何忠俊，黃希，梁社往，張興芬，楊生超

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處，云南 昆明 650201

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滇重樓根莖皂苷含量與生態(tài)因子的關(guān)系

何忠俊1，黃希1，梁社往2，張興芬1，楊生超3*

1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處，云南 昆明 650201

摘要：研究了生態(tài)因子對滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）根莖總皂苷含量的影響，確定了影響其總皂苷含量的主導(dǎo)生態(tài)因子，將為滇重樓GAP基地建設(shè)和關(guān)鍵栽培技術(shù)確定提供科學(xué)依據(jù)。以采自云南、貴州、四川30個縣（市）32個樣點滇重樓根莖為研究對象，采用高效液相色譜及常規(guī)土壤農(nóng)化分析法，通過相關(guān)分析、逐步回歸、通徑分析和決策分析等的逐層剖析，研究了地理氣候因子、土壤理化性質(zhì)和肥力——共計33個生態(tài)指標與滇重樓根莖總皂苷含量的數(shù)量關(guān)系。結(jié)果表明：供試滇重樓根莖總皂苷含量平均為1.389%，合格率為75.0%。經(jīng)度、緯度和土壤陽離子交換量（CEC）是影響滇重樓根莖總皂苷含量的主導(dǎo)生態(tài)因子，但三者只能決定總皂苷含量43.27%的變異?？傇碥蘸颗c經(jīng)緯度呈顯著負相關(guān)，與CEC呈顯著正相關(guān)。三者均為總皂苷含量的決策因子，緯度為最主要決策因子。說明滇重樓根莖總皂苷含量具有一定的地域特征，滇西和滇西南總皂苷含量較高。滇重樓適宜種植在土壤有機質(zhì)和粘粒含量高，土壤pH在中性范圍的土壤上。

關(guān)鍵詞：滇重樓；根莖；皂苷含量；生態(tài)因子

引用格式：何忠俊， 黃希， 梁社往， 張興芬， 楊生超. 滇重樓根莖皂苷含量與生態(tài)因子的關(guān)系［J］. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報， 2016， 25（3）: 409-414.

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藥用植物藥效成分多為次生代謝產(chǎn)物，次生代謝物質(zhì)在植物體內(nèi)的合成和累積是在植物具有相關(guān)基因的基礎(chǔ)上和一定的環(huán)境條件的脅迫和誘導(dǎo)作用的結(jié)果（蘇文華等，2005；曾燕等，2012）。選擇具有一定環(huán)境壓力的次適宜生態(tài)環(huán)境是解決藥用植物栽培中生長和次生產(chǎn)物累積的矛盾的有效途徑（Yan et al.，2004；謝彩香等，2011）。因此，藥用植物藥效成分最高的地域并非生長最好的地域。研究表明，日照時數(shù)、海拔和年降水量是影響羌活（Notopterygium incisum）藥效成分累積的主要生態(tài)因素（黃林芳等，2013）。溫度在人參（Panax ginseng）皂苷類形成中起決定性作用，在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度越低越有利于人參皂苷的積累（賈光林等，2012）。土壤類型是影響枸杞（Lycium barbarum）多酚類含量的主要因素（Dong et al.，2012）。迄今，關(guān)于不同生態(tài)環(huán)境下滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）藥效成分及其與生態(tài)因子的耦合關(guān)系尚缺乏深入系統(tǒng)的研究，嚴重影響了滇重樓GAP基地建設(shè)和人工栽培技術(shù)的規(guī)范化。

