陳榮良　杜偉斌　全仁夫（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院，浙江　杭州　311201）

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針刺夾脊穴及督脈穴對(duì)急性脊髓損傷神經(jīng)傳導(dǎo)通路影響的研究*

陳榮良杜偉斌全仁夫△
（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬江南醫(yī)院，浙江杭州311201）

【摘要】目的探討針刺夾脊穴及督脈穴對(duì)急性脊髓損傷神經(jīng)傳導(dǎo)通路的影響和作用機(jī)制。方法取健康清潔級(jí)新西蘭兔80只，將其按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、假手術(shù)組、針刺穴位組、甲基強(qiáng)的松龍（MP）療法組，每組16只，造模成功后進(jìn)行MR檢測(cè)鑒定。正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、假手術(shù)組不予任何治療。針刺組、MP沖擊療法組采用改良Allens法制作脊髓中度損傷模型后，針刺組給予夾脊穴及督脈穴電針治療，采用連續(xù)脈沖，頻率2 Hz，輸出電流0.6～1 mA，每次30 min，每日1次，共7次；MP療法組造模后即按30 mg/kg首劑靜注1次，1 h后即開始應(yīng)用按5.4 mg/kg計(jì)算23 h總量，分4次靜脈注射。1周后對(duì)各組兔子進(jìn)行一般行為，神經(jīng)功能，損傷截段HE染色，辣根過氧化物酶（HRP）逆行示蹤評(píng)價(jià)和對(duì)比。結(jié)果在精神狀況、反應(yīng)能力、活動(dòng)度方面，術(shù)后7 d時(shí)正常對(duì)照組、假手術(shù)組動(dòng)物均基本恢復(fù)至術(shù)前水平，針刺穴位組較MP療法組、模型對(duì)照組恢復(fù)狀況要好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常對(duì)照組Reuter評(píng)分無變化，假手術(shù)組術(shù)后7 d恢復(fù)到術(shù)前水平；模型對(duì)照組、MP療法組、針刺穴位組術(shù)后7 d Reuter評(píng)分均降低，針刺穴位組與模型對(duì)照組、MP療法組比較降低更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。急性脊髓損傷7 d后，HRP呈藍(lán)黑色表達(dá)于脊髓灰質(zhì)中，相較于模型組，針刺組與MP組明顯使受損脊髓組織表達(dá)更多，但可能是時(shí)間原因，仍無法達(dá)到假手術(shù)組水平，提示針灸對(duì)脊髓神經(jīng)通路的再通是有一定作用的；與此同時(shí)，針灸組與MP組比較，無明顯差異。而HRP陽性表達(dá)強(qiáng)度的光密度值與HE染色結(jié)果吻合。結(jié)論針刺能明顯改善急性脊髓損傷的神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能，其機(jī)制可能為調(diào)節(jié)紅核神經(jīng)元細(xì)胞，使得損傷截段神經(jīng)通路修復(fù)而產(chǎn)生作用。

【關(guān)鍵詞】針刺脊髓損傷神經(jīng)傳導(dǎo)夾脊穴督脈穴

脊髓損傷是臨床上常見而嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)主要為神經(jīng)功能障礙如大小便失禁等，嚴(yán)重者可引起不同程度的截癱，甚至危及生命［1-2］。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，外傷性脊髓損傷的年發(fā)病率逐年上升［3］。近年來，運(yùn)用中醫(yī)藥手段研究神經(jīng)退行性疾病也日益增多［4］。本實(shí)驗(yàn)以針刺夾脊穴與督脈穴，觀察干預(yù)后兔子神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能變化，紅核神經(jīng)元細(xì)胞逆行性損傷情況，探討針刺對(duì)脊髓損傷功能的影響及可能的作用機(jī)理。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

純種健康新西蘭家兔80只，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，分組實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器

一次性華佗牌針灸儀、電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠），辣根過氧化物酶（HRP）（sigma公司），甲醛、二甲苯、無水乙醇、30%H2O2（上海國藥集團(tuán)），BSA（北京索萊寶生物科技有限公司），DAB濃縮型試劑盒（上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司），中性樹脂（上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司），PBS（磷酸鹽緩沖液）固定液。

