何永梅，王 波，李大偉，田永生，彭日荷*，姚泉洪*

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106）

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米曲霉葡聚糖酶基因（AoEGLAI）在畢赤酵母中的表達(dá)研究及其酶學(xué)特性分析

何永梅1，王 波2*，李大偉1，田永生2，彭日荷2**，姚泉洪2**

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，上海201106）

摘 要：采用PTDS方法人工合成米曲霉葡聚糖酶基因（AoEGLAI），通過電擊將其轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中表達(dá)，并采用DNS法對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明：該酶耐酸但不耐熱，最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH 為3.0，在30—45℃和pH 4—8時內(nèi)切葡聚糖酶可保持90%以上酶活力，在底物CMC存在時其熱穩(wěn)定性有一定的提高。10 mmol/L的金屬離子Cu2+、Ca2+、Zn+、Gr3+、Fe2+和Fe3+對酶有激活作用，Mn2+對酶則起抑制作用。該酶對胰蛋白酶有一定的抗性，對胃蛋白酶抗性相對較差。

關(guān)鍵詞：米曲霉；內(nèi)切葡聚糖酶；畢赤酵母；酶學(xué)性質(zhì)

*共同第一作者

**通信作者，Tel：021-62203180，E-mail：pengrihe69@yahoo.com；E-mail：yao.quanhong65@yahoo.com

隨著微生物食品生物工程技術(shù)的蓬勃發(fā)展，米曲霉（Aspergillus oryzae）作為發(fā)酵工業(yè)和食品加工業(yè)的重要菌種，日益受到廣泛關(guān)注。米曲霉是一種好氣性真菌，常見于糧食、發(fā)酵食品、腐敗有機(jī)物、土壤等處［1］。米曲霉在調(diào)味品行業(yè)主要用于釀造醬油、豆豉、米酒等發(fā)酵食品，在酶制劑行業(yè)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，部分用作食品添加劑；也用于生產(chǎn)天冬氨酸蛋白酶、嗜熱堿性脂肪酶等異源蛋白及人溶菌酶和乳鐵蛋白等醫(yī)藥蛋白［2］。此外，米曲霉及其提取物（如艾美福Amaferm）對牲畜、家禽的消化功能、生產(chǎn)性能有很大影響［3］。

2005年，米曲霉RIB40（ATCC42149）基因組測序工作由日本幾家科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)聯(lián)合完成，該菌株是研究米曲霉生理調(diào)控的模式菌株，測序結(jié)果表明米曲霉基因組有8條染色體［2］。常淑君等［4］于2014年成功構(gòu)建了米曲霉RIB40的全長cDNA表達(dá)文庫，為米曲霉功能基因的開發(fā)以及次生代謝產(chǎn)物合成途徑相關(guān)基因的篩選與克隆奠定了基礎(chǔ)。

米曲霉是一類產(chǎn)生復(fù)合酶的菌株，能分泌纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、植酸酶等多種酶類［5］。纖維素酶是一個多組分酶系，包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶［6-7］。其中，內(nèi)切β-葡聚糖酶能特異作用于β-1，4-糖苷鍵，水解纖維素分子內(nèi)部的非晶體區(qū)或羧甲基纖維素中的長鏈纖維分子，進(jìn)而產(chǎn)生大量小分子纖維素，所以內(nèi)切葡聚糖酶是重要的工業(yè)用酶，不僅是提高醬油膳食纖維含量的一個關(guān)鍵酶［8］，也可以作為飼料添加劑，除去飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子葡聚糖，提高飼料的轉(zhuǎn)化率和動物的生長性能［9-10］。

常見的產(chǎn)β-葡聚糖酶的霉菌有康氏木霉、里氏木霉、瑞氏木霉和黑曲霉等［11］。β-葡聚糖酶在食品和飼料工業(yè)等方面有著廣闊的應(yīng)用前景，正逐漸成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近年來，國內(nèi)有許多關(guān)于纖維素酶基因克隆與表達(dá)的報道，但對米曲霉產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶的研究較少。為此，本試驗(yàn)對來源于米曲霉的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步探索酸性纖維素在食品工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；畢赤酵母Pichia Pastoris GS115和pPIC9K分泌型表達(dá)載體購自Invitrogen公司。

1.1.2酶和試劑

TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等工具酶購自上海生工；限制性內(nèi)切酶、蛋白Marker購自TaKaRa公司；CMC-Na購自Sigma公司。

1.1.3培養(yǎng)基

LB、YPD、BMGY和BMMY培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1AoEGLAI基因的合成和載體構(gòu)建