滇重樓為延齡草科（Trilliaceae）重樓屬（Paris）多年生草本植物，主要分布于我國云南、四川和貴州一帶，常生長在海拔1400～3100 m的常綠闊葉林、云南松林、竹林、灌叢或草坡中，主產(chǎn)區(qū)在云南，是我國西南地區(qū)的重要藥材（李恒，1998）。滇重樓以根狀莖入藥，是《中國藥典》（2010年版）重樓藥材的主要來源植物，以薯蕷（Dioscorea opposita）皂苷（Ⅰ、Ⅱ）和偏諾皂苷（Ⅵ、Ⅶ）之和≥0.6%為其質(zhì)量控制標準。滇重樓具有抗癌、清熱解毒、消腫止痛和止血等作用，治療跌打損傷有獨特療效，是“云南白藥”、“季勝德蛇藥片”、“熱毒清”和“宮血寧”等多種中成藥的主要原料之一（武珊珊等，2004）。重樓中的甾體皂苷是其主要的活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有良好的抗腫瘤活性（王羽，2008；顏璐璐等，2009）。近年來市場對滇重樓的需求量急劇上升，由于長期過度采挖，野生資源銳減，滇重樓的人工栽培技術(shù)研究正逐步被開展，規(guī)?；N植成為制藥企業(yè)的發(fā)展趨勢（何忠俊等，2009；何忠俊等2011）。滇重樓的藥效成分甾體皂苷含量受地理環(huán)境、土壤和氣候的影響而存在差異，加之滇重樓生長緩慢，從種子萌發(fā)到入藥需要10年左右的時間，從而導(dǎo)致重樓質(zhì)量不穩(wěn)定（李海濤等，2014），人工種植難度大，成本高。本研究在滇重樓主產(chǎn)區(qū)——云南、貴州、四川30個縣（市），采集32個滇重樓根莖樣品及其根區(qū)土壤樣品為研究對象，通過相關(guān)分析、逐步回歸、通徑分析和決策分析等逐層剖析，研究了地理氣候因子、土壤理化性質(zhì)和肥力——共計33個生態(tài)指標與滇重樓總皂苷含量的數(shù)量關(guān)系。篩選出了影響總皂苷含量的主導(dǎo)生態(tài)因子，并明確了其作用大小和方向、決定性因子和限制性因子，建立總皂苷含量與主導(dǎo)生態(tài)因子預(yù)測模型，以期為滇重樓GAP基地建設(shè)和關(guān)鍵栽培技術(shù)確定提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 滇重樓主要分布區(qū)采樣和調(diào)查

表1 采樣點基本情況Table 1 The basic condition of sampling sites and total saponin content in rhizome of Paris polyphylla var. yunnannensis

查閱相關(guān)資料，在滇重樓主要分布區(qū)——云南（滇西北、滇西、滇東北、滇中、滇東南、滇西南）、貴州、四川30個縣（市），采集32個地域滇重樓植株及其根區(qū)土壤樣品。除江口和梵凈山（海拔差異近2000 m）、昆明西山（原始居群分布面積大）和昆明安寧市（人工種植面積較大）位于同一縣（市）外，其余28個樣點分別位于不同縣（市）。每個地域選擇滇重樓栽培面積較大或自然分布較廣的3個以上基地或居群，海拔差異控制在100 m內(nèi)，共采集9～12株植物混合成該地域樣品，同時采集根區(qū)土壤樣品（采樣點基本情況見表1）。植株樣品帶回實驗室，用自來水、洗潔精洗去泥土，然后用含1%檸檬酸的蒸餾水清洗去表面附著的礦質(zhì)元素，最后用蒸餾水沖洗干凈，莖葉、根莖、須根分開稱鮮重，60 ℃烘干、稱重、粉碎，根莖樣品用于皂苷組分含量測定。土壤樣品帶回實驗室風干后，過0.25 mm、2 mm尼龍篩備用。

現(xiàn)場測定透光率、坡度、經(jīng)度、緯度、海拔；氣象資料（年均濕度、年日照時數(shù)、年降水量、活動積溫、年均溫、七月最高溫、七月平均溫、一月最低溫、一月平均溫）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥用植物研究所TCM-GIS1系統(tǒng)根據(jù)經(jīng)緯度和海拔計算得出。

1.2 樣品分析

土壤全N采用H2SO4-H2O2消煮，凱氏定氮法；土壤全P、全K采用NaOH熔融，鉬銻抗比色法測P，火焰光度法測K；土壤速效N采用堿解擴散法；土壤速效P采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提，鉬銻抗比色法；土壤速效K采用CH3COONH4浸提，火焰光度法；土壤有機質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法；土壤pH采用土水比1∶5浸提，pH計測定；土壤交換性Ca、Mg采用乙酸銨-氯化鍶浸提，原子吸收分光光度法；土壤有效態(tài)Cu、Zn、Fe、Mn采用DTPA-TEA-CaCl2緩沖液浸提，原子吸收光度法；土壤有效態(tài)S采用比濁法；土壤有效態(tài)B采用甲亞銨比色法；土壤有效態(tài)Mo采用硫氰酸銨比色法（鮑士旦，2005）。