1.3動(dòng)物分組與造模

將80只新西蘭家兔按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組，每組16只，具體分組為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、假手術(shù)組、針刺穴位組、MP療法組。造模方法：采用改良Allens法及參考文獻(xiàn)［5-6］制作脊髓中度損傷新西蘭家兔模型。術(shù)區(qū)常規(guī)剪毛、消毒、耳緣靜脈注射烏拉坦麻醉急性脊髓損傷新西蘭家兔后，取俯臥位，背部正中切開，以T13為中心，暴露一個(gè)椎體，咬除T13～L1棘突及椎板，暴露0.5 cm寬硬膜。用克氏針（質(zhì)量10 g）沿導(dǎo)管從80 mm高處垂直自由下落，打擊在薄塑料材料制成的半圓片（直徑4 mm、寬2 mm）上，造成脊髓后角中度損傷。打擊成功后逐層縫合。術(shù)后每天采用Crede手法按摩新西蘭家兔腹部，輔助排便、排尿2～4次，同時(shí)青霉素80萬U，肌注，連續(xù)2 d。

1.4動(dòng)物干預(yù)

正常對(duì)照組：正常新西蘭家兔，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，不予任何處理，共觀察1周；模型對(duì)照組：復(fù)制急性脊髓損傷新西蘭家兔模型，每天肌注青霉素80萬U，連續(xù)2 d，預(yù)防創(chuàng)口感染，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，共觀察1周；假手術(shù)組：常規(guī)手術(shù)咬除新西蘭家兔T13～L1棘突及全部椎板，暴露寬硬膜，不予撞擊脊髓及電刺激，喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，每天肌注青霉素80萬U，連續(xù)2 d，預(yù)防創(chuàng)口感染，共觀察1周；針刺組：急性脊髓損傷新西蘭家兔模型建立后每日給予1次針刺治療，用毫針選取相應(yīng)穴位針刺（選取受損脊髓節(jié)段上下兩對(duì)夾脊穴及督脈穴），進(jìn)針采用手法進(jìn)針結(jié)合韓氏治療儀進(jìn)行1次電針治療：每次治療時(shí)間30 min，采用頻率2 Hz，電流0.6～1 mA的連續(xù)脈沖，；喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，每天肌注青霉素80萬U，連續(xù)2 d，預(yù)防創(chuàng)口感染，共觀察1周；甲基強(qiáng)的松龍（MP）療法組：急性脊髓損傷新西蘭家兔造模后即按30 mg/ kg首劑靜注MP 1次，1 h后即開始應(yīng)用按5.4 mg/kg計(jì)算23 h總量，分4次靜脈注射，不予針灸治療；喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料，每天肌注青霉素80萬U，連續(xù)2 d，預(yù)防創(chuàng)口感染，共觀察1周。

1.5模型檢測(cè)與方法

術(shù)后行脊髓MRI掃描。造模得到正常對(duì)照組、假手術(shù)組Tarlov評(píng)分為5分，MRI顯示T13的T2WI信號(hào)正常，可見清晰的腦脊液通過；模型對(duì)照組、針刺穴位組、MP療法組Tarlov評(píng)分為0分，MRI顯示在脊髓T13損傷周圍T2WI明顯的高信號(hào)，表明脊髓斷端周圍充血、水腫，表明脊髓損傷造模成功。

1.6檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1新西蘭家兔的一般行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)開始后每天觀察大白兔的精神狀況、反應(yīng)能力、活動(dòng)度、攝食量、攝水量以及存活數(shù)等。

