林冬枝，董彥君

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)中心，上海師范大學(xué)遺傳研究所，上海200234）

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Bt抗蟲基因?qū)肷虾Ｖ髟跃酒贩N‘秀水134’的研究

林冬枝，董彥君*

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物種質(zhì)資源開發(fā)中心，上海師范大學(xué)遺傳研究所，上海200234）

摘 要：為培育適宜上海地區(qū)種植的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲粳型水稻品種，采用傳統(tǒng)輪回育種與現(xiàn)代分子育種手段結(jié)合，將我國第一個通過安全評估的水稻品種‘華恢1號’中的Bt基因CrylAb/CrylAc轉(zhuǎn)育到上海主栽粳稻品種‘秀水134’中，育成了回交3次自交7代（BC3F7）品系‘Bt秀水134’；該品系在生育期、形態(tài)、產(chǎn)量及品質(zhì)上與‘秀水134’相近或略好，可作為后續(xù)抗蟲育種材料，也可作為上海地區(qū)推廣轉(zhuǎn)基因抗蟲粳稻的儲備品種。

關(guān)鍵詞：水稻；Bt基因；性狀；分子育種

水稻是全球最重要的糧食作物之一，世界近半數(shù)人以稻米為主食。我國是世界上最大的產(chǎn)稻國，水稻產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的1/3［1］，因此水稻生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有十分重要的位置。水稻是受蟲害影響最為嚴(yán)重的農(nóng)作物之一［2］。長期以來，危害我國水稻的主要害蟲有螟蟲（稻縱卷葉螟、二化螟、三化螟）和稻飛虱［3］，每年因蟲害造成水稻產(chǎn)量損失約為10%［4］?；瘜W(xué)防治一直是水稻生產(chǎn)上害蟲防治的主要方法，但在減輕蟲害、提高水稻產(chǎn)量的同時也產(chǎn)生了新的問題?；瘜W(xué)殺蟲劑的大量使用不僅造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染、生態(tài)失衡，而且提高了生產(chǎn)成本，還有可能降低稻米品質(zhì)，以及害蟲本身產(chǎn)生抗藥性等問題。我國南方水稻生長季節(jié)易發(fā)生蟲害，在上海、浙江、江蘇等粳稻種植地區(qū)更為嚴(yán)重。因此，在這些地區(qū)更需要培育具有抗蟲效果的粳稻品種。

目前，抗蟲水稻都是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蘇云金芽胞桿菌的殺蟲蛋白基因（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）作為外源基因?qū)胨精@得的，對鱗翅目害蟲（如稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟等）具有良好的抗性［5］。雖然目前已發(fā)現(xiàn)了上百種Bt基因，但是僅有很少部分被導(dǎo)入水稻中進行抗蟲性測定。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻最初常以CrylA類為主，如CrylAb、CrylAc、融合基因CrylAb/CrylAc等。目前，Bt抗蟲水稻的研究已取得了實質(zhì)性進展［4，6］。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的科學(xué)家們已將人工改造合成的Bt殺蟲蛋白融合基因CrylAb/CrylAc轉(zhuǎn)入雜交水稻恢復(fù)系‘明恢63’，培育出抗蟲水稻‘華恢1號’及其配組‘Bt汕優(yōu)63’。2009年，‘華恢1號’和‘Bt汕優(yōu)63’均獲得我國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，由此我國成為了世界上第三個批準(zhǔn)Bt轉(zhuǎn)基因水稻的國家。目前，這兩個水稻品種仍是我國唯一獲得轉(zhuǎn)基因應(yīng)用安全證書的水稻品種。能夠獲得安全證書標(biāo)志著含有Bt融合基因CrylAb/CrylAc的水稻品種‘華恢1號’已具備了進行商業(yè)化生產(chǎn)的前提條件之一［4，7］。

轉(zhuǎn)基因作物自1996年商業(yè)化以來，在世界范圍內(nèi)以每年10%的速度增加。在轉(zhuǎn)基因水稻方面，自2000年以來，美國先后批準(zhǔn)了6個抗除草劑和藥用轉(zhuǎn)基因水稻，伊朗批準(zhǔn)了1個轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻商品化種植［7］；加拿大、墨西哥、澳大利亞、哥倫比亞批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因水稻進口，允許食用［7］。獲得我國安全證書的‘華恢1號’和‘Bt汕優(yōu)63’均為秈稻，只能適應(yīng)我國南方雜交秈稻區(qū)種植，其食味品質(zhì)并不符合南方粳稻種植區(qū)人們的口感要求，因此將來也難以在包括上海市在內(nèi)的南方粳稻區(qū)大面積推廣。目前，尚未培育出適應(yīng)上海市及周邊地區(qū)種植的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗蟲粳型水稻的儲備品種。本研究選取已通過國家安全評估的轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因‘華恢1號’水稻和上海市主栽粳型水稻品種‘秀水134’為材料，采用傳統(tǒng)雜交和回交育種法以及分子標(biāo)記輔助篩選，將轉(zhuǎn)基因‘華恢1號’水稻中的Bt抗蟲基因?qū)氲缴虾Ｊ兄髟跃酒贩N‘秀水134’中，以期育成適合在上海等南方粳稻區(qū)種植的含有Bt抗蟲基因的粳稻新品種。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供體材料

