王云開　陶　劍　李衛(wèi)勇　王迎春　殷　然

(南昌大學第一附屬醫(yī)院心血管內科　江西省高血壓研究所，江西　南昌　330006)

肝X受體通過線粒體通路調控高糖誘導的H9C2細胞凋亡

王云開陶劍李衛(wèi)勇1王迎春殷然

(南昌大學第一附屬醫(yī)院心血管內科江西省高血壓研究所，江西南昌330006)

〔摘要〕目的探討高糖環(huán)境中肝X受體通過線粒體途徑在調控H9C2細胞凋亡過程中的作用。方法以H9C2細胞為研究對象，分為低糖組(Control組)、甘露醇組、高糖組、高糖+T0901317組及高糖+5CPPSS-50組。檢測各組H9C2細胞的活性，細胞內活性氧水平，Bax 、Bcl-2 mRNA，cleaved caspase-3蛋白的表達及細胞凋亡率，并觀察細胞線粒體膜電位變化。結果表達LXRs組明顯降低高糖誘導的Bax mRNA、激活型caspase3蛋白表達和細胞內活性氧水平；上調高糖抑制的Bcl-2 mRNA表達和線粒體膜電位。結論LXRs激動劑T0901317可改善高糖環(huán)境中H9C2細胞活性，抑制細胞凋亡，對細胞起到一定的保護作用；抑制LXRs后，對高糖環(huán)境中H9C2細胞損傷作用更明顯。LXRs可通過線粒體途徑調控高糖環(huán)境所致H9C2細胞凋亡。

〔關鍵詞〕高糖；肝X受體；凋亡；線粒體通路

糖尿病時線粒體活性氧簇(ROS)〔1〕產生增多可導致線粒體膜通透性增加，膜電位下降。線粒體中包含著許多重要的與細胞凋亡直接相關的蛋白酶或蛋白質，包括細胞色素C、半胱氨酸蛋白酶(caspase-2)，3，9、Bcl-2家族、AIF等。當線粒體膜通透性增加時，這些凋亡相關因子從線粒體釋放到胞質中增多，從而加速細胞凋亡的發(fā)生。肝X受體(LXRs)是一類屬于核受體超家族依賴配體激活的核轉錄因子，在能量代謝、炎癥、凋亡及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RASS)中起著關鍵的調節(jié)作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，通過激活LXRs可抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、核轉錄因子(NF)-κB等信號通路調控相關凋亡基因的表達。研究激活LXRs能否抑制高糖環(huán)境中心肌細胞的凋亡，且這種效應是否是通過線粒體途徑來完成對尋找防治糖尿病心肌病心肌細胞凋亡有重要的意義。本實驗通過應用LXRS激動劑T0901317及抑制劑5CPPSS-50處理高糖培養(yǎng)的H9C2細胞，測定細胞內ROS水平、線粒體膜電位變化及線粒體途徑中相關凋亡基因的表達，探討LXRs調控高糖誘導的H9C2細胞凋亡與線粒體途徑的關系，為糖尿病心肌病的防治提供新的靶向及理論基礎。

1材料和方法

1.1材料H9C2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、新生胎牛血清購自美國Hyclone公司；0.25%乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶、葡萄糖粉、甘露醇粉、T0901317、羅丹明123購自美國Sigma公司；膽重收縮素八肽(CCK8)溶液、細胞核蛋白提取試劑盒、ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TRIzolreagent、聚合酶鏈反應引物購自美國Invitrogen公司；ROS檢測試劑盒；5CPPSS-50購自日本Wako公司；熒光素標記物(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術有限公司；總蛋白提取試劑盒購自Vazyme有限公司；兔抗cleaved caspase-3多克隆抗體購自Cell Signaling公司；First-strand cDNA synthesis kit、All-in-One qPCR Mix購自美國GeneCopoeia公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和分組從培養(yǎng)瓶中取對數(shù)期生長細胞傳代計數(shù)，在6孔板或96孔板中按以下分組進行后續(xù)實驗。實驗分為①Control組：低糖DMEM培養(yǎng)基(D-葡萄糖濃度5.5 mmol/L)培養(yǎng)H9C2細胞24 h后換液，不進行任何干預，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；②甘露醇組：低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換為等滲D-甘露醇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h；③高糖組：低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后更換為配制好的D-葡萄糖終濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；④高糖+T0901317組：低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后更換為配制好的D-葡萄糖終濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)基并加入T0901317(終濃度10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h；⑤高糖+5CPPSS-50組：低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后更換為配制好的D-葡萄糖終濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)基并加入5CPPSS-50(終濃度15 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2CCK-8檢測各組H9C2細胞的活性選取對數(shù)期生長的H9C2細胞進行傳代計數(shù)，按每孔100 μl細胞懸液(約5 000個細胞)為標準，加入96孔板，每組設6個復孔，并預留只含等量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的空白對照組。在最外層的孔周加入磷酸鹽緩沖液(PBS)以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)；低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，相應組別更換為D-葡萄糖終濃度為33 mmol/L的培養(yǎng)基及D-甘露醇等滲培養(yǎng)基，并進行藥物干預，24h后，每孔加入10 μl CCK-8；將96孔板置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育2 h，再分別用酶標儀檢測在450 nm處的OD值。細胞活性=〔(處理組-空白對照)/(正常組-空白對照)〕×100%。

