs移植的效果好，但可通過改進BMSCs的移植方案或采取綜合移植方案提高治療效果。

本研究認為，骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷不能只限于單一的細胞移植，而應該從組織工程學的角度出發(fā)，考慮綜合移植的方案。在開展研究前應要建立標準的治療規(guī)范，使研究的結果更為準確和有意義。

4參考文獻

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(收稿2015-08-11)

Comparative of the effects and mechanisms of neural stem cells and bone marrow-derived stem cells transplantations in the treatment of spinal cord injury

ZhaoXiwu，LiuXin，RongHui，YuXingsheng，LiuTong，YangChangsheng，ZhaoTingbao

DepartmentofSpinalCordRestoration，GeneralHospitalofJinanMilitaryArea，Jinan250031，China

【Abstract】Objective To compare the effects and mechanisms of neural stem cells (NSCs) and bone marrow-derived stem cells (BMSCs) transplantations in the treatment of spinal cord injury. Methods Forty adult Wistar rats with the hemi-transection of spinal cord were randomly divided into group A (injected with NSCs)， group B (injected with BMSCs)， group C (injected with phosphate buffer) and group D (sham-operation group)， 10 rats per group. The motor function and the restoration of the injured nerves of the four groups after transplantation were comparatively observed. Results BBB scores of group A at each time point were significantly higher than that of group B， furthermore， both the group A and group B hold higher BBB scores than group C (P<0.05)； In the 8thweek after transplantation of neural stem cells or MSCs， MRI indicated that the hole was significantly reduced with normal signal strength， complete spinal cord were seen and the labeled NSCs and BMSCs were found in spinal cord slices. Conclusion Intravenous injection of NSCs or BMSCs can improve motor function in rats with spinal cord injury， and the treatment effect is more obvious in NSCs group. The combination of two stem cells may have better therapeutic effect.

【Key words】Neural stem cells； Bone marrow-derived stem cells； Spinal cord injury； Rat； BBB score

通訊作者：△趙廷寶，博士后，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導師，現(xiàn)任濟南軍區(qū)總醫(yī)院全軍創(chuàng)傷骨科研究所副所長兼脊髓修復科主任，研究方向：脊柱外科，骨缺損修復。E-mail：doctorzhaotingbao@163.com

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)09-0015-03