按照畢赤酵母密碼子偏愛，采用PTDS（PCR-based two-step DNA synthesis）方法進(jìn)行米曲霉葡聚糖酶基因AoEGLAI的化學(xué)合成及優(yōu)化［12］，其信號肽及引物位置如圖1所示。PCR擴(kuò)增結(jié)束后將PCR產(chǎn)物凝膠回收并連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行序列測定。測序正確的AoEGLAI經(jīng)Bam HI和Sac I酶切后，連接到含有AOX啟動子的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K，得到重組質(zhì)粒pYR1721進(jìn)行畢氏酵母轉(zhuǎn)化。

圖1　AoEGLAI序列中信號肽及引物Fig.1 Signal peptide and primers in sequence of AoEGLAI

1.2.2畢赤酵母重組表達(dá)載體的電擊轉(zhuǎn)化

畢赤酵母菌株GS115于50 mL YPD培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)至OD600為1.1—1.3，離心收集菌體。用預(yù)冷的無菌水洗菌體，4℃、8 000 r/min離心去上清液，用20 mL預(yù)冷的山梨醇懸浮菌體，再離心收集菌體并用0.5 mL預(yù)冷的山梨醇懸浮。取80 μL菌液，加入2 μL經(jīng)Sal I線性化的重組質(zhì)粒pYR1721，冰浴5 min后電擊，結(jié)束后立即加入0.8 mL預(yù)冷的0.6 mol/L山梨醇，混合后取200 μL菌液涂布于山梨醇平板上，30℃培養(yǎng)2—4 d直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.2.3重組畢赤酵母工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含25 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)48 h。離心收集菌體，用無菌水洗3次，將菌體轉(zhuǎn)移至25 mL BMMY誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加250 μL 100%甲醇至終濃度為1%。將培養(yǎng)基于4℃、8 000 r/min離心5 min，收集上清，即為粗酶液。

1.2.4重組AoEGLAI的純化及分析

取2 mL誘導(dǎo)后的粗酶液，首先通過由緩沖液A（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑）平衡好的Ni柱，再經(jīng)洗滌液B（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）洗滌，及洗脫液C（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，300 mmol/L NaCl，250 mmol/L咪唑）洗脫，最后由緩沖液D（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，0.1 mmol/L EDTA，10%甘油）進(jìn)行透析。純化后的重組AoEGLAI采用12%的SDS-PAGE進(jìn)行分析，并通過考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。

1.3酶活力測定

采用DNS定糖法測定內(nèi)切葡聚糖酶的活性［13］。具體操作如下：取0.07 mL粗酶液，加入0.07 mL 0.1 mol/L檸檬酸-0.2 mol/L磷酸氫二鈉緩沖液（pH 5.0）及0.14 mL 1%溶于此緩沖液的CMC-Na，37℃反應(yīng)1 h后，加入0.28 mL DNS試劑，煮沸10 min，在540 nm波長下測定光吸收值。每分鐘產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需要的酶量為1個酶活單位。

1.3.1重組AoEGLAI最適pH、pH穩(wěn)定性、最適溫度及溫度穩(wěn)定性測定

測定方法參考包文華等［14］。在pH 2、3、4、5、6、7、8及20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的條件下測定重組葡聚糖酶AoEGLAI的活力，得到最適pH及最適溫度。在此pH及溫度條件下處理后測定剩余酶活力，得到重組酶的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性。

1.3.2重組AoEGLAI在有底物保護(hù)條件下的熱穩(wěn)定性

酶與水溶的CMC-Na溶液混合后，以酶與同體積的水混合液為對照，于70℃處理10—60 min，間隔10 min取樣，置于4℃，待所有樣品處理完并降于相同溫度后，對照加入1.5%的CMC-Na溶液，其余加入1%的CMC-Na溶液。37℃反應(yīng)1 h后測活的樣品與70℃處理后直接顯色的樣品對比。

1.3.3不同金屬離子對AoEGLAI活性的影響

酶分別與終濃度為1mmol/L、10mmol/L的金屬離子溶液CuSO4、CaCl2、Ca（NO3）2、Fe（NO3）2、MnSO4、ZnSO4、MnCl2、K2SO4、MgSO4、FeCl3、LiCl、CrCl3，及溶于pH 5.0緩沖液中的底物CMC-Na溶液混合后，37℃反應(yīng)1 h，測定酶在上述反應(yīng)體系中的活力。對照組為水，以其活力值為100%。

1.3.4蛋白酶對AoEGLAI活性的影響

酶分別與含量為5×10-4g的胃蛋白酶、胰蛋白酶及溶于pH 5.0緩沖液中的底物CMC-Na溶液混合后，37℃反應(yīng)1 h，測定其活力。

圖2　AoEGLAI蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE detection result of AoEGLAI

