張朝暉　徐小云　瞿星光　鄒文博　李靈豐　曾超　姚玲　鐘建華（三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北　宜昌　443003）

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葶藶子水提液對(duì)內(nèi)毒素致急性肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞水通道蛋白5表達(dá)的影響*

張朝暉徐小云△瞿星光鄒文博李靈豐曾超姚玲鐘建華
（三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院，湖北宜昌443003）

【摘要】目的觀察葶藶子水提液對(duì)內(nèi)毒素致急性肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞水通道蛋白5表達(dá)的影響。方法清潔級(jí)SD大鼠18只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、葶藶子治療組（治療組）共3組，尾靜脈注射內(nèi)毒素建立急性肺損傷模型后4 h處死大鼠。計(jì)量24 h尿量，收集血液樣本，測(cè)定血?dú)夥治?，摘取肺臟，稱重并計(jì)算肺系數(shù)，HE染色法觀察肺組織病理，并采用免疫電泳法測(cè)定通道蛋白5（AQP5）的表達(dá)。結(jié)果模型組、治療組肺濕重、肺系數(shù)與空白對(duì)照組相比，肺濕重、肺系數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；治療組肺濕重、肺系數(shù)與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組相比較，模型組大鼠24 h尿量有所減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；葶藶子治療組與模型組比較，大鼠24 h尿量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組、治療組與空白對(duì)照組相比，PaO2、PaCO2、pH均值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；治療組PaO2、PaCO2、pH與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肉眼觀，與對(duì)照組比較，模型組大鼠雙肺充血水腫、肺外周可見片狀炎性滲出、體積明顯增大，肺泡呈粉紅色，氣管內(nèi)有粉紅色分泌物溢出，或見血性胸水；模型組100倍鏡下示肺泡廣泛水腫及片狀炎細(xì)胞浸潤，局灶性出血，結(jié)構(gòu)輪廓幾乎喪失，部分肺泡受壓萎陷。肉眼觀，治療組較模型組大鼠雙肺腫脹減輕，肺表面光滑，彈性可；光鏡下治療組肺泡可見充血水腫，炎細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)及輪廓顯示不清，但較模型組明顯減輕，肺泡內(nèi)水腫液明顯減少，僅見炎細(xì)胞浸潤。電泳結(jié)果示，模型組APQ5蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)（P＜0.01），與模型組比較，葶藶子治療組可明顯上調(diào)APQ5蛋白表達(dá)。結(jié)論葶藶子有改善急性肺損傷的效果，這種作用可能與其改善水通道蛋白5含量或者活性有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】急性肺損傷葶藶子提取液水通道蛋白

急性肺損傷是一種以通透性肺水腫為特征的臨床綜合征，治療關(guān)鍵是清除肺泡水腫液。水通道蛋白（AQPs）是一種細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與水通透性有關(guān)，急性肺損傷發(fā)生后AQPs表達(dá)下降，機(jī)體清除水腫液能力下降，水腫液在肺泡間質(zhì)聚積而加重肺泡和間質(zhì)內(nèi)水腫。本實(shí)驗(yàn)在筆者前期臨床研究基礎(chǔ)上，通過對(duì)大鼠ATⅡ進(jìn)行分離和純化，觀察葶藶子水提液對(duì)急性肺損傷大鼠AQP5在ATⅡ上的表達(dá)的影響，從水通道角度研究葶藶子對(duì)急性肺損傷大鼠的作用及可能機(jī)制［1］，為臨床應(yīng)用葶藶子治療急性肺損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g（由華中科技大學(xué)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。大鼠自由飲水，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)條件：室溫20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2主要試劑小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；大鼠IgG（上海博蘊(yùn)生物有限公司）；內(nèi)毒素（LPS）（E．coil serotype 055：B5）；AQP5抗體（美國santa cruz公司）。其他試劑為國產(chǎn)分析純。葶藶子經(jīng)鑒定為南葶藶子Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl，由中藥飲片有限責(zé)任公司提供。AQP5原位雜交試劑盒和免疫組化試劑盒（均由博士德生物工程有限公司提供）。

