徐敏　何婉　李嵐　朱美琴　陳亦欣　許瑞蓮

外周血循環(huán)腫瘤DNA基因突變檢測(cè)在非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用價(jià)值

徐敏何婉李嵐朱美琴陳亦欣許瑞蓮

518020 深圳，暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 深圳市腫瘤研究所

【摘要】目的探討高通量基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)外周血循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)基因突變?cè)诜切〖?xì)胞肺癌(NSCLC)中的應(yīng)用價(jià)值。方法用高通量測(cè)序技術(shù)同時(shí)檢測(cè)32例晚期NSCLC患者的外周血ctDNA和組織石蠟切片DNA(tDNA)的基因突變情況，并以tDNA為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)ctDNA診斷NSCLC基因突變的效能。結(jié)果32例NSCLC患者中，ctDNA檢出基因突變9種42例次，tDNA檢出基因突變11種40例次。以tDNA檢出的基因突變結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，外周血ctDNA診斷NSCLC基因突變的敏感度為75%～100%，特異度達(dá)95%～100%，與tDNA結(jié)果的總體符合率為91%～100%。結(jié)論高通量基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)NSCLC患者外周血ctDNA，可代替腫瘤組織切片了解基因突變情況。

【關(guān)鍵詞】非小細(xì)胞肺癌；高通量測(cè)序；循環(huán)腫瘤脫氧核糖核酸

全球肺癌的發(fā)病率和病死率高居各類(lèi)惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。肺癌患者中約80%～85%為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，約50%的患者確診時(shí)已為晚期，預(yù)后差。準(zhǔn)確獲知腫瘤的生物學(xué)信息，從而在基因分型指導(dǎo)下進(jìn)行個(gè)體化治療對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥至關(guān)重要。目前臨床常規(guī)采用組織DNA(tDNA)檢測(cè)基因分型，但此檢測(cè)有創(chuàng)且對(duì)標(biāo)本獲取有較高的要求。循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)是特指腫瘤細(xì)胞體細(xì)胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的小片段DNA，ctDNA來(lái)自腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞突變，可以出現(xiàn)與原發(fā)腫瘤DNA相同的特征或基因改變[1]。外周血ctDNA可以被定性、定量和追蹤，將有可能為臨床腫瘤的早期診斷、預(yù)后判定及跟蹤隨訪等提供一系列方便、快捷、特異、無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的分子生物學(xué)檢測(cè)手段[2-5]。但外周血ctDNA是否可以替代tDNA成為常規(guī)基因檢測(cè)手段應(yīng)用于臨床尚未可知。為此，筆者通過(guò)高通量基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)32例晚期NSCLC患者的外周血ctDNA中的基因突變情況，并以組織tDNA作金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)其診斷效能，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

2014年10月至2015年12月我院收治的晚期(ⅢB期以上)無(wú)法手術(shù)的NSCLC患者32例，所有患者均有原發(fā)組織的石蠟切片及血液樣本。其中男18例、女14例，年齡37～72歲、中位年齡55歲，腺癌23例、鱗癌9例。血漿樣本DNA提取后與組織切片送南京世和基因生物技術(shù)有限公司行基因檢測(cè)。

二、方法

1. 標(biāo)本采集、血漿分離

入院次日清晨采集患者肘靜脈血5 ml，立即在室溫下以2 000×g離心10 min，分離血漿和血細(xì)胞，小心收集上層血漿，避免觸及白細(xì)胞或血小板及紅細(xì)胞下層。

2. 血漿樣本DNA提取

采用Qiagen DNA提取試劑盒，取血漿樣本，室溫下3 500×g離心15 min，棄上清，沉淀中加入1 ml試劑1裂解緩沖液；勻漿液37℃水浴靜置60 min后，加入10 μl試劑2， 50℃水浴消化3 h；按步驟分次吸取水相，加入1 ml試劑3～5，輕柔顛倒混勻約50次，室溫5 000×g 離心15 min；棄上清，向沉淀中加入1 ml 70%乙醇，重懸沉淀后，室溫5 000×g 離心10 min；棄上清，吸干乙醇并晾干，加入試劑6溶解DNA，37 ℃溶解12～14 h，直至DNA完全溶解；測(cè)量DNA濃度后備用。

3. ctDNA分離

采用薄膜柱吸附試劑盒從血漿中分離ctDNA：DNA定量后按照試劑盒說(shuō)明取20 ng以上進(jìn)行DNA文庫(kù)構(gòu)建，具體步驟包括ctDNA大片段分離、ctDNA小片段回收、DNA末端修復(fù)和A接頭連接、將DNA兩端加上Illumina測(cè)序試劑盒的專(zhuān)用接頭、根據(jù)所需DNA片段大小進(jìn)行磁珠篩選、使用PCR法擴(kuò)增文庫(kù)用于后續(xù)的探針雜交捕獲和測(cè)序?qū)嶒?yàn)。