2　結(jié)果與分析

2.1SDS-PAGE分析

粗酶液濃縮純化后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示。純化后的蛋白條帶單一，蛋白大小約為27 kD，與生物信息學(xué)預(yù)測一致，表明米曲霉內(nèi)切葡聚糖酶在畢赤酵母中成功表達(dá)。

2.2最適pH和pH穩(wěn)定性

如圖3所示：重組AoEGLAI最適pH為3，在pH 2—4有80%的活力，pH 8時其活力剩余20%。如圖4所示：處理1 h及4 h時，重組AoEGLAI分別在pH 3—8及pH 4—8仍有很高的活性（90%）。

圖3　AoEGLAI的最適pHFig.3 The optimal pH of AoEGLAI

圖4　AoEGLAI的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of AoEGLAI

2.3最適溫度和溫度穩(wěn)定性

如圖5所示：重組AoEGLAI最適溫度為50℃，在30—70℃有60%以上的活力。如圖6所示：重組AoEGLAI在40℃處理10 min后其活性為80%，50℃處理10 min后其活性為40%，1 h后僅剩7%，活性下降較快，而70℃處理10 min后其活性基本喪失。

圖5　AoEGLAI的最適溫度Fig.5 The optimal temperature of AoEGLAI

圖6　AoEGLAI的溫度穩(wěn)定性Fig.6 The temperature stability of AoEGLAI

2.4酶在有底物保護(hù)條件下的熱穩(wěn)定性

70℃處理后，經(jīng)37℃反應(yīng)1h并測活的樣品與處理后直接顯色的樣品相比，熱穩(wěn)定性明顯提高。如圖7所示：重組AoEGLAI在70℃處理10 min后幾乎無活性，而與底物CMC-Na混合后在相同的溫度條件下處理，10 min后仍有30%以上的酶活力。

2.5不同金屬離子對AoEGLAI活性的影響

如圖8所示：用1 mmol/L的金屬離子處理，除Mn2+對酶起抑制作用外，其他離子無明顯作用；而在10 mmol/L下，金屬離子Cu2+、Ca2+、Zn+、K+、Gr3+、Fe2+和Fe3+對酶有激活作用，Mn2+的抑制作用不如1 mmol/L時明顯；Mg2+及Li+在兩個濃度下對重組AoEGLAI均無明顯影響。

2.6蛋白酶對AoEGLAI活性的影響

如圖9所示：重組AoEGLAI在胃蛋白酶和胰蛋白酶作用下有一定程度的水解，其活性隨著處理時間的延長逐漸下降。其中胃蛋白酶的水解作用較明顯，酶活下降較快，而重組AoEGLAI對胰蛋白酶則有一定的抗性，作用6 h仍有70%的活性，處理24 h后仍有酶活。

2.7酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)

利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）對底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)（1/S）作圖，得到一條直線，如圖10所示：該重組酶AoEGLAI的米氏常數(shù)Km =22.47 g/L，最大反應(yīng)速度Vmax =1.22 g/（min·L），純化后重組AoEGLAI的比酶活為2.7×105IU/mg。

圖7　AoEGLAI在底物保護(hù)條件下的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of AoEGLAI under substrate protection

圖8　 不同金屬離子對AoEGLAI的影響Fig.8 Effect of different metal ions on AoEGLAI

圖9　胰蛋白酶和胃蛋白酶對AoEGLAI的影響Fig.9 Effect of trypsin and pepsin on AoEGLAI

圖10　酶的反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Fig.10 Kinetic parameters of AoEGLAI

3　結(jié)論與討論

自然界中存在眾多能產(chǎn)生纖維素酶的生物，包括某些低等動植物、真菌、細(xì)菌和放線菌。纖維素酶的常見表達(dá)宿主菌包括大腸桿菌、畢赤酵母、真菌（如米曲霉）等，其中，甲基營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)中的巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中一種重要的工具模型，以其自身分泌的背景蛋白少，糖基化程度低，對營養(yǎng)要求低，可采用廉價的培養(yǎng)基，以及易于高密度發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)［15］，已成為異源表達(dá)最常用的一種表達(dá)系統(tǒng)。來源于芽胞桿菌、苜蓿根瘤菌、里氏木霉、草莓等的β-1，4-外切葡聚糖酶在畢赤酵母中的表達(dá)已有報道［9］，本試驗(yàn)則對來源于米曲霉的內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)進(jìn)行了研究。