1.3葶藶子水提液的制備取8倍量70℃水浴提取葶藶子200 g 3次，每次1 h，合并濾液濃縮至100 mL 使1 mL相當(dāng)于2 g原生藥。

1.4造模分組及給藥健康SD大鼠18只，禁食不禁水12 h后手術(shù)。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、葶藶子干預(yù)治療組3組。模型組和治療組則分別經(jīng)尾靜脈注射LPS建立急性肺損傷模型；治療組造模成功后給予葶藶子提取液1周，參考文獻(xiàn)［2］劑量15 g/kg。

1.5觀察指標(biāo)1）干濕比重、尿量及血?dú)夥治鰷y(cè)定：給藥1周后將大鼠稱質(zhì)量，禁食不禁水，置于代謝籠中24 h，收集尿液并計(jì)量；24 h后留取動(dòng)脈血標(biāo)本，進(jìn)行血?dú)夥治?；處死大鼠后仰臥固定于解剖操作臺(tái)上，開胸暴露氣管，將左主支氣管結(jié)扎，全肺稱質(zhì)量后計(jì)算肺系數(shù)（肺系數(shù)=全肺濕重/體質(zhì)量×100%）。2）形態(tài)學(xué)研究：稱重后取左側(cè)肺組織固定于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋，3 μm切片，行伊紅-蘇木素染色。3）肺臟AQP5蛋白表達(dá)：Western-blot法測(cè)定肺臟AQP5蛋白表達(dá)，分組各取右肺中葉組織勻漿提取肺組織蛋白，凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗兔抗AQP5抗體（1∶1000；Cell Signaling Technology公司）；兔二抗（HRP標(biāo)記羊抗兔IgG）37℃孵育1 h，化學(xué)發(fā)光，顯影、定影，凝膠成像系統(tǒng)行目的蛋白及內(nèi)參條帶β-actin灰度分析，二者灰度比值為各蛋白表達(dá)強(qiáng)度。4）肺組織總蛋白：BCA試劑盒測(cè)定肺組織勻漿離心上清液中的總蛋白。5）腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平：ELISA法分別測(cè)定肺組織勻漿上清、BALF和血清中TNF-α（肺組織勻漿TNF-α=肺組織勻漿上清TNF-α/肺組織勻漿上清蛋白）。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示。多組間均數(shù)比較均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠肺濕重、肺系數(shù)及24 h尿量比較見表1。結(jié)果示，模型組、治療組肺濕重、肺系數(shù)與空白對(duì)照組相比，肺濕重、肺系數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；治療組肺濕重、肺系數(shù)與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組相比較，模型組大鼠24 h尿量有所減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；葶藶子治療組與模型組比較，大鼠24 h尿量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1　各組大鼠肺濕重、肺系數(shù)及24 h尿量比較（±s）

表1　各組大鼠肺濕重、肺系數(shù)及24 h尿量比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別　n　24 h尿量（mL）治療組　6　23.36±2.11*△△對(duì)照組　6　18.87±1.23模型組　6　12.48±0.29全肺濕重（g）　肺系數(shù)（%）3.03±0.21*△　1.00±0.09*△2.26±0.11　0.75±0.06 3.48±0.19**　0.33±0.04**

2.2各組血?dú)夥治霰容^見表2。模型組、治療組與空白對(duì)照組相比，PaO2、PaCO2、pH均值差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；治療組PaO2、PaCO2、pH與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　各組血?dú)夥治霰容^（±s）

表2　各組血?dú)夥治霰容^（±s）

組別n　pH治療組　6　7.35±0.01*△對(duì)照組　6　7.39±0.05模型組　6　7.22±0.04**PaO2（mmHg）PaCO2（mmHg）86.05±2.34*△　46.07±3.15*△97.25±2.11　42.71±1.46 68.68±3.19**　66.32±3.24**

2.4各組病理形態(tài)學(xué)改變見圖1。肉眼觀，與對(duì)照組比較，模型組大鼠雙肺充血水腫、肺外周可見片狀炎性滲出、體積明顯增大，肺泡呈粉紅色，氣管內(nèi)可見粉紅色分泌物，或見血性胸水；模型組100倍鏡下示肺泡廣泛水腫及片狀炎細(xì)胞浸潤，局灶性出血，結(jié)構(gòu)輪廓幾乎喪失，部分肺泡受壓萎陷。肉眼觀，治療組較模型組大鼠雙肺腫脹減輕，肺表面光滑，彈性可；光鏡下治療組肺泡可見充血水腫，炎細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)輪廓顯示不清，但較模型組明顯減輕，肺泡內(nèi)水腫液明顯減少，僅見炎細(xì)胞浸潤。