HPLC法測定皂苷組分：滇重樓根莖4種皂苷含量測定采用劉歡等（2012）方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

全部試驗數(shù)據(jù)采用Excel、DPS軟件（唐啟義等，2007）進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

表1表明，云、貴、川32個采樣點滇重樓根莖總皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ）平均值為1.389%，變異系數(shù)為61.40%，有8個樣品總皂苷含量低于中華藥典（國家藥典委員會，2010）的標準，占25.0%，達到中華藥典（國家藥典委員會，2010）要求的占75.0%。

2.1 地理氣候因子與滇重樓根莖總皂苷含量的相關(guān)性

滇重樓分布區(qū)地理氣候因子統(tǒng)計結(jié)果（表2）表明，滇重樓主要分布在東經(jīng)102.26°±2.77°、北緯25.99°±1.54°、海拔（2043.84±543.85）m的范圍，分布的海拔范圍比李恒（1998）報道廣些。以一月低溫差異最大，其次為坡度、一月均溫和透光率，其余氣候地理因子變異較小，說明滇重樓適生的地理范圍較窄。

滇重樓根莖總皂苷含量與一月均溫和日照分別呈極顯著和顯著正相關(guān)，與緯度和經(jīng)度分別呈極顯著和顯著負相關(guān)，與地理氣候因子的偏相關(guān)均不顯著（表2）。

2.2 土壤因子與滇重樓根莖總皂苷含量的相關(guān)性

滇重樓分布區(qū)土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分狀況（表3）表明，土壤速效銅、速效鋅變幅很大，變異系數(shù)在100.67%～113.39%，其次為全磷、全鉀、速效磷、速效鉀、有效錳和有效硫，變異系數(shù)在70.88%～95.27%之間，以土壤pH變幅最小，變異系數(shù)為14.94%。說明滇重樓分布區(qū)土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分狀況差異很大，土壤pH在4.28～7.28之間。

滇重樓根莖總皂苷含量與土壤因子的單、偏相關(guān)研究（表3）表明，總皂苷含量與全氮、土壤陽離子交換量（CEC）呈顯著正相關(guān)，與土壤因子的偏相關(guān)均不顯著。

2.3 滇重樓總皂苷含量與生態(tài)因子的逐步回歸和通徑分析

表2 地理氣候因子與滇重樓根莖總皂苷含量的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation analysis between geographical-climatical factors and total saponin content in rhizome of Paris polyphylla var.yunnannensis

如果兩個變量之間相關(guān)程度不高，擬合回歸方程便沒有意義。因此，相關(guān)分析往往在回歸分析前進行（陳勝可，2010）。在選擇評判指標時，應(yīng)該選擇相關(guān)性顯著的指標，使回歸方程收斂性更好，更能反映因變量對自變量的影響程度（唐啟義等，2007）。以往關(guān)于生態(tài)因子與中藥材有效成分關(guān)系的研究，大多是從分析土壤或氣候因子與藥效成分的相關(guān)性進行的，主要以單相關(guān)系數(shù)高低判斷其重要性大小（郭蘭萍等，2014；謝彩香等，2011）。這種分析方法是片面的，結(jié)論也是不確切的。偏相關(guān)系數(shù)是在排除其他因素的影響，僅研究兩者之間的相關(guān)，比單相關(guān)系數(shù)更能說明兩者的線性相關(guān)程度（李宗梅等，2011）。鑒于國內(nèi)外有關(guān)研究多以單相關(guān)研究為主，本研究采用單偏相關(guān)結(jié)合的方法，進一步確證和篩選出更多影響皂苷組分含量的因子，更為全面地反映對總皂苷含量影響顯著的生態(tài)因子。