供體為含Bt基因（CrylAb/CrylAc）的水稻材料‘華恢1號’（原名TT51），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)林擁軍教授提供。

1.1.2受體材料

受體親本為常規(guī)粳稻品種‘秀水134’（原名丙O6-134），是浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、余姚市種子管理站等合作選育的中熟常規(guī)晚粳稻品種。該品種于2010年2月通過浙江省農(nóng)作物品種審定委員會審定［8］，2011年3月通過上海市農(nóng)作物品種審定委員會審定，目前是上海市主要栽培水稻品種之一［9-10］。

1.2方法

1.2.1研究技術(shù)路線

以抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻材料‘華恢1號’為Bt基因供體材料，以‘秀水134’為受體輪回材料，進行雜交和連續(xù)回交，并通過自交來獲得純合Bt轉(zhuǎn)基因株系。本研究對每個世代水稻植株進行Bt基因分子標(biāo)記檢測，然后得到純合轉(zhuǎn)基因株系。試驗在上海師范大學(xué)植物園內(nèi)進行。

1.2.2Bt基因分子標(biāo)記檢測

采用由CTAB法［11］基礎(chǔ)上調(diào)整后的快速制備DNA方法［12］提取親本以及各世代的水稻植株基因組DNA。PCR擴增采用25 μL反應(yīng)體系：PCR緩沖液21.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、5 U/mL Taq酶0.2 μL和20 ng模板DNA 2.0 μL。在Eppendorf PCR儀上進行擴增，檢測Bt基因的分子標(biāo)記引物（Bt-F：5’-ATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTG-3’，Bt-L：5’-GGCGTTTCCCATAGTTCCATAG-3’）由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)溴化乙錠染色后在UVP凝膠成像儀上成像觀察。

1.2.3農(nóng)藝性狀和稻米品質(zhì)調(diào)查

2015年，對育成轉(zhuǎn)基因水稻‘Bt秀水134’的生育期、有效穗、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重、單株產(chǎn)量進行調(diào)查，重復(fù)3次，計算平均值，并根據(jù)國家農(nóng)業(yè)部測定標(biāo)準(zhǔn)測定稻米各項指標(biāo)。

2　結(jié)果與分析

2.1攜帶Bt抗蟲基因的‘Bt秀水134’的育成

2010年5月從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)林擁軍教授處引進‘華恢1號’種子，種植于上海師范大學(xué)植物園內(nèi)，與‘秀水134’雜交獲得21粒F1種子（圖1）。同年冬季將F1植株種植溫室內(nèi)，與‘秀水134’回交，獲得回交BC1F1種子57粒。2011年春，分別提取BC1F1植株幼苗DNA，檢測出24棵含有Bt基因植株（圖2），移栽于植物園內(nèi)，選擇與‘秀水134’抽穗接近的4棵植株與‘秀水134’繼續(xù)回交，獲得BC2F1種子37粒。同年冬季通過對幼苗的DNA檢測，鑒定出含有Bt基因的BC2F1植株9株，然后選擇性狀與‘秀水134’接近的BC2F1植株（3株）再與‘秀水134’回交，獲得BC3F1種子125粒。2012年春，對BC3F1水稻植株DNA檢測，鑒定出63株含有Bt基因的BC3F1植株，選出7棵綜合性狀與‘秀水134’相仿的BC3F1植株，獲得BC3F2代種子。同年冬季，通過對BC3F2幼苗DNA檢測，得到性狀與輪回親本‘秀水134’相仿的攜帶Bt基因的BC3F2代植株36棵，收獲BC3F3代種子；2013年春，在上海師范大學(xué)植物園內(nèi)進行隔離種植加代，成熟后，結(jié)合DNA檢測和稻米外觀品質(zhì)鑒定，選出綜合性狀與‘秀水134’相仿，含有純合Bt基因的BC3F4代13個株系，然后冬季在溫室內(nèi)加代種植，獲得BC3F5代種子；2014年春，將13個株系種植于上海師范大學(xué)植物園內(nèi)，進行綜合農(nóng)藝性狀與Bt基因鑒定，最終將編號BtR7的BC3F6株系命名為‘Bt秀水134’。

圖1　‘Bt秀水134’選育過程Fig.1 Breeding process of‘Bt Xiushui 134’

圖2　部分水稻植株Bt基因檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of Bt gene in some rice plants

2.2‘Bt秀水134’農(nóng)藝性狀

‘Bt秀水134’全生育期157 d左右，屬中熟晚粳品種，感光性強。株高93 cm左右，生長整齊，莖稈粗壯，株型緊湊，葉鞘包節(jié)，耐肥抗倒力強。葉片挺直，葉色較綠，成熟期轉(zhuǎn)色佳。穗直立，著粒較密，谷粒短圓，護穎、穎尖均為稈黃色，無芒，脫粒性中等。單株平均有效穗7.9個，每穗總粒數(shù)153粒左右，穗長14.6 cm左右，結(jié)實率高達(dá)94.8%左右，千粒重25.1 g，單株產(chǎn)量45.6 g。與輪回親本‘秀水134’相比，‘Bt秀水134’單株穗數(shù)、千粒重和結(jié)實率略少，每穗粒數(shù)明顯增多，其余農(nóng)藝性狀與其相仿（圖3，表1）。

