沈業(yè)彤　張學(xué)斌　吳麗紅　劉果彤　王　琳　陶敏燕　徐鳳琳

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科，黑龍江　齊齊哈爾　161041)

重組人骨保護(hù)素Fc融合蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折早期愈合的影響

沈業(yè)彤張學(xué)斌吳麗紅劉果彤王琳陶敏燕徐鳳琳

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科，黑龍江齊齊哈爾161041)

〔摘要〕目的通過(guò)對(duì)去勢(shì)的骨質(zhì)疏松(OP)大鼠股骨骨折模型局部應(yīng)用重組人骨保護(hù)素 Fc 融合蛋白(OPG-Fc)，探討調(diào)節(jié)骨保護(hù)素(OPG)和核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達(dá)變化對(duì)OP性骨折早期愈合的影響。方法以去勢(shì)方法建立OP雌性SD大鼠模型，選擇75只OP大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及假手術(shù)組,每組25只。建立大鼠股骨骨折模型,實(shí)驗(yàn)組骨折局部注射OPG-Fc，對(duì)照組骨折局部注射生理鹽水，假手術(shù)組單純切開(kāi)至股骨后縫合，不形成骨折，于術(shù)后第7天、第14天、第28天、第42天、第56天5個(gè)時(shí)間節(jié)段分批行心臟采血并處死模型,血清標(biāo)本行血清堿性磷酸酶(ALP)的分光光度法測(cè)定；股骨骨折處標(biāo)本切片后通過(guò)HE染色觀察骨折愈合情況,免疫組織化學(xué)染色分析破骨細(xì)胞數(shù)量變化情況；分別于第28天及第56天測(cè)定各組骨密度(BMD)將各組測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果大體標(biāo)本HE染色實(shí)驗(yàn)組骨痂形成及改造較對(duì)照組提前,對(duì)照組骨折愈合明顯遲延，免疫組織化學(xué)染色顯示在第7天、第14天、第28天各個(gè)時(shí)間節(jié)段實(shí)驗(yàn)組破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)值均低于對(duì)照組(P<0.05)；ALP血清濃度在假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)波幅很小，對(duì)照組濃度于術(shù)后第14天開(kāi)始升高，至第28天至高峰，隨后漸降，實(shí)驗(yàn)組大鼠ALP 血清濃度變化規(guī)律與對(duì)照組的變化相似，但在第14和28天時(shí)數(shù)值增高明顯(P<0.05)，第42天及第56天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)值及ALP濃度值均趨同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BMD在第28天和第56天時(shí)對(duì)照組明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。結(jié)論OPG-Fc具有成骨活性增高與破骨活性降低的雙重作用，促進(jìn)骨折愈合，尤其在OP性骨折早期治療中具有重要意義。

〔關(guān)鍵詞〕骨質(zhì)疏松性骨折；愈合；骨保護(hù)素Fc融合蛋白；核因子-κB受體活化因子配體

骨質(zhì)疏松性骨折(OPF)不僅發(fā)病率高，病殘率、死亡率及平均醫(yī)療支出費(fèi)用均較普通創(chuàng)傷性骨折顯著增高〔1〕，在OPF愈合過(guò)程中，成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞功能狀態(tài)低下，導(dǎo)致骨皮質(zhì)薄、骨痂少、生物力學(xué)性能下降，而易發(fā)生內(nèi)固定物失效及再骨折等嚴(yán)重并發(fā)癥。以往研究大多側(cè)重于OPF后期如何增加骨密度(BMD)方向，很少有針對(duì)骨折愈合早期階段在微觀水平上進(jìn)行相關(guān)研究。傳統(tǒng)的抗骨質(zhì)疏松(OP)藥物主要分三類：抗骨吸收類藥物、促骨形成類藥物和骨鈣化類藥物〔2～4〕。目前諸多學(xué)者認(rèn)為，許多細(xì)胞因子、激素等影響因素均可通過(guò)骨保護(hù)素(OPG)的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達(dá),從而調(diào)控OPG、RANKL和核因子-κB受體活化因子(RANK)之間的比值,直接對(duì)破骨細(xì)胞的分化和功能產(chǎn)生決定性作用，來(lái)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活性及凋亡過(guò)程，并且OPG在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中也有著重要的促進(jìn)作用，這種既抗骨吸收又促骨形成的雙重作用，為OPF的治療開(kāi)辟了一條新途徑，本文探討重組人骨保護(hù)素Fc融合蛋白(OPG-Fc)對(duì)OPF早期愈合的影響。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑重組人OPG-Fc劑型(50 μg/支)、二甲苯溶液、蜂蠟、酒精溶液、蘇木精染液、石蠟溶液、1%鹽酸乙醇、1%伊紅酒精溶液、樹(shù)膠等。 TRAP 免疫組化染色試劑盒。堿性磷酸酶(ALP)測(cè)定試劑盒。健康雌性3個(gè)月齡SD大鼠75只,體重265～310 g,由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究室提供。