1.2.3二氧二氫光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法檢測各組細胞內ROS的水平按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L；收集細胞后重懸于稀釋好的DCFH-DA中(1 ml)，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。用流式細胞儀檢測各樣品內細胞活性氧水平。

1.2.4羅丹明123熒光染色觀察線粒體膜電位的變化將5 mg羅丹明123粉末溶于1 ml二甲基亞砜(DMSO)中，配成羅丹明123母液備用；用培養(yǎng)基將羅丹明123母液稀釋為5 μg/ml的工作液；將6孔板中的細胞用PBS洗滌2遍，向各孔加入1 ml羅丹明123工作液，37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱孵育30 min；去除工作液，并用PBS洗滌2遍，熒光顯微鏡下觀察各組細胞熒光強度變化。

1.2.5qRT-PCR檢測各組H9C2細胞Bax、Bcl-2 mRNA的表達提取各組細胞RNA，分光光度計檢測RNA純度及濃度(RNA原液濃度(mg/L)=OD260 nm×40×稀釋倍數(shù)，純度要求達到OD260 nm/OD280 nm比值為1.8～2.1。按濃度計算出1 μg RNA逆轉錄合成cDNA，取2 μl cDNA進行qRT-PCR，以GADPH作為內參對照，檢測Bax和Bcl-2的mRNA水平。每個樣品均重復三次，ΔCt值=樣本基因Ct值-對應內參Ct值；取Control組的ΔCt值的平均值作為對照，ΔΔCt值=每個樣本ΔCt值-參照組的ΔCt值；計算出2-ΔΔCt值后再進行統(tǒng)計分析。

1.2.6Western印跡檢測各組H9C2細胞酶切caspase-3蛋白的表達分別提取各組細胞總蛋白，測定蛋白的濃度，配制二喹啉甲酸(BCA)工作液，按試劑盒說明書稀釋標準品并加適當體積樣品到96孔板中；各孔加入200 ml BCA工作液育充分混勻后，置于37℃恒溫箱中孵育30 min；以0號孔作為對照，用酶標儀測定562 nm處的吸光值；樣品蛋白濃度(μg/μl)：根據(jù)OD值在標準曲線上對應的蛋白含量除以樣品體積，再乘稀釋倍數(shù)。取等量蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)和電轉移至硝酸纖維素(NC)膜，先后用Ⅰ抗及Ⅱ抗孵育，按Supcrsignal west fomto trial kit試劑盒說明進行操作，通過ImageProPlus軟件，分析目的蛋白與內參β-actin蛋白條帶灰度值，計算相對灰度進行組間比較。

1.2.7Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡將6孔板中各組細胞用胰酶消化后，1 000 r/min離心5 min，去除上清液，用PBS洗滌2次。將細胞重懸于200 μl上樣緩沖液。加入10 μlannexin V-FITC和10 μl碘化吖啶(PI)，輕輕混勻，避光室溫反應15 min。加入300 μl上樣緩沖液，在1 h內用流式細胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1CCK-8法檢測各組H9C2細胞的活性與Control組(100%)相比，高糖組(62.76±1.34)%、高糖+T0901317(83.23±2.17)%、高糖+5CPPSS-50組(56.48±1.41)%細胞活性均降低(P<0.05)，而甘露醇組與Control組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與高糖組相比，高糖+T0901317細胞活性較高，高糖+5CPPSS-50組細胞活性降低(P<0.05)。見圖1。

2.2DCFH-DA法檢測各組細胞內ROS水平與Control組(24.65±1.83)相比，高糖組ROS生成水平(62.06±1.94)明顯升高(P<0.01)，甘露醇組(26.64±1.18)無明顯變化(P>0.05)；與高糖組相比，高糖+T0901317組(47.51±1.90)ROS生成水平降低(P<0.01)，高糖+5CPPSS-50組(77.8±2.68)ROS生成水平升高(P<0.01)。