4. 生物素標(biāo)記探針捕獲基因

使用Geneseeq雜交富集探針對(duì)已建好的DNA文庫(kù)進(jìn)行目標(biāo)基因靶標(biāo)富集及擴(kuò)增，包括：DNA捕獲探針與文庫(kù)雜交；捕獲文庫(kù)產(chǎn)物的清洗和回收；捕獲文庫(kù)與鏈霉親和素磁珠結(jié)合；磁珠捕獲文庫(kù)清洗，去除非特異結(jié)合的文庫(kù)。

5. 高通量測(cè)序

捕獲后的文庫(kù)按照Illumina試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟，在Illumina HiSeq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)上樣，DNA在試劑盒Flow cell上形成DNA簇，測(cè)序平臺(tái)通過(guò)單個(gè)堿基合成后暫停、熒光檢測(cè)、合成恢復(fù)的循環(huán)完成DNA高通量測(cè)序。

6. 數(shù)據(jù)分析

將高通量測(cè)序結(jié)果與中國(guó)人種hg19基因組數(shù)據(jù)對(duì)比，完成基因Mapping工作；同步分析多種基因突變類(lèi)型；分析生成腫瘤特有突變和種系突變。

7. tDNA提取與檢測(cè)

腫瘤組織采用Qiagen DNA提取試劑盒提取后應(yīng)用超聲破碎成300～350 bp，采用96 rxn xGen?Exome Research Panel v1.0試劑盒富集后建立高通量測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)Illumina Hiseq 4000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行600倍深度測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)通過(guò)生物信息學(xué)平臺(tái)整理成樣本突變信息。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以tDNA結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分析各病例外周血ctDNA對(duì)NSCLC基因突變的診斷效能，計(jì)算外周血ctDNA診斷NSCLC基因突變的敏感度、特異度及總體符合率。

結(jié)果

一、總體結(jié)果

32例NSCLC患者中，ctDNA檢出基因突變9種42例次，tDNA檢出基因突變11種40例次。

二、外周血ctDNA基因?qū)SCLC基因突變的診斷效能評(píng)價(jià)

以組織石蠟切片tDNA檢出的基因突變結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，外周血ctDNA對(duì)NSCLC基因突變的敏感度為75%～100%，特異度達(dá)95%～100%，與tDNA結(jié)果的總體符合率為91%～100%，見(jiàn)表1。其中，有2例患者tDNA中未檢出突變，但相應(yīng)外周血ctDNA中分別檢測(cè)出EGFR exon 19缺失和ERBB2突變。

討論

目前臨床上用于NSCLC患者基因突變檢測(cè)的主要是經(jīng)纖維支氣管鏡或肺穿刺活組織檢查獲取的tDNA，但是NSCLC在確診時(shí)超過(guò)70%的患者已為ⅢB 期、Ⅳ期，大部分不能手術(shù)，難以獲取腫瘤組織，而且腫瘤的生物學(xué)特性在經(jīng)過(guò)一系列治療后可能已經(jīng)發(fā)生改變，故每次治療前實(shí)時(shí)獲得腫瘤信息才能較準(zhǔn)確地反映腫瘤細(xì)胞特性，疾病進(jìn)展后再次獲取組織標(biāo)本可謂難上加難。因此，僅僅通過(guò)tDNA進(jìn)行NSCLC基因檢測(cè)為臨床治療、研究帶來(lái)很多不便，人們希望通過(guò)一些無(wú)創(chuàng)手段來(lái)獲取患者的基因信息。

表1

外周血ctDNA對(duì)NSCLC基因突變的診斷效能評(píng)價(jià)

注：EGFR為表皮生長(zhǎng)因子受體，exon為外顯子，TP53為腫瘤抑制蛋白P53，KRAS為鼠肉瘤病毒原癌同源體，ERBB2為表皮生長(zhǎng)因子受體2，PIK3CA為磷脂酰肌醇-3-激酶，F(xiàn)GFR4為成纖維生長(zhǎng)因子受體4，DPYD為二氫嘧啶脫氫酶編碼基因，BRAF為鼠肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1

血液ctDNA的釋放被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的自行分泌或凋亡、壞死有關(guān)[6]。同時(shí)由于檢測(cè)的無(wú)創(chuàng)性，可以作為“液體活檢”，成為良好的預(yù)后和預(yù)測(cè)分子指標(biāo)。早在1948年，法國(guó)學(xué)者M(jìn)andel等便發(fā)現(xiàn)了人類(lèi)血液中存在循環(huán)DNA。而直到30年后，Leon等首次報(bào)道腫瘤患者ctDNA水平高于正常人，且與患者的預(yù)后及療效有關(guān)。隨后人們發(fā)現(xiàn)血清ctDNA水平升高與腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期和患者生存有關(guān)，根據(jù)血清ctDNA水平可判斷患者的預(yù)后[7-8]。