1.2動(dòng)物分組和模型選擇75只大鼠行去勢(shì)手術(shù)，備皮后以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，于下腹中部切開(kāi)皮膚，逐層鈍性分離腹肌、打開(kāi)腹膜，探查卵巢并結(jié)扎后摘除，縫合切口，術(shù)前及術(shù)后肌注慶大霉素一次預(yù)防感染。飼養(yǎng)于溫度20℃～25℃、濕度60%～70%環(huán)境中，食、水適量，8 w后經(jīng)骨密度(BMD)儀檢測(cè)篩選，將造模成功大鼠75只隨機(jī)分組，分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、假手術(shù)組，每組25只并標(biāo)記。以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，備皮后取右大腿外側(cè)切口,鈍性分離至股骨干,經(jīng)股骨中段(大轉(zhuǎn)子下1.5 cm處)以直徑1.0 mm牙科鉆鉆過(guò)，縱向形成規(guī)整的3 mm×1 mm不完全骨折，保持兩側(cè)骨質(zhì)完好，并有足夠強(qiáng)度不形成完全骨折，縫合后對(duì)照組局部注射1 ml生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組將重組人OPG-Fc融合蛋白50 μg溶入10 ml注射用水中，即濃度為5 μg/ml,并以1 ml局部注射，假手術(shù)組單純切開(kāi)至股骨表面，不形成骨折，直接縫合。術(shù)前及術(shù)后兩組大鼠均肌注慶大霉素一次預(yù)防感染，淘汰失敗模型，并補(bǔ)充，保持?jǐn)?shù)目不變。

1.3標(biāo)本采集和處理三組動(dòng)物于術(shù)后第7天、第14天、第28天、第42天、第56天5個(gè)時(shí)間節(jié)段分批行心臟采血并處死模型,血清標(biāo)本行血清ALP的分光光度法測(cè)定(金氏單位/100 μl)；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組股骨骨折處標(biāo)本切片后通過(guò)HE染色觀察骨折愈合情況,免疫組織化學(xué)染色分析破骨細(xì)胞數(shù)量變化情況。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1HE染色制好的切片經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素染核、鹽酸及酒精分化、伊紅染漿、再脫水透明,最后以中性樹(shù)膠封片,在光鏡下觀察其骨痂生長(zhǎng)情況及其組織形態(tài)。

1.4.2免疫組化染色將切片脫蠟復(fù)水,首先孵育液 A 液：0.2 mol/L 醋酸緩沖液8 ml；再孵育液B液：取六耦氮副品紅1 ml；再孵育液C液：在1 ml N,N-二甲基甲酰胺中溶解20 mg萘酚AS-BI 磷酸酯。然后將 A、B 液按比例混和，并將pH值調(diào)到5.0，加入C液，最后將141 mg酒石酸鉀鈉加入。破骨細(xì)胞固定后，切片浸入孵育液內(nèi)，封片。鏡下觀察破骨細(xì)胞數(shù)量。

1.4.3BMD檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別于第28天及第56天雙能X線骨密度測(cè)定儀測(cè)定。

1.5數(shù)據(jù)收集與處理將染色后的切片在光學(xué)顯微鏡400倍鏡頭下觀察，并計(jì)數(shù)TRAP 陽(yáng)性染色的破骨細(xì)胞。在顯微鏡下，染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞胞質(zhì)呈酒紅色，將這兩張切片中的破骨細(xì)胞數(shù)量分別計(jì)數(shù)。選擇染色明、分布均的部位進(jìn)行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)10 個(gè)高倍視野下的破骨細(xì)胞細(xì)胞總數(shù)為值，即該張切片的破骨細(xì)胞數(shù)。樣本的數(shù)值為兩張切片的破骨細(xì)胞總數(shù)的平均數(shù)。統(tǒng)計(jì)血清標(biāo)本行血清ALP及BMD數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1骨痂組織形態(tài)觀察HE染色切片光鏡下觀察結(jié)果：術(shù)后14 d時(shí)兩組纖維骨痂逐漸向軟骨性骨痂轉(zhuǎn)變，開(kāi)始有原始小梁狀骨出現(xiàn)。但實(shí)驗(yàn)組原始小梁狀骨多，并表面有數(shù)目較多的成骨細(xì)胞排列，較多膠原生成，對(duì)照組則原始小梁狀骨少，且成骨細(xì)胞及膠原較少；骨折后42 d時(shí)兩組均有編織骨出現(xiàn)，原始小梁狀骨內(nèi)軟骨細(xì)胞凋亡或成軟骨島，實(shí)驗(yàn)組成熟骨小梁較多且有大量類骨質(zhì)形成，對(duì)照組骨痂相對(duì)較少，軟骨成骨慢，骨小梁粗細(xì)不均、紊亂；第56天時(shí)實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)骨生成量明顯多于對(duì)照組，對(duì)照組骨小梁鈣化不全明顯，顯示愈合滯后。見(jiàn)圖1。