1.6.2新西蘭家兔的神經(jīng)功能評(píng)分1）采用改良Tarlov評(píng)分法［7］，對(duì)兔后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)定，評(píng)分前所有動(dòng)物均檢查膀胱是否充盈，防止因膀胱充盈而影響活動(dòng)。評(píng)分采用雙人、雙盲法，評(píng)分者為非本實(shí)驗(yàn)組人員且熟知評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每人分別對(duì)兔一側(cè)后肢獨(dú)立進(jìn)行功能評(píng)估，每項(xiàng)指標(biāo)共測(cè)定3次，取平均值；2）根據(jù)Reuter脊髓感覺運(yùn)動(dòng)反射功能評(píng)分方法［8］，對(duì)各組兔術(shù)后脊髓感覺、運(yùn)動(dòng)反射功能進(jìn)行評(píng)分，具體標(biāo)準(zhǔn)如下。牽張反射：正常0分；輕微增強(qiáng)/減弱1分；亢進(jìn)/消失2分。疼痛回縮反射：快速0分；遲緩1分；消失2分。背部感覺：完全0分；部分1分；消失2分。肌張力：正常0分；低張力/高張力1分；遲緩/痙攣2分。運(yùn)動(dòng)能力：能行走0分；僅能站立1分；能隨意移動(dòng)后肢2分；不能隨意移動(dòng)后肢3分。

1.6.3新西蘭家兔脊髓組織病理學(xué)各組于實(shí)驗(yàn)7 d后采取標(biāo)本，對(duì)新西蘭家兔切開左心室及右心房，從左心室沿主動(dòng)脈方向插管，快速灌入生理鹽水直至回右心房的灌注液清亮，再快速灌入4%的多聚甲醛PD液，流量控制在50 mL/min，灌注3～4 min，接著以10 mL/min，維持灌注20 min，取出T13～L1椎體對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓1 cm，給予標(biāo)號(hào)，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。采用常規(guī)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察新西蘭家兔T13～L1節(jié)段脊髓組織的病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6.4HRP逆行示蹤實(shí)驗(yàn)7 d后動(dòng)物被麻醉后，仔細(xì)分離標(biāo)本肌肉尋找坐骨神經(jīng)，用眼科鑷輕輕托起坐骨神經(jīng)，用微量注射器慢慢注入30%HRP 5 μL左右，留針10 min 24～48 h后，取脊髓橫斷傷上端靠近損傷處脊髓。4%多聚甲醛固定8～12 h后冷凍切片，行HRP-DAB-硫酸鎳胺增強(qiáng)法顯色。光學(xué)顯微鏡下200倍下讀片，觀察脊髓橫斷面上HRP陽性表達(dá)強(qiáng)度，對(duì)7 d后的切片隨機(jī)抽取5張進(jìn)行進(jìn)行光密度值計(jì)數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1各組行為學(xué)及神經(jīng)功能評(píng)分

見表1。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在術(shù)后首日因麻醉、驚嚇等原因普遍精神較差，后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、攝食量、攝水量均不同程度好轉(zhuǎn)，無實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。在精神狀況、反應(yīng)能力、活動(dòng)度方面，實(shí)驗(yàn)7 d時(shí)正常對(duì)照組、假手術(shù)組動(dòng)物均基本恢復(fù)至術(shù)前水平，針刺穴位組較MP療法組、模型對(duì)照組恢復(fù)狀況要好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　各組各時(shí)間點(diǎn)Tarlov評(píng)分比較（分，±s）

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05；與MP組療法比較，△P＜0.05。下同。

組別n　術(shù)后7 d正常對(duì)照組　16　5.00±0.00假手術(shù)組　16　4.86±0.33模型對(duì)照組　16　1.38±0.48術(shù)后1 d　術(shù)后3 d 5.00±0.00　5.00±0.00 4.75±0.43　4.75±0.43 0.25±0.43　1.00±0.50 MP療法組　16　2.25±0.43 0.13±0.33　1.38±0.48針刺穴位組　16　0.13±0.33　1.50±0.50　2.63±0.48*△

2.2各組Reuter脊髓感覺運(yùn)動(dòng)反射功能評(píng)分結(jié)果比較

見表2。結(jié)果示正常對(duì)照組Reuter評(píng)分無變化，假手術(shù)組術(shù)后7 d恢復(fù)到術(shù)前水平；模型對(duì)照組、MP療法組、針刺穴位組術(shù)后7 d Reuter評(píng)分均降低，針刺穴位組與模型對(duì)照組、MP療法組比較降低更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　各組各時(shí)間點(diǎn)Reuter評(píng)分比較（分，±s）