表3 土壤因子與滇重樓根莖總皂苷含量的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation analysis between soil factors and total saponin content in rhizome of Paris polyphylla var.yunnannensis

選取對根莖總皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅵ+Ⅶ）含量影響顯著的生態(tài)因子：經(jīng)度（X1）、緯度（X2）、日照時數(shù)（X3）、一月均溫（X4）、土壤全氮（X5）、CEC（X6）進行回歸分析，得到回歸方程如下：

方程復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.6578，決定系數(shù)R2= 0.4327，P=0.0011，Durbin-Watson統(tǒng)計量d=2.3679。各入選因子偏回歸系數(shù)均達到顯著水平（見表4），說明方程可靠性高（唐啟義等，2007）。但以上3個入選因子只能解釋總皂苷變異的43.27%。從入選因子看，總皂苷含量主要受經(jīng)緯度和土壤陽離子交換量的影響。

單相關(guān)系數(shù)r可以分解為直接通徑系數(shù)P和間接通徑系數(shù)p（卜靜等，2012）：

通徑分析（表4）表明，3個入選因子對總皂苷含量的直接通徑系數(shù)的絕對值相近，其中經(jīng)度（X1）、緯度（X2）對總皂苷含量的直接作用是負效應(yīng)，CEC對總皂苷含量的直接作用是正效應(yīng)。間接作用總和較小，且和直接作用方向一致。

表4 滇重樓根莖總皂苷含量與生態(tài)因子的通徑分析Table 4 Path analysis between total saponin content in rhizome of Paris polyphylla var. yunnannensis and ecological factors

決策系數(shù)是反映自變量對因變量綜合作用大小的參數(shù)，利用決策系數(shù)可以對通徑分析結(jié)果進行明確地判斷，并確定主要決定性變量和限制性變量（于建軍等，2009），決策系數(shù)的計算公式為：

Pi為直接通徑系數(shù)，riy為單相關(guān)系數(shù)。3個入選因子決策系數(shù)大小順序為：R> R> R，均為正值，說明經(jīng)度、緯度、CEC為總皂苷含量的決策因子，緯度為最主要決策因子。

3 討論

本研究結(jié)果表明，達到中華藥典（國家藥典委員會，2010）要求的樣品占75.0%，總皂苷含量最高的區(qū)域在經(jīng)緯度較低（滇西南）的區(qū)域。此結(jié)果與尹鴻翔等（2007）報道的滇重樓合格藥材比例及分布區(qū)域不一致?？赡芘c其采樣范圍僅限于川西、攀西和滇西北一帶，或?qū)χ貥瞧贩N區(qū)分不嚴格（購于藥店，并非真正的滇重樓）有關(guān)。李海濤等（2014）對云南不同地區(qū)22個滇重樓根莖樣品進行了皂苷含量分析，總皂苷含量最高的樣點在滇西的瑞麗和滇西南的耿馬和祥云，與本研究的結(jié)果基本一致。目前，在云、貴、川建立了許多重樓種植基地，以云南省各地重樓基地的面積和數(shù)量最多，且多以滇重樓為主。西雙版納海拔800 m以上的區(qū)域滇重樓分布最多，是滇重樓的主要分布區(qū)之一（張麗霞等，2010）。因此，滇重樓藥效成分最高區(qū)域的確定，對重樓GAP基地建設(shè)和規(guī)范化栽培具有重要的指導(dǎo)意義。