2.2光學(xué)顯微鏡下對(duì)破骨細(xì)胞觀察并計(jì)數(shù)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所計(jì)數(shù)的破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)取平均值，得出7 d、14 d、28 d、42 d的兩組中每個(gè)樣本的破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)的平均數(shù)，實(shí)驗(yàn)組分別為2.953±0.064、1.652±0.151、3.817±0.064、7.538±0.082,對(duì)照組分別為5.142±0.043、7.613±0.056、5.331±0.082、7.241±0.061。在第7天、14天、28天時(shí)兩組破骨細(xì)胞平均數(shù)差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1　42 d時(shí)骨癡組織形態(tài)觀察(HE，×400)

圖2　7 d時(shí)兩組破骨細(xì)胞觀察(HE，×400)

2.3術(shù)后不同時(shí)間各組血清中 ALP的變化情況ALP血清濃度在假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)波幅很小，對(duì)照組濃度于術(shù)后第14天開(kāi)始升高，至第28天至高峰，隨后漸降，實(shí)驗(yàn)組大鼠ALP 血清濃度變化規(guī)律與對(duì)照組的變化相似，但在第14天和第28 天時(shí)數(shù)值增高明顯(P<0.05)，第42天及第56天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ALP濃度值趨同，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1　各組骨折后不同時(shí)間節(jié)段血清中ALP濃度變化

與對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.4各時(shí)點(diǎn)各組BMD水平第28天和第56天時(shí)實(shí)驗(yàn)組BMD分別為(0.191±0.042)g/mm2、(0.185± 0.097)g/mm2；對(duì)照組分別為(0.184±0.014)g/mm2、(0.173±0.015)g/mm2，兩個(gè)時(shí)間段對(duì)照組明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。

3討論

OP發(fā)病是一個(gè)逐漸的緩慢的過(guò)程，在微觀結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)骨小梁的萎縮，骨量的減少，骨支架功能的減退，而易出現(xiàn)骨折，常以椎體、髖部和前臂骨折多見(jiàn)，特別在絕經(jīng)后婦女人群中最常見(jiàn)〔5〕。由于骨折的修復(fù)重建是一個(gè)慢性的過(guò)程，所以本實(shí)驗(yàn)選擇的時(shí)間點(diǎn)以2 w為間隔，但考慮到第1周時(shí)，骨折早期變化比較典型，故增加7 d為考察點(diǎn)，而BMD變化周期長(zhǎng)，故僅選擇第28天、56天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，這樣選擇，既可以收集到典型的數(shù)據(jù)進(jìn)行觀察，也可以排除雜亂的干擾因素。