圖1　各組病理形態(tài)學(xué)改變（HE，×100）

2.5各組APQ5蛋白免疫印跡電泳表達(dá)比較見圖2。電泳結(jié)果示，模型組APQ5蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)，與模型組比較，葶藶子治療組可明顯上調(diào)APQ5蛋白表達(dá)。

圖2　各組病理形態(tài)學(xué)改變

3　討論

一般認(rèn)為，肺水腫主要由于肺泡上皮/微血管內(nèi)皮屏障功能失調(diào)及肺泡間隙受損所致，而對(duì)AQPs調(diào)節(jié)水的轉(zhuǎn)運(yùn)、維持肺液平衡的作用認(rèn)識(shí)不足。

現(xiàn)已證實(shí)有4種（AQPI、3、4、5）水通道蛋白與急性肺損傷有密切關(guān)系，水通道蛋白，AQP5主要分布于肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡I型上皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞上，研究證實(shí)AQP5敲除小鼠肺泡和毛細(xì)血管間的滲透性、水通透性均降低90%以上［4］，表明AQP5可能參與了急性肺損傷的發(fā)生。LPS致肺損傷動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，AQP1和AQP5表達(dá)下調(diào)［5］。王玨實(shí)驗(yàn)研究表明，在模型組大鼠胸水中AQP1含量高于各治療組［6］。AQPs表達(dá)量或功能失調(diào)降低了肺損傷時(shí)其對(duì)肺組織中過多液體的清除能力，加重了肺泡和間質(zhì)水腫，從而進(jìn)一步影響AQPs表達(dá)，導(dǎo)致病情惡化。筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在急性肺損傷大鼠肺臟中AQP5表達(dá)明顯低于正常大鼠，進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)論。

“葶藶子為肺家氣分藥，大瀉肺之力尤強(qiáng)”（《藥性論》）。北宋《開寶本草》述該藥為“療肺壅上氣咳嗽，止喘促，除胸中痰飲”。李時(shí)珍曰“肺中水氣賁郁滿急者，非此不能”?？梢娸闼炞右酝ɡ郎浦我簧砩舷聝?nèi)外之水氣留滯之病為特長。藥理研究證實(shí)［7-8］，葶藶子以其利尿作用，從而達(dá)到降低靜水壓的效果，根據(jù)Starlnig定律不難推測(cè)，葶藶子可以增加肺泡至肺毛細(xì)血管的液體的通透性。前期筆者采用葶藶子為君藥的葶藶大棗瀉肺湯在ICU中治療胸腔積液、肺水腫、腦水腫等危重病患者，均取得了良好的療效［9-11］；在筆者的研究也發(fā)現(xiàn)葶藶子不僅可以顯著減輕肺水腫及肺瘀血，而且改善了肺損傷大鼠的動(dòng)脈血?dú)狻?/p>

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為傷津、耗液，不僅是水分的消耗，也可使正氣受損導(dǎo)致組織細(xì)胞功能受損，甚至形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。肺之“輸布津液”與“宣發(fā)肅降”功能與氣管黏液分泌、肺泡腔和血管腔間水的轉(zhuǎn)運(yùn)及選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)水液的AQPs與津液代謝相關(guān)，表明AQPs可能是中醫(yī)學(xué)津液病證產(chǎn)生的分子學(xué)基礎(chǔ)之一［11-13］。本研究結(jié)果示，葶藶子治療組肺水腫效果明顯，AQP5蛋白表達(dá)增加，表明AQP5可能參與了肺水腫的發(fā)病，而葶藶子改善肺損傷可能通過上調(diào)AQP5表達(dá)發(fā)揮作用。

綜上所述，針對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，葶藶子提取液有效地改善了急性肺損傷引起肺淤血、肺水腫及動(dòng)脈血?dú)飧淖?；這種效果可能與其改善水通道蛋白5含量或者活性有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

［1］馬梅芳，呂文海.葶藶子近30年研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息，2005，22（5）：35-36.

［2］周澤斌，劉素君，王應(yīng)，等.葶藶子水提液對(duì)CHF大鼠利尿作用的影響［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27（3）：211-213.

［3］Krane CM.Aquapoein 5-deficient mouse lungs are hyperre2sponsive to cholinergic stimulation［J］.Proc Natl Acad Sci，2001，98（3）：14114-14119.