不同來源的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶其性質(zhì)相差甚遠(yuǎn)，真菌一般產(chǎn)酸性纖維素酶，本試驗(yàn)中所表達(dá)的來自于米曲霉RIB40的重組AoEGLAI最適pH為3.0，與大多數(shù)真菌所產(chǎn)纖維素酶為酸性的特征相符，且霉菌來源的AoEGLAI其pH穩(wěn)定性范圍較寬，與鄒東恢等［11］報道一致。大多數(shù)內(nèi)切葡聚糖酶最適溫度為50—55℃，重組AoEGLAI最適溫度為50℃，與Viikari等［16］報道的Trichoderma reesei類似，該酶的最適作用溫度是50℃，在40℃條件下保存60%的剩余活力，且在有底物保護(hù)條件下穩(wěn)定性還會有一定程度的提高。動物的體溫在40℃左右，重組AoEGLAI若作為飼料添加劑，在通過動物的胃腸道時可在接近最適催化溫度下發(fā)揮作用，對其酶活影響不大［17］。

韓學(xué)易等［18］對來源于米曲霉的giF-10重組內(nèi)切葡聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，與本試驗(yàn)重組AoEGLAI相比，其最適pH為4.0，雖同為酸性纖維素酶，但重組AoEGLAI對酸性環(huán)境的耐受力更強(qiáng)。重組giF-10的最適反應(yīng)溫度是45℃，略低于重組AoEGLAI的最適溫度，且重組AoEGLAI的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性均優(yōu)于重組giF-10。黃君等［9］將黑曲霉L3內(nèi)切葡聚糖酶在畢赤酵母中高效表達(dá)后獲得重組酶EGI，其最適pH為5.0，不及重組AoEGLAI耐酸，但其最適反應(yīng)溫度為70℃，對高溫的耐受能力明顯強(qiáng)于重組AoEGLAI，故更適合作為啤酒工業(yè)的復(fù)合酶。喬宇等［19］研究了里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶II在畢赤酵母中的表達(dá)，其最適反應(yīng)溫度與重組AoEGLAI較為接近，最適pH則與黑曲霉L3重組EGI相同，均高于重組AoEGLAI。

金屬離子對內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶具有不同程度的影響，Mn2+對該酶起抑制作用，而10 mmol/L的金屬離子Cu2+、Ca2+、Zn+、Gr3+、Fe2+和Fe3+則對酶有激活作用，這與彭維等［20］的研究結(jié)果不同，其報道中指出Mn2+激活效果顯著而Cu2+起抑制作用，導(dǎo)致這種差異的原因可能是由于底物不同或者酶來源不同而產(chǎn)生的。

胃蛋白酶和胰蛋白酶均能降低重組AoEGLAI的活性，但重組AoEGLAI對兩種蛋白酶有一定的耐受力，特別是胰蛋白酶，處理24 h后仍有活力。李衛(wèi)芬等［21］在里氏木霉β-葡聚糖酶穩(wěn)定性研究中提到，胃蛋白酶和胰蛋白酶對β-葡聚糖葡聚糖酶活幾乎無影響；而孫建義等［22］在體外模擬動物胃腸條件下研究結(jié)果表明，胃蛋白酶對β-葡聚糖酶活無明顯影響，而胰蛋白酶卻有一定的促進(jìn)作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Expression and characterization of recombinant endo-β-1，4-glucanase from Aspergillus oryzae in Pichia pastoris

HE Yong-mei1，WANG Bo2*，LI Da-wei1，TIAN Yong-sheng2，PENG Ri-he2**，YAO Quan-hong2*
（1College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2Biotechnology Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China）

Abstract：The AoEGLAI gene was chemically synthesized by PTDS（PCR-based-two-steps DNA synthesis）strategy in this study.Then，the AoEGLAI gene was transformed into Pichia pastoris by electroporation and the enzymatic properties of recombinase were analyzed by DNS method.The results showed that the enzyme is acid proof but not heat resistant，the optimum temperature is 50℃，and the optimum pH is 3.The enzyme activity could be maintained 90%at 30—45℃and pH 4—8.In the presence of substrate CMC，the enzyme’s thermal stability improved.In addition，Cu2+，Ca2+，Zn2+，Gr3+，F(xiàn)e2+and Fe3+of 10 mmol/L had active effects on the enzyme whereas Mn2+had inhibitory effect on it.This enzyme had certain resistance to trypsin，and relatively poor resistance to pepsin.

Key words：Aspergillus oryzae；Endo-β-1，4-glucanase；Pichia pastoris；Enzymatic property

中圖分類號：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3924（2016）03-018-06

DOI：10.15955/j.issn1000-3924.2016.03.04

收稿日期：2015-02-02

基金項(xiàng)目：上海市農(nóng)業(yè)委員會重點(diǎn)項(xiàng)目（No.2011-1-8，2013D-8）

作者簡介：何永梅（1988—），女，碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。Tel：18935251120，E-mail：heyongmeiyaner@163.com