2.3羅丹明123檢測H9C2細胞線粒體膜電位變化Control組與甘露醇組熒光強度最高，且二者無明顯差異；與Control組相比，高糖+T0901317組、高糖組、高糖+5CPPSS-50組熒光強度均減弱；與高糖組相比，高糖+T0901317組熒光強度較強，高糖+5CPPSS-50組熒光強度稍弱。見圖1。

2.4qRT-PCR檢測各組H9C2細胞Bax和Bcl-2 mRNA的表達以Control組(表達量為1)進行比較，高糖+T0901317組(10.58±1.70)、高糖組(27.10±0.83)、高糖+5CPPSS-50組(47.19±1.58)Bax mRNA表達水平均上調，其中高糖組Bax 的mRNA表達是Control組的27.10±0.83倍，高糖+5CPPSS-50組Bax mRNA表達是Control組的47.19±1.58倍，高糖+T0901317組的Bax mRNA表達是Control組的10.58±1.70倍，差異均有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而甘露醇組(1.12±0.32)與Control組相比，差異無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與高糖組相比，高糖+T0901317組Bax mRNA表達水平下調(P<0.01)，而高糖+5CPPSS-50組Bax mRNA表達水平上調(P<0.01)。以Control組表達量為1進行比較，甘露醇組Bcl-2的mRNA表達為Control組的0.95±0.04倍，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；高糖組Bcl-2的mRNA表達為Control組的0.04±0.03倍；高糖+T0901317組Bcl-2的 mRNA表達為Control組的0.23±0.05倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；高糖+5CPPSS-50組Bcl-2的mRNA表達為Control組的0.02±0.01倍。與高糖組相比，高糖+T0901317組Bcl-2的mRNA表達水平上調(P<0.01)，而高糖+5CPPSS-50組Bcl-2的mRNA表達水平下調(P<0.01)。

2.5Western印跡檢測各組H9C2細胞酶切caspase-3蛋白的表達與高糖組(0.52±0.05)相比，高糖+T0901317組(0.83±0.04)的酶切caspase-3蛋白水平下調(P<0.01)；高糖+5CPPSS-50組(0.97±0.05)的酶切caspase-3蛋白水平上調(P<0.01)；而甘露醇組(0.33±0.06)與Control組(0.32±0.03)相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖2)。

圖1　各組H9C2細胞線粒體膜電位(E×/Em:505×529)

圖2　各組酶切caspase-3蛋白表達

2.6Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡與Control組(21.25±1.57)相比，高糖組凋亡率明顯上升(P<0.01)，甘露醇組(22.67±1.64)凋亡率無明顯改變(P>0.05)；與高糖組(48.12±2.81)相比，高糖+T0901317組(34.52±2.95)凋亡率有所降低(P<0.01)，高糖+5CPPSS-50組(55.20±2.96)凋亡率上升(P<0.01)。

3討論

糖尿病心肌病的病理過程極其復雜，葡萄糖脂肪酸代謝紊亂、心肌纖維化、氧化應激、鈣平衡調節(jié)異常、RAAS的激活、心肌細胞凋亡等多種因素等都參與了糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展。高糖環(huán)境中，線粒體內ROS的過量生產，使線粒體膜通透性增加，線粒體內致凋亡因子釋放增多，通路相關信號通路，加速細胞凋亡。LXRs在能量代謝、炎癥、凋亡及RASS中起著關鍵的調節(jié)作用。線粒體內含有多種凋亡相關因子，如細胞色素C、凋亡誘導因子(AIF)caspase-2，3，9等，凋亡過程中通過線粒膜釋放到細胞質中，隨后引起特異性凋亡發(fā)生。同時多種促凋亡蛋白及凋亡誘導物可轉移至線粒體，破壞線粒體膜的通透性和完整性，加速線粒體內促凋亡因子的釋放，進一步使凋亡細胞增多〔3〕。ROS是線粒體呼吸鏈產生的一個導致氧化損傷和老化的破壞性產物，大量研究證實，ROS的積聚和氧化應激可導致線粒體膜電位及通透性的改變，最終與心肌細胞凋亡的發(fā)生相關。Fiordaliso等〔4〕在用鏈脲佐菌素誘導大鼠糖尿病心肌病模型中發(fā)現(xiàn)，心肌細胞內ROS水平會伴隨細胞凋亡的增加而成倍上升。細胞色素C釋放是線粒體凋亡途徑的關鍵步驟〔5〕，Bax、Bcl-2的相互作用可誘導線粒體細胞色素C的釋放和caspase-3的激活〔6〕。Cai等〔7〕研究顯示在大鼠糖尿病心肌病模型中伴隨心肌細胞的凋亡增多，線粒體細胞色素C的釋放和caspase-3的活性也增加，并且與在高糖環(huán)境中體外培養(yǎng)心肌細胞得出的結論相一致。這說明，線粒體細胞色素C調節(jié)caspase-3的激活參與了高糖誘導的心肌細胞凋亡。同時細胞色素C的釋放和caspase-3活化間存在著互相的正反饋調節(jié)機制〔8〕，導致凋亡信號放大，細胞線粒體功能喪失和細胞死亡。