2013年Dawson等[9]研究了30例接受了系統(tǒng)治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌女性患者，連續(xù)采集血漿標(biāo)本，采用定向或全基因組測(cè)序分析識(shí)別體內(nèi)基因改變，對(duì)ctDNA進(jìn)行個(gè)體化定量分析。與同期檢測(cè)的CA15-3及CTC相比，ctDNA水平呈現(xiàn)更廣的動(dòng)態(tài)范圍及與腫瘤負(fù)荷變化更強(qiáng)的相關(guān)性。在檢測(cè)中，ctDNA為19例中的10例女性提供較早的治療反應(yīng)檢測(cè)信息。他們認(rèn)為ctDNA是一種具有提示性、遺傳特性和高敏感度的轉(zhuǎn)移性乳腺癌生物標(biāo)記。

然而，由于循環(huán)中存在的ctDNA極其微量，對(duì)其替代tDNA成為腫瘤分子檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”造成障礙。2014年Newman等[10]將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于NSCLC患者血漿ctDNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)Ⅱ～Ⅳ期的NSCLC患者檢測(cè)敏感度達(dá)100%，Ⅰ期的NSCLC呈中敏感度(50%)；對(duì)各期肺癌的特異度均為96%。研究還表明，當(dāng)ctDNA比例低至0.019%的時(shí)候仍能夠被檢測(cè)到。有學(xué)者分別對(duì)10例樣本進(jìn)行活組織檢查和癌癥個(gè)體化深度測(cè)序(CAPP-Seq)檢測(cè)EGFR和KRAS，結(jié)果顯示CAPP-Seq并不比金標(biāo)準(zhǔn)腫瘤活組織檢查的診斷效能差，其也能準(zhǔn)確測(cè)定肺癌的基因型。高通量測(cè)序技術(shù)能一次對(duì)幾十萬(wàn)至幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，可以檢測(cè)到低于0.5%的基因突變，是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序革命性的改變，且其所需的DNA樣本量較少，適用于ctDNA這種微量DNA的檢測(cè)[11]。

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，分離外周血ctDNA并進(jìn)行多基因聯(lián)合檢測(cè)。結(jié)果顯示，以組織石蠟切片檢測(cè)出的tDNA作金標(biāo)準(zhǔn)，血漿ctDNA的敏感度為75%～100%，特異度為95%～100%，與tDNA結(jié)果的總體符合率為91%～100%。其中，有2例患者組織切片中未檢出突變，但相應(yīng)的血液中卻分別檢測(cè)出EGFR exon 19缺失和ERBB2突變，提示治療過(guò)程中腫瘤的基因突變可能發(fā)生了變化，組織切片無(wú)法反映治療前的實(shí)際基因突變情況?；蛘哂捎谀[瘤具有異質(zhì)性，組織標(biāo)本因?yàn)槿〔氖芟逕o(wú)法反映真實(shí)的基因表達(dá)情況。

外周血ctDNA是一種特征性的腫瘤生物標(biāo)記物，可實(shí)時(shí)反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展或治療過(guò)程中的信息，且與傳統(tǒng)的組織活檢標(biāo)本相比具有取材方便、無(wú)創(chuàng)、患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)本研究，我們發(fā)現(xiàn)用高通量測(cè)序技術(shù)能夠檢出極微量的外周血ctDNA基因突變，且與tDNA有較高的符合率。因而通過(guò)外周血檢測(cè)NSCLC基因突變代替腫瘤組織是切實(shí)可行的，有望替代受到標(biāo)本采集以及無(wú)法連續(xù)監(jiān)測(cè)和隨訪追蹤等諸多限制的組織切片。希望將來(lái)經(jīng)過(guò)更多臨床驗(yàn)證后，高通量測(cè)序技術(shù)能夠得到臨床推廣，并將肺癌分子診斷和個(gè)體化治療提高到一個(gè)新的水平。

參考文獻(xiàn)

[1]Diaz LA Jr, Bardelli A.Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J Clin Oncol,2014,32(6):579-586.

[2]Rolfo C, Castiglia M, Hong D, Alessandro R, Mertens I, Baggerman G, Zwaenepoel K, Gil-Bazo I, Passiglia F, Carreca AP, Taverna S, Vento R,Santini D, Peeters M, Russo A, Pauwels P.Liquid biopsies in lung cancer: the new ambrosia of researchers.Biochim Biophys Acta,2014,1846(2):539-546.

[3]Lebofsky R, Decraene C, Bernard V, Kamal M, Blin A, Leroy Q, Rio Frio T, Pierron G, Callens C, Bieche I, Saliou A, Madic J, Rouleau E, Bidard FC, Lantz O, Stern MH, Le Tourneau C, Pierga JY.Circulating tumor DNA as a non-invasive substitute to metastasis biopsy for tumor genotyping and personalizedmedicine in a prospective trial across all tumor types. Mol Oncol,2015,9(4):783-790.

