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(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，重慶　400016)

10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物和趨化因子配體18在老年三陰及非三陰乳腺癌中的表達差異及意義

盧家希胥尹1姜昕2陳曉品

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，重慶400016)

〔摘要〕目的探討10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)和趨化因子配體(CCL)18在老年三陰乳腺癌(TNBC)及非三陰乳腺癌(NTNBC)中的表達差異及其可能的臨床意義。方法采用SP免疫組化法分別檢測PTEN和CCL18在25例NTNBC、25例TNBC(兩組均未行新輔助化療，術后病理分期相近)及15例良性乳腺增生病(BBD)中的表達情況。結果PTEN、CCL18均在胞膜、胞質表達。PTEN在NTNBC組、TNBC組陽性表達率分別為92%和68%，差異顯著(P=0.011)，而在BBD組中PTEN陽性率達到了100%；CCL18在NTNBC組中陽性率為88%，在TNBC組中為100%，差異不顯著(P=0.247)，CCL18在BBD組中則無表達。NTNBC組CCL18陽性表達主要位于癌巢區(qū)域，癌間質較少，TNBC組則主要表現為癌巢及癌間質區(qū)域的廣泛強陽性。各組陽性切片積分光密度值(IOD)分析提示TNBC組PTEN表達水平較NTNBC組有明顯下調(P<0.01)，而CCL18則為高表達(P<0.01)。結論老年三陰乳腺癌較非三陰乳腺癌有顯著的PTEN表達下調或缺失，同時伴隨CCL18廣泛高表達，這可能是導致其較非三陰型易發(fā)生化療耐藥及遠處轉移的原因之一。

〔關鍵詞〕三陰乳腺癌；非三陰乳腺癌；10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)；趨化因子配體(CCL)18

我國乳腺癌總體死亡率雖明顯下降，但近十余年來其在中老年婦女中發(fā)病及死亡的絕對人數反而呈上升趨勢〔1，2〕。三陰乳腺癌(TNBC)被認為是乳腺癌中一類獨立的病理類型，其雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體(HER)-2均為陰性。據統(tǒng)計，TNBC在我國乳腺癌中的比例約為22%，高于歐美國家的15.4%～19.9%。TNBC侵襲性強、預后差，內分泌及靶向治療無效，其化療總有效率雖并不比非三陰乳腺癌(NTNBC)低，但阿霉素聯合環(huán)磷酰胺或蒽環(huán)類聯合紫杉醇的經典方案使其獲得臨床完全緩解(CCR)的概率卻明顯偏低，生存率也未能提高。此外，TNBC與NTNBC相比術后局部復發(fā)率并無顯著差異，但遠處轉移風險明顯增高。本實驗應用免疫組化檢測人10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)和趨化因子配體(CCL)18在TNBC及NTNBC中的表達情況，以期發(fā)現更多與TNBC相關的生物學指標。

1資料與方法

1.1一般資料重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院及重慶市中山醫(yī)院2007年1月至2010年6月有完整病理資料、行改良根治術切除且術前未行新輔助化療的浸潤性乳腺癌患者。均要求術前檢查未發(fā)現遠處轉移、術后病理證實腫瘤最大直徑≤5 cm、無胸壁、皮膚侵犯、腋窩陽性淋巴結數為1～9個〔即美國癌癥聯合委員會(AJCC)乳腺癌TNM分期為pT1-2N1-2M0〕。分組標準：NTNBC組25例，TNBC組25例，全部病例經術后免疫組化檢測及病理科再次復閱，保證TNBC組ER、PR、HER-2均為陰性，NTNBC組則滿足ER陽性，PR、HER-2至少1項陽性。NTNBC組發(fā)病年齡60～76歲，中位年齡65歲，腫瘤直徑1.5～4.5 cm，腋窩轉移淋巴結1～8個；TNBC組發(fā)病年齡61～74歲，中位年齡65歲，腫瘤直徑2.8～4.8 cm，腋窩轉移淋巴結2～9個；另選擇經病理證實的乳腺良性增生(BBD)15例。主要試劑包括：兔抗人PTEN多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)、兔抗人CCL-18多克隆抗體(Abcam公司)。生物素標記的山羊抗兔IgG，SP免疫組化試劑盒和濃縮型DAB試劑均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

1.2PTEN和CCL18表達的檢測采用SP免疫組化法，取各組各病例石蠟包埋組織切片，經脫蠟、抗原修復后，過氧化物酶阻斷內源性過氧化物酶活性15 min，山羊血清阻斷非特異性反應15 min，分別滴加兔抗人PTEN抗體(1∶150稀釋)或兔抗人CCL18抗體(1∶30稀釋)，室溫作用1 h，4℃過夜；37℃復溫1 h，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG，作用40 min；加入鏈霉抗生素-過氧化物酶溶液作用40 min，經二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木精輕度對比染色后脫水、透明并用中性樹膠封片。各組中每病例選取2張切片(每組共40～50張)，由2位經驗豐富的病理科醫(yī)生分別在高倍視野(×400)下觀察，盡量排除非特異性染色區(qū)域，選取效果最好的視野攝像用于圖像分析。采用染色強度和分布雙評分半定量法評估表達情況，染色強度打分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色或棕褐色2分；分布區(qū)域評分：無陽性細胞0分，陽性細胞<10%為1分，11%～49%為2分，陽性比例≥50%為3分。當染色強度與分布兩項評分相加≥2時，視為有陽性表達，否則為陰性，3～4分為中等強度表達，5分及以上為強陽性表達。計算各組有陽性表達切片的積分光密度值(IOD)，作為評估表達強度差異的半定量指標。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行χ2、t檢驗。