由于以往研究和本研究尺度和范圍及采用的標準不同，得出的結(jié)論并不完全一致。本研究結(jié)果表明，經(jīng)度、緯度和CEC是影響滇重樓藥材總皂苷含量的主導(dǎo)生態(tài)因子。滇重樓總皂苷含量與經(jīng)緯度呈顯著負相關(guān)，與土壤陽離子交換量（CEC）呈顯著正相關(guān)。但經(jīng)度、緯度、CEC只能解釋滇重樓總皂苷含量43.27%的變異?？梢?，滇重樓總皂苷含量具有一定地域特征，但地域依賴性并不十分強烈。經(jīng)緯度綜合反映光照、溫度、降水和濕度等生態(tài)因子，回歸方程表明，緯度、經(jīng)度越低，滇重樓總皂苷含量越高。CEC主要反映了土壤有機質(zhì)、粘土礦物類型、質(zhì)地、pH等指標，CEC值與土壤有機質(zhì)含量、2∶1型粘土礦物含量、粘粒含量、土壤pH呈顯著正相關(guān)（張乃明，2013）。此結(jié)果和滇重樓總皂苷含量與土壤有機質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)（楊永紅等，2012），隨土壤pH增加總皂苷含量呈增加趨勢（毛玉東等，2011）的報道一致。此外，滇重樓皂苷組分含量還受其他生態(tài)因子的影響，如土壤養(yǎng)分（何忠俊等，2009；何忠俊等，2010；何忠俊等，2011）、菌根浸染（段艷濤等，2011；周濃等，2015）、采收季節(jié)和生長年限（王躍虎等，2015）等，只是其影響相對較小而已。

4 結(jié)論

云南、貴州、四川30個縣（市）32個樣點滇重樓根莖總皂苷平均值為1.389%，達到中華藥典（國家藥典委員會，2010）要求的樣本占75.0%。滇重樓根莖總皂苷含量主要受經(jīng)、緯度和CEC的影響，三者均為總皂苷含量的決策因子，緯度為最主要決策因子。經(jīng)、緯度和土壤CEC只能解釋總皂苷含量43.27%的變異，說明滇重樓根莖總皂苷含量具有一定的地域特征，以滇西南和滇西總皂苷含量較高。滇重樓種植區(qū)土壤有機質(zhì)和粘粒含量要高、土壤pH應(yīng)控制在中性范圍為宜。

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Relationships between Total Saponin Content in Rhizome of Paris polyphylla var. yunnannensis and Ecological Factors

HE Zhongjun1， HUANG Xi1， LIANG Shewang2， ZHANG Xingfen1， YANG Shengchao3*
1. College of Resource and Environment，Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China；2. College of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China；3. Sci-Tech Bureau， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China

Abstract:This paper explored the effect of ecological factors on saponin contents in rhizome of Paris polyphylla var. yunnannensis，and determined the leading ecological factors which affect total saponin contents in rhizome， which will provide scientific evidence for the construction of GAP cultivation base and the selection of key cultivation technique of Paris polyphylla var. yunnannensis. Based on 32 rhizome samples of Paris polyphylla var. yunnannensis taken from 30 county in Yunnan，Guizhou and Sichuan province and corresponding rhizosphere soil samples， adopted HPLC to test saponin contents and used regular soil analyzing technique to test soil property and fertility index， and derived the corresponding geographical and meteological data from GIS for Traditional Chinese Medicine database， the quantitative relationships between total saponin contents and 33 ecological factors were studied using the step by step comprehensive research methods of correlation， stepwise regression， path analysis， decision analysis. The results indicated that average saponin contents was 1.398%， among which the ratio up to national standard was 75%. Latitude， longitude and soil CEC were the leading ecological factors affecting the saponin contents in rhizome， but which only controlled 43.27% changes of saponin contents in rhizome. There were significant negative correlation between total saponin contents and latitude or longitude， and significant positive correlation between total saponin contents and soil CEC. Latitude， longitude and soil CEC also were decisive factors of total saponin contents， and latitude was the most decisive factor for total saponin contents in rhizome. Total saponin contents in rhizome had certain regional feature， of which higher region located in west and southwest area of Yunnan. The planting base for Paris polyphylla var. yunnannensis should had high soil organic matter and clay， as well as neutral soil pH.

Key words:Paris polyphylla var.yunnannensis； rhizome； saponin content； ecological factors

DOI:10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.03.007

中圖分類號：R931.2； X17

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5906（2016）03-0409-06

基金項目：云南省發(fā)改委高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展計劃項目（20121956）；國家自然科學(xué)基金項目（81260613；30873374）

作者簡介：何忠?。?962年生），男，教授，博士，研究方向為藥用植物栽培。E-mail: hezhongjun@hotmail.com

*通信作者。E-mail: shengchaoyang@163.com

收稿日期：2016-01-25