表2　各組各時(shí)間點(diǎn)Reuter評(píng)分比較（分，±s）

組別n　術(shù)后7 d正常對(duì)照組　16　0.00±0.00假手術(shù)組　16　0.00±0.00模型對(duì)照組　16　8.00±0.72術(shù)后1 d　術(shù)后3 d 0.00±0.00　0.00±0.00 1.00±0.50　0.38±0.48 9.50±1.32　8.63±0.86 MP療法組　16　6.25±0.66 9.38±1.32　7.34±0.70針刺穴位組　16　9.38±1.22　6.88±0.71　5.23±0.68*△

2.3各組脊髓病理結(jié)果

HE染色結(jié)果提示假手術(shù)組與正常對(duì)照組無明顯區(qū)別。模型組損傷明顯，脊髓組織正常結(jié)構(gòu)喪失，可見片狀出血、水腫、壞死區(qū)，部分尼氏小體消失，灰質(zhì)中可形成微小空腔，部分甚至有較大的空腔，有膠質(zhì)細(xì)胞增生，局部損傷區(qū)域淋巴細(xì)胞浸潤；與模型組相比，MP組使用了甲強(qiáng)龍沖擊療法后，組織碎裂未見明顯改善，仍有少許出血及炎性細(xì)胞浸潤；與針刺組比較，神經(jīng)元細(xì)胞留存相對(duì)減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生增加，提示針灸修復(fù)/保存神經(jīng)元細(xì)胞方面有優(yōu)勢(shì)。

2.4各組HRP表達(dá)結(jié)果

術(shù)后7 d，正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型對(duì)照組、MP療法組、針刺穴位組HRP表達(dá)光密度值分別為（591.23± 46.98）、（576.45±47.63）、（437.86±46.17）、（515.13±40.49）、（502.36±46.59）。提示在急性脊髓損傷7 d后，HRP呈藍(lán)黑色表達(dá)于脊髓灰質(zhì)中，相較于模型組，針刺組與MP組明顯使受損脊髓組織表達(dá)更多，但可能是時(shí)間原因，仍無法達(dá)到假手術(shù)組水平，提示針灸對(duì)脊髓神經(jīng)通路的再通是有一定作用的；與此同時(shí)，針灸組與MP組比較，無明顯差異。而HRP陽性表達(dá)強(qiáng)度的光密度值與HE染色結(jié)果吻合。

3　討論

目前臨床尚無一種方法能夠完全治愈脊髓損傷所造成的后遺癥［9］，脊髓損傷修復(fù)的研究策略主要包括藥物治療、組織移植治療、細(xì)胞移植治療等，但都有其局限性［10-14］。大劑量MP療法在以往臨床中被用作治療急性脊髓損傷的首選，但隨后也有研究結(jié)果顯示，MP治療急性脊髓損傷療效較弱。進(jìn)而尋求一種可接受性強(qiáng)，無明顯毒副作用等優(yōu)點(diǎn)的治療手段越來越被探索。

脊髓損傷屬于中醫(yī)學(xué)“截癱”“痿證”等范疇，其病因病機(jī)認(rèn)為是督脈受損。督脈損則氣亂血溢，手足三陽經(jīng)氣不通，陽氣不達(dá)四末，筋經(jīng)失養(yǎng)，而見肢體麻木，不能活動(dòng)等征象［15］。脊髓損傷以后，紅核脊髓束可以產(chǎn)生延遲性的變性壞死，進(jìn)而紅核神經(jīng)元發(fā)生凋亡，這種延遲性的逆行性中樞神經(jīng)元損傷嚴(yán)重影響了脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)。HRP逆行示蹤技術(shù)可以對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)修復(fù)狀況進(jìn)行可靠的形態(tài)學(xué)評(píng)判［16-17］。