[4]Madic J, Kiialainen A, Bidard FC, Birzele F, Ramey G, Leroy Q, Rio Frio T, Vaucher I, Raynal V, Bernard V, Lermine A, Clausen I, Giroud N, Schmucki R, Milder M, Horn C, Spleiss O, Lantz O, Stern MH, Pierga JY, Weisser M, Lebofsky R.Circulating tumor DNA and circulating tumor cells in metastatic triple negative breast cancer patients. Int J Cancer,2015,136(9):2158-2165.

[5]Bidard FC, Madic J, Mariani P, Piperno-Neumann S, Rampanou A, Servois V, Cassoux N, Desjardins L, Milder M, Vaucher I, Pierga JY, Lebofsky R, Stern MH, Lantz O. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uvealmelanoma. Int J Cancer,2014,134(5):1207-1213.

[6]Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients.Nat Rev Cancer, 2011,11(6):426-437.

[7]Avraham A, Uhlmann R, Shperber A, Birnbaum M, Sandbank J, Sella A, Sukumar S, Evron E.Serum DNA methylation for monitoring response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients.Int J Cancer,2012,131(7):E1166-E1672.

[8]Perrone F, Lampis A, Bertan C, Verderio P, Ciniselli CM, Pizzamiglio S, Frattini M, Nucifora M, Molinari F, Gallino G, Gariboldi M, Meroni E, Leo E, Pierotti MA,Pilotti S. Circulating free DNA in a screening program for early colorectal cancer detection. Tumori, 2014,100(2): 115-121.

[9]Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M, Biggs H, Rueda OM, Chin SF, Dunning MJ, Gale D, Forshew T, Mahler-Araujo B, Rajan S, Humphray S, Becq J, Halsall D,Wallis M, Bentley D, Caldas C, Rosenfeld N.Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.N Engl J Med,2013，368(13):1199-1209.

[10]Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, Modlin LA, Liu CL, Neal JW, Wakelee HA, Merritt RE, Shrager JB, Loo BW Jr, Alizadeh AA,Diehn M.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.Nat Med,2014,20(5):548-554.

[11]Couraud S, Vaca-Paniagua F, Villar S, Oliver J, Schuster T, Blanché H, Girard N, Trédaniel J, Guilleminault L, Gervais R, Prim N, Vincent M, Margery J, Larivé S, Foucher P, Duvert B, Vallee M, Le Calvez-Kelm F, McKay J, Missy P, Morin F, Zalcman G, Olivier M, Souquet PJ; BioCAST/IFCT-1002 investigators.Noninvasive diagnosis of actionable mutations by deep sequencing of circulating free DNA in lung cancer fromnever-smokers: a proof-of-concept study from BioCAST/IFCT-1002.Clin Cancer Res,2014,20(17):4613-4624.

The value of detection of gene mutations in peripheral circulating tumor DNA in non-small cell lung cancer

XuMin,HeWan,LiLan,ZhuMeiqin,ChenYixin,XuRuilian.

DepartmentofMedicalOncology,ShenzhenPeople’sHospital,theSecondClinicalMedicalCollegeofJi’nanUniversity,ShenzhenCancerInstitute,Shenzhen518020,China

【Abstract】ObjectivesTo investigate the value of gene mutations in peripheral circulating tumor DNA(ctDNA)in non-small cell lung cancer(NSCLC)by next-generation sequencing. MethodsThe gene mutations in peripheral ctDNA and tDNA of tissued paraffin sections in 32 advanced patients with NSCLC were simultaneously detected by next-generation sequencing, and regarded the tissue tumor DNA as the correct standard to evaluate the efficiency of ctDNA diagnosing the gene mutations in NSCLC. ResultsAmong 32 patients with NSCLC, 42 samples of gene mutations in 9 types were detected in terms of ctDNA and 40 samples of gene mutations in 11 types were detected in tDNA. The result of tDNA gene mutations was regarded as the correct standard. Sensitivity of detection of gene mutations in peripheral circulating tumor DNA was 75%～100%, and specificity was 95%～100%. The concordance rate between result of tDNA and ctDNA was 91%～100%. ConclusionTo test mutations in NSCLC patients, detection of ctDNA is possible to replace tumor tissue paraffin sections by NGS.

【Key words】Non-small cell lung cancer; Next-generation sequencing; Circulating tumor DNA

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.008

基金項(xiàng)目：深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20150403101146278)

通訊作者，許瑞蓮，E-mail：xuruilian@126.com

Corresponding author, Xu Ruilian, E-mail: xuruilian@126.com

(收稿日期：2016-02-24)(本文編輯：林燕薇)

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