圖3　‘Bt秀水134’和‘秀水134’的植株和米粒Fig.3 Plants and rice of‘Bt Xiushui 134’and‘Xiushui 134’

表1　‘Bt秀水134’農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic traits of‘Bt Xiushui 134’

2.3‘Bt秀水134’稻米品質(zhì)

對2015年種植收獲的‘Bt秀水134’稻谷檢測表明，其糙米率85.1%，整精米率72.3%，長寬比1.7，堊白粒率21.3%，堊白度4.3%，膠稠度68.6 mm，直鏈淀粉含量17.2%，蛋白質(zhì)含量9.2%。與輪回親本‘秀水134’相比，除營養(yǎng)指標(biāo)的蛋白質(zhì)含量略少之外，其余均好于或者與‘秀水134’相仿（表2）。

表2　‘Bt秀水134’和‘秀水134’稻米品質(zhì)比較Table 2 Comparison of rice quality of‘Bt Xiushui 134’and‘Xiushui 134’

3　結(jié)論與討論

本研究通過傳統(tǒng)輪回育種與現(xiàn)代分子育種手段相結(jié)合，將‘華恢1號’中Bt抗蟲基因轉(zhuǎn)育到上海市主栽水稻品種‘秀水134’中，育成了生育期、形態(tài)、產(chǎn)量及品質(zhì)與‘秀水134’相近的新型粳稻新品系‘Bt秀水134’?！瓸t秀水134’的成功培育為今后在上海推廣轉(zhuǎn)基因抗蟲粳稻提供了優(yōu)良的儲備品種。

Bt轉(zhuǎn)基因水稻除了具有明顯的抗蟲效果，還具有以下優(yōu)點：一是可節(jié)省成本投入，降低勞動強度，避免由此造成的農(nóng)藥中毒；二是可減少殺蟲劑的用量，降低農(nóng)藥對田間益蟲的負(fù)面影響，維持田間種群動態(tài)平衡；三是減少農(nóng)藥殘留對生態(tài)環(huán)境的污染，降低農(nóng)業(yè)污染的發(fā)生率［6-7］。目前，轉(zhuǎn)基因水稻安全性受到廣泛關(guān)注，外源基因在水稻中是否安全表達(dá)，除了外源基因本身是否表達(dá)有毒性蛋白外，其轉(zhuǎn)入基因組位置也有可能破壞水稻基因自身正常表達(dá)，也有可能影響轉(zhuǎn)基因水稻的安全性。也就是說，DNA序列相同的Bt抗蟲基因由于插入水稻基因組不同位置有可能造成轉(zhuǎn)基因水稻品種安全性不一致。

‘華恢1號’已通過國家嚴(yán)格安全評估試驗，充分證實‘華恢1號’中的Bt抗蟲基因在水稻中表達(dá)安全，不會對人體和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響，符合國家技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)分析。鑒于上述原因，本研究育成的適應(yīng)上海（南方粳稻區(qū)）種植的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗蟲轉(zhuǎn)基因粳稻品系‘Bt秀水134’更容易通過中間試驗、環(huán)境釋放以及生產(chǎn)性試驗，更易獲得農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因安全證書。

致謝：感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)林擁軍教授提供Bt抗蟲水稻‘華恢1號’材料以及在本實驗室攻讀學(xué)位的江泉、鞏孝帝、江少華、吳軍、梅杰、劉艷霞、朱環(huán)環(huán)、潘倩文、鄭凱倫、王文娟、雷曉慶、吳蘭蘭、王妍斌等同學(xué)對研究的支持。

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Study on transfer of Bt gene with pest-resistance into a leading japonica variety‘Xiushui 134’of Shanghai area

LIN Dong-zhi，DONG Yan-jun*
（Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University；Institute of Genetics，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Abstract：In order to breed trans-Bt japonica rice varieties suitable for planting in Shanghai area，Bt gene （CrylAb/CrylAc）of‘Huahui 1’which was the first rice variety passing safety assessment in China was transferred into japonica rice variety‘Xiushui 134’mainly cultivated in Shanghai by traditional recurrent breeding and modern molecular breeding，and the BC3F7line‘Bt Xiushui 134’was bred.The line was similar to or slightly better than‘Xiushui 134’in growth period，shape，yield and quality.It could be used as a breeding material for insect resistance，and also could be used as a reserve variety of transgenic insect resistant japonica rice in Shanghai area.

Key words：Rice；Bt gene；Character；Molecular breeding

中圖分類號：S511.035

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-001-04 D

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.01

收稿日期：2016-02-17

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（30971552）；上海市自然科學(xué)基金項目（16ZR1425300）；上海師范大學(xué)項目（SK20159）

作者簡介：林冬枝（1971—），女，博士，副教授，研究方向為水稻分子生物學(xué)

*通信作者，E-mail：dong@shnu.edu.cn