本實(shí)驗(yàn)選取損傷節(jié)段上下的兩對(duì)夾脊穴及上下兩個(gè)督脈穴，他們分別屬于節(jié)段疊加配穴范疇和中軸貫通配穴范疇［18-19］，對(duì)上述穴位進(jìn)行有效針刺并加以電刺激。結(jié)果顯示，由于脊髓損傷，逆行性地使紅核神經(jīng)元細(xì)胞受損，兔子的神經(jīng)功能受到了嚴(yán)重破壞。而針刺激組經(jīng)過1周的干預(yù)，HRP逆行標(biāo)記的細(xì)胞要明顯多于其他組別。HE染色也同時(shí)驗(yàn)證了針刺激組的出血、水腫、壞死區(qū)得到了更好的緩解和修復(fù)。干預(yù)1周時(shí)，針刺激組行為功能，神經(jīng)功能恢復(fù)也同時(shí)優(yōu)于其他組別，這也間接提示了紅核損傷程度與行為功能恢復(fù)的相關(guān)性。究其可能的作用機(jī)制，也許是電刺激通過上下節(jié)段的神經(jīng)根穿越損傷脊髓的外圍，并又將電流貫通損傷脊髓區(qū)域，從而抑制紅核神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)通路修復(fù)和再生的反饋調(diào)節(jié)作用。

綜合上述，本研究通過針刺夾脊穴及督脈穴治療急性脊髓損傷發(fā)現(xiàn)，其可有效改善急性脊髓損傷的神經(jīng)和運(yùn)動(dòng)功能。其作用機(jī)制可能是阻斷逆行性中樞神經(jīng)元損傷途徑，抑制紅核神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，使得損傷截段神經(jīng)通路修復(fù)而產(chǎn)生作用。但是，脊髓損傷的修復(fù)畢竟是一個(gè)多系統(tǒng)的復(fù)雜過程。這需要我們深入研究，發(fā)揮中醫(yī)藥、針灸的作用優(yōu)勢(shì)，更進(jìn)一步研究其更加具體可靠的作用機(jī)制，并為臨床治療提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Study on the Effects of Needling Hua Tuo Jiaji Points and Du Meridian Points on Acute Spinal Cord Injury（sci）Nerve Conduction Pathway

CHEN Rongliang，DU Weibin，QUAN Renfu.Xiaoshan Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang University of Chinese Medicine，Zhejiang，Hangzhou 311201，China.

【Abstract】Objection：To explore the effects and mechanism of needling Hua Tuo Jiaji points and Du meridian points on acute spinal cord injury（sci）nerve conduction pathway.Methods：80 health clean New Zealand rabbits were randomly divided into 5 groups according to random number table method：the normal control group，the model control group，sham operation group，acupuncture group and MP shock therapy group，16 cases in each.After establishing models，MR detection identification was taken.The normal control group，the model control group and sham operation group will not take any treatment.The spinal cord injury model was made with modified Allens method in MP shock therapy group，while the acupuncture group was treated by Electroacupuncturing Hua Tuo Jiaji points and Du meridian acupuncture points，with continuous pulse，frequency of 2 hz and output current 0.6～1 mA for 30 min，once a day for seven days.MP shock therapy group took 30 mg/kg first agent static note 1 time after established models，1 h after the start application according to 5.4 mg/kg to calculate total 23 h，intravenous four times.1 week later，the rabbit general behavior，nerve function and HE staining of damage the cut section，HRP retrograde tracer of each groups were evaluated and compared.Results：1 week later，general behavior of each group was improved.For neural function，Acupuncture and MP groups were obviously better than the control group（the difference was statistically significant，P＜0.01）.HE staining showed hemorrhage，edemaand necrosis area of the acupuncture group were obviously better than those of the model control group and neurons and glial cells were improved.HRP retrograde tracer in the acupuncture group and MP group was better than that of the model group，and absorbance difference was statistically significant compared with the model group（P＜0.05）.Conclusion：Acupuncture can obviously improve the acute spinal cord injury of nerve and motor function，whose mechanism may be to adjust the red nucleus neurons and finnaly make the damage cut section of the neural pathways repair.

【Key words】Acupuncture；Spinal cord injury；Nerve conduction；Hua Tuo Jiaji points；Du meridian points

中圖分類號(hào)：R246

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）04-0619-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.016

*基金項(xiàng)目：浙江省杭州市醫(yī)療衛(wèi)生及重點(diǎn)?？茖２】蒲泄リP(guān)專項(xiàng)（20140733Q43）；浙江省杭州市蕭山區(qū)科技局社會(huì)發(fā)展類重大項(xiàng)目（2013313）

通信作者△（電子郵箱：quanrenfu@126.com）

收稿日期（2015-09-02）