糖尿病狀態(tài)下，RAAS被激活，血漿及心肌局部的血管緊張素(Ang)Ⅱ合成增加，而有研究觀察到Ang-Ⅱ介導的氧化應激可誘導糖尿病大鼠心肌細胞發(fā)生凋亡〔9〕。唐香等〔10〕研究表明通過降低糖尿病大鼠氧化應激水平，可減少或抑制心肌線粒體ROS 的產生。已有研究發(fā)現(xiàn)，LXRs激動劑T0901317可減輕由Ang-Ⅱ及LPS誘導的心肌細胞損傷，這也揭示了LXRs與線粒體凋亡途徑的相關性。同時在高糖環(huán)境下，NF-κB信號通路也被激活〔11〕，NF-κB可促進炎癥因子的產生，而這些促炎癥因子可增強caspase 3的活性，刺激NF-κB的不斷活化，活化后的NF-κB可促進凋亡相關基因的表達，誘導細胞凋亡的產生〔12〕。乳鼠心肌細胞復制缺氧復氧模型中，外源性激活LXRs可通過抑制NF-κB活性，從而減輕心肌細胞炎癥及凋亡的產生〔13〕，提示NF-κB可能是線粒體凋亡途徑的上游信號分子。本實驗結果表明，T0901317組與高糖組相比，Bax mRNA、激活型caspase3蛋白水平下降；Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高。而5CPPSS-50組Bax mRNA、激活型caspase3蛋白水平升高；Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低，表明LXRs可通過線粒體的caspase依賴性凋亡途徑調控高糖誘導的H9C2細胞凋亡。但LXRs能否通過線粒體的caspase非依賴性凋亡途徑調控高糖誘導的H9C2細胞凋亡有待進一步研究。

4參考文獻

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〔2015-12-03修回〕

(編輯袁左鳴)

Liver X receptors regulating H9C2 cells apoptosis induced by high glucose through mitochondria-mediated pathway

WANG Yun-Kai,TAO Jian，LI Wei-Yong,et al.

Department of Cardiology,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Hypertension Institute of Jiangxi,Nanchang 330006,Jiangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the viability and apoptosis level of H9C2 cells induced by high glucose and investigate the effect of liver X receptors(LXRs)on the regulation of apoptosis in H9C2 cells induced by high glucose through mitochondria-mediated pathway.MethodsH9C2 cells were used in the experiments and divided into:low glucose group(control group);D-mannitol group;high glucose group;high glucose +T0901317 group and high glucose +5CPPSS-50 group.The viability and the level of ROS in the H9C2 cells were measured.The mRNA expressions of Bax and Bcl-2 were detected by qRT-PCR.The protein level of cleaved caspase 3 was determined by Western blot.The apoptotic rates of H9C2 cells with different treatments were analyzed by cytometry with annexin V-FITC/PI double staining.ResultsOverexpressed LXRs significantly attenuated the mRNA expression of Bax induced by high glucose,cleaved caspase-3,cell viability and the ROS lever,and increased Bcl-2 expression and mitochondrial membrane potential inhibited by high glucose.ConclusionsT0901317 improves the cell viability and reduces the apoptotic rate of H9C2 cells induced by high glucose，while inhibits the LXRs damage effect more obvious in H9C2 cells induced by high glucose.LXRs can regulate apoptosis in H9C2 cells induced by high glucose through mitochondria-mediated pathway.

【Key words】High glucose;LXRs;Apoptosis;Mitochondria-mediated pathway

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81160117)

〔中圖分類號〕R329.24

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2324-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.006

1江西省腫瘤醫(yī)院

第一作者：王云開(1963-),男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事冠心病基礎和臨床研究。