2結果

2.1PTEN、CCL18在BBD組的表達PTEN的陽性表達率為100%(15/15)。在乳腺增生的導管上皮細胞胞質內可見廣泛的PTEN表達，且多數病例為強陽性表達，而CCL18在BBD組中均未見有表達。見圖1。

圖1　PTEN、CCL18在BBD組表達情況(×200)

2.2PTEN在NTNBC組、TNBC組的表達情況PTEN在乳腺癌組織中的陽性表達定位于胞膜和胞質，根據表達強度呈淡黃色、棕黃色至棕褐色，胞核無表達呈藍紫色。見圖2。在NTNBC組PTEN總陽性率為92%(23/25)，TNBC組則為68%(17/25)，兩組陽性率差異顯著(χ2=6.424，P=0.011)。IOD分析比較BBD組PTEN平均表達水平(23 850±4 283)最高，NTNBC組較之有明顯下調(12 470±2 133)，而TNBC組水平最低(3 987±1 467)。三組間兩兩比較，差異顯著(P<0.01)。

2.3CCL18在NTNBC組、TNBC組的表達情況CCL18陽性表達定位于胞質或胞膜，呈棕黃色至黃褐色顆粒狀，細胞核無染色呈藍紫色。CCL18在NTNBC組中的陽性率為88%(22/25)，而在TNBC組為100%，即全部病例均可見陽性表達。兩組陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.247)。在NTNBC組中病例中陽性表達主要位于癌巢區(qū)域，間質無浸潤，TNBC組則可見癌巢及癌間質區(qū)域的廣泛強陽性表達。見圖3。兩組陽性病例切片IOD分析示，TNBC組CCL18的總體表達水平(33 862±7 128)較NTNBC組(17 923±5 477)有明顯上調(P<0.01)。

NTNBC組：①PTEN多為強陽性，②少數PTEN為弱陽性；TNBC組：③PTEN多為弱陽性，④8例出現PTEN表達缺失圖2　NTNBC組及TNBC組中PTEN的表達(×200)

NTNBC組：①多為癌巢內散在表達，②少數在癌巢內強陽性，但間質無明顯浸潤；TNBC組：③癌巢內多為強陽性表達，④多伴有間質的廣泛浸潤圖3　NTNBC組及TNBC組中CCL18的表達(×200)

3討論

PTEN是第一個被發(fā)現具有磷酸酶功能的抑癌基因，不僅抑制腫瘤細胞生長，而且促進腫瘤細胞凋亡〔3〕。老年TNBC組織中存在PTEN的表達缺失，其能夠增強TNBC患者的淋巴結轉移、加強侵襲性及遠處轉移〔4〕。乳腺良性增生組織中，作為抑癌蛋白的PTEN一般不存在表達缺失情況，而由腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)分泌的CCL18無表達。本研究說明無論TNBC還是NTNBC中均存在著PTEN蛋白的缺失；并且TNBC中PTEN的表達明顯低于NTNBC，提示PTEN蛋白表達在TNBC組織中較NTNBC進一步減弱，可能是由于抑癌基因PTEN出現了更多缺失和突變的結果，和國內一些研究保持一致〔5〕。PTEN蛋白的表達率隨著組織學分級的增高而降低，并且無淋巴結轉移組的PTEN蛋白表達率明顯高于有淋巴轉移組陽性率〔6〕。方茅等〔7〕發(fā)現，PTEN在TNBC組織中的表達與腋窩淋巴結轉移、組織學分化和TNM分期密切相關，表明PTEN的表達水平越低，腫瘤惡性程度越高。本研究結果說明TNBC惡性程度高于NTNBC。CCL18是由巨噬細胞和樹突細胞分泌產生的炎癥趨化因子，具有維持機體內環(huán)境平衡，促進血管生長，白細胞轉運等功能，在腫瘤的形成與轉移過程中起著非常重要〔8〕，其過度表達能夠增強癌細胞的侵襲能力。胡祖健等〔9〕對比乳腺癌組織、癌周組織和良性乳房組織發(fā)現，CCL18在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于其他兩組。推測CCL18高表達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。陳靜琦等〔10〕研究表明CCL18可通過引起乳腺癌細胞表面整合素的聚集，導致乳腺癌細胞黏附于細胞外基質的數量明顯增多，而黏附在乳腺癌的浸潤和轉移過程中起關鍵作用。從而得出CCL18能促進乳腺癌浸潤、遷移。TNBC細胞的轉移能力更強，疾病更難控制。

鑒于PTEN與BRCA1的密切關系及其在乳腺癌化療耐藥中的作用機制，在TNBC患者治療前，同時檢測PTEN及BRCA1的表達情況對其化療方案的選擇及預后判斷可能會有所幫助。TNBC中CCL18在表達范圍及強度上均較NTNBC顯著擴大、上調，提示針對腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)及阻斷CCL18受體通路的治療有可能成為降低乳腺癌尤其是TNBC遠處轉移風險，提高生存率的重要方法。

綜上，PTEN基因的失活、CCL18基因的上調與TNBC的發(fā)生發(fā)展密切相關，因此臨床上聯合檢測二者可能為TNBC預后評估、患者的個體化治療提供一定的參考，為TNBC在基因水平上的診斷與治療提供新的思路。

4參考文獻

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10陳靜琦，朱必勝，侯開連.CCL18 通過促進整合素的聚集增強乳腺癌細胞黏附于細胞外基質〔J〕.中國癌癥雜志，2013；23(1)：26-31.

〔2014-12-19修回〕

(編輯苑云杰)

通訊作者：陳曉品(1964-)，男，博士，主任醫(yī)師，教授，主要從事惡性腫瘤研究。

〔中圖分類號〕R737.9

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2354-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.018

1廈門市第二醫(yī)院放療科2重慶市中山醫(yī)院病理科

第一作者：盧家希(1977-),男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事乳腺癌研究。