RANKL/RANK/OPG環(huán)路系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，被認(rèn)為是體內(nèi)諸多因子調(diào)控破骨細(xì)胞功能的主要途徑〔6〕。其機(jī)制大致如下，RANKL為破骨細(xì)胞生長(zhǎng)及分化所必需的細(xì)胞因子〔7〕,它通過(guò)與RNAK結(jié)合使破骨細(xì)胞活性增強(qiáng),達(dá)到骨吸收加強(qiáng)的效果，OPG是RANKL的誘騙受體,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，可以減少RANKL與RNAK結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞分化、成熟，并且成熟破骨細(xì)胞活性也受到抑制〔8，9〕。OPG還可以激發(fā)成骨活性，通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞分化成熟為成骨細(xì)胞的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)成骨作用,進(jìn)而促進(jìn)新骨組織形成〔10〕?，F(xiàn)諸多實(shí)驗(yàn)證明，破骨細(xì)胞表面的RANK是RANKL的唯一受體，成骨細(xì)胞分泌OPG，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制了RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制了破骨細(xì)胞的生物活性及其成熟。骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMPs、前列腺素(PG)E2、甲狀旁腺激素(PTH)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β、雌激素、糖皮質(zhì)激素等對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用均是通過(guò)調(diào)節(jié)該通路表達(dá)而完成的，但關(guān)于該通路對(duì)促進(jìn)成骨作用的研究及實(shí)驗(yàn)卻少有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用OPG-Fc可排除其他因素，達(dá)到直接使OPG/RANKL比值增大，下調(diào)RANKL表達(dá)的目的，與應(yīng)用腺病毒改變基因表達(dá)效果相同，以往實(shí)驗(yàn)顯示該蛋白藥效為局部作用，半衰期約6～7 d，藥物性能持續(xù)約30 d，可完全滿足本實(shí)驗(yàn)要求，也是28 d后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)值及ALP濃度值均趨同的原因之一，但這并不影響OPG-Fc對(duì)OPF愈合早期影響的觀察結(jié)果。本文結(jié)果顯示OPG-Fc能明顯抑制破骨細(xì)胞活性，抑制早期骨折端骨質(zhì)的吸收，打破骨生成與骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，使骨痂明顯增多，并可促進(jìn)骨成熟加速，減少骨吸收，提高BMD，28 d后隨著藥效的減低，對(duì)骨折后期骨痂的塑形改造并不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。ALP血清含量作為成骨活動(dòng)強(qiáng)弱的指標(biāo)之一，本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明OPG-Fc不但能抑制破骨細(xì)胞的活性，還具有增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性的雙重作用，從而增加了新生骨痂，提升BMD和骨質(zhì)生物力學(xué)強(qiáng)度，起到促進(jìn)OPF的愈合的作用。

有研究通過(guò)組織學(xué)與生物力學(xué)指標(biāo)的觀察發(fā)現(xiàn)OP對(duì)大鼠骨折愈合早期(術(shù)后3 w)即有不利影響〔11〕，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)OPF的大鼠模型應(yīng)用OPG-Fc，著重研究其對(duì)OPF愈合早期的影響，故在藥物失去效力(約30 d)后，并未重復(fù)給藥，所以對(duì)骨折愈合的后期情況缺乏觀察比較，尤其在鈣沉積和骨再塑方面有待于進(jìn)一步研究探討。

4參考文獻(xiàn)

1Cummings SR,Kelsey JL,Nevitt MC,etal.Epidemiology of osteoporosis and osteoporotic fractures〔J〕.Epidemiol Rev,1985;7(1):178-208.

2Lawrence R,Helmick C,Arnett F.The long and the short of bone therapy〔J〕.Knee,1995;38:1541-6.

3Boulétreau PH,Muriel B,Elisabeth F,etal.Fluoride exposure and bone status in patients with chronic intestinal failure who are receiving home parenteral nutrition〔J〕.Am J Clin Nutr,2006;83(6):1429-37.

4Orwoll E,Ettinger M,Weiss S,etal.Alendronate for the treatment of osteoporosis in men〔J〕.New Eng J Med,2000;343(9):604-10.

5Fisher AA,Davis MW,Budge MM.The management of osteoporosis following hip fracture:how to improve our care 〔J〕.Osteoporos Int,2004;15:583-4.

6SahTlon P.Loss of chaotic trabecular structure in OPG-deficient Juvenile Paget's disease patients indicates a chaogenic role for OPG in nonlinear pattern formation of trabecular bone〔J〕.J Bone Miner，2004;19(5)：695-702.

7Nakamura H,Tsuji T,Hirata A,etal.Localization of osteoprotegerin(OPG)on bone surfaces and cementlines in rat tibia〔J〕.J Histochem Cytochem,2002;50(7):945-53.

8Hofbauer LC,Schoppet M.Clinical implications of the osteoprotegerin/RANKL/RANK system for bone and vascular diseases〔J〕.JAMA,2004;292(4):490-5.

9Masi L,Simonini G,Giani T,etal.Osteoprotegerin(OPG)/RANK-L system in juvenile idiopathic arthri-tis:is there a potential modulating role for OPG/RANK-L in bone injury〔J〕?J Rheumatol,2004;31(5):986-91.

10Lacey DL,Timms E,Tan HL,etal.Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation〔J〕.Cell,1998;93(2):165-76.

11Namkung-Matthai H,Appleyard R,Jenson J,etal.Osteoporosis influences the early period of fracture healing in a rat osteoporotic model〔J〕.Bone,2001;28(1):80-6.

〔2016-03-01修回〕

(編輯曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.12541920)

〔中圖分類號(hào)〕R683.42

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2327-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.007

第一作者：沈業(yè)彤(1975-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事骨關(guān)節(jié)創(chuàng)傷修復(fù)關(guān)節(jié)置換研究。