［4］Jiao GY，Li ER，Yu RJ．Decreased expression of AQP1 and AQP5 in acute injured lung in rats［J］．Chin Med J，2002，115 （7）：963-967.

［5］江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典（下冊(cè)）［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986：2320.

［6］王玨.瀉肺逐飲湯對(duì)惡性胸腔積液大鼠TGF-β1、AQP1、CTLA-4和PFP的影響［D］.哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

［7］南京藥學(xué)院.中草藥學(xué)（中冊(cè)）［M］.南京：江蘇人民出版社，1976：370.

［8］許銀姬，陳遠(yuǎn)彬，王麗麗，等.青天葵對(duì)內(nèi)毒素致急性肺損傷大鼠肺水通道蛋白1和5表達(dá)的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010，28（6）：163-165.

［9］周剛，張朝暉.ICU中應(yīng)用葶藶大棗瀉肺湯治療危重癥［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（2）：108.

［10］夏昔.葶藶大棗瀉肺湯在治萬中毒性肺水腫中的應(yīng)用［J］.上海中醫(yī)藥雜志，1993，39（8）：23-25.

［11］胡利群，丁建中.水通道蛋白與肺部疾病研究進(jìn)展［J］.長江大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，5（4）：83-86.

［12］楊光，林明俠，萬羽.葶藶子的藥理作用及臨床應(yīng)用概況［J］.中醫(yī)藥信息，2001，18（2）：12-13.

［13］馬梅芳，呂文海.葶藶子近30年研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息，2005，22（5）：35-36.

·研究報(bào)告·

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Effects of Semen Lepidii on the Expression of Aquaporin-5 of Alveolar Cells TypeⅡin Rats with Endotoxin Induced Acute Lung Injury

ZHANG Zhaohui，XU Xiaoyun，QU Xingguang，et al.Department of ICU，the First College of Clinical Medical Science，Three Gorges University & Yichang Central People′s Hospital，Hubei，Yichang 443003，China.

【Abstract】Objective：To observe the effect of semen lepidii on the expression of aquaporin-5 of alveolar cells typeⅡin rats with endotoxin induced acute lung injury.Methods：18 Clean SD rats were randomly divided into the control group，the model group and lepidii group.The model of acute lung injury was established with tail vein injection of endotoxin，and the rats were executed 4 hours after successful modeling.24 hours urine output was measured.The blood was collected and blood gas analysis was detected.Both lungs were removed and weighed.The lung coefficient was calculated.HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue and the expression of AQP5 was detected with the method of immuno electrophoresis.Results：Compared with the control group，there was statistical significance in the level of lung wet weight and lung coefficient of the model group and lepidii group（P＜0.01），as well as in the comparison of lepidii group and the model group（P＜0.05）.Compared with the control group，24 hours urine output of the model group decreased a little，without statistical significance（P＞0.05）.However，it was opposite in the comparison between the lepidii group and the model group （P＜0.01）.The mean difference in PaO2，PaCO2and PH among the three groups had statistical significance（P＜0.01），as well as in the comparison of lepidii group and the model group（P＜0.05）.Gross appearance showed that compared with the control group，there was congestion and edema in both lungs and patchy inflammatory exuda-tion in peripheral lung in the model group；volume increased significantly with pink alveolar，pink secretion from airway and maybe bloody pleural fluid.100 times under the light microscope，there was alveolar edema，patchy inflammatory exudation and focal hemorrhages；structure outlines were almost lost；part of alveolar collapsed because of pressure.Gross appearance showed that compared with the model group，edema in both lungs relieved with smooth surface and resilience.Under the light microscope，there was congestion and edema in alveolar，inflammatory exudation，vague outlines in lepidii group.However，compared with the model group，the alveolar edema was significantly decreased，only seeing inflammatory exudation.Electrophoresis results showed that the drop of APQ5 expression in the model group was more obvious than that of the control group（P＜0.01），and compared with the model group，the increase of APQ5 expression in lepidii group was more obvious.Conclusion：Lepidii can improve acute lung injury，which may be related with its improvement on the content or activity of aquaporin-5.

【Key words】Acute lung injury；Semen lepidii；Aquaporin

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）04-0606-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.012

*基金項(xiàng)目：湖北省宜昌市科技攻關(guān)項(xiàng)目

通信作者△（電子郵箱：1410956890@qq.com）

收稿日期（2015-11-02）