孫云霞　張先正

(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)用高分子材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430072)

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陽(yáng)離子寡肽序列的合成及生物學(xué)研究
——推薦一個(gè)針對(duì)化學(xué)生物學(xué)專業(yè)學(xué)生的研究型實(shí)驗(yàn)

孫云霞*張先正

(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)用高分子材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430072)

摘要：采用多肽固相合成技術(shù)制備了寡肽序列RRRRRRRR(R8)。通過(guò)電噴霧電離質(zhì)譜儀對(duì)序列的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行了表征。進(jìn)一步通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)考察寡肽序列在生物學(xué)研究方面的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)可以加深學(xué)生對(duì)有機(jī)化學(xué)、高分子化學(xué)及生物化學(xué)的理解與運(yùn)用，培養(yǎng)學(xué)生分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的綜合能力。

關(guān)鍵詞：氨基酸；寡肽；多肽；凝膠電泳

www.dxhx.pku.edu.cn

寡肽是由十種以下具有不同物理和化學(xué)性質(zhì)的天然氨基酸通過(guò)肽鍵組成，由十種以上一百種以下氨基酸組成的稱為多肽[1]。寡(多)肽由于其特有的生物活性、生物可降解性和良好的生物相容性而引起生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究的廣泛關(guān)注，尤其在基因傳遞、組織工程及細(xì)胞培養(yǎng)等方面。由于天然氨基酸分別具有不同的理化性質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)寡(多)肽的序列，可制備出具有不同生理活性和生物功能的寡(多) 肽[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多肽固相合成技術(shù)合成了陽(yáng)離子寡肽序列，并初步研究了其作為基因傳遞系統(tǒng)的基本條件。

基因傳遞系統(tǒng)又稱為基因載體，是可以攜帶DNA進(jìn)入細(xì)胞的材料。傳統(tǒng)的基因載體主要是病毒載體。由于病毒載體攜帶的DNA大小有限，而且病毒載體能引起免疫原性反應(yīng)、致癌性以及能任意地整合到主體的基因組當(dāng)中，存在著很大的安全隱患[3,4]。與病毒載體相對(duì)應(yīng)的非病毒基因載體無(wú)傳染性，安全隱患較小，而且成本較低，可以大量制備，重現(xiàn)性也較好。非病毒載體一般包括裸DNA、脂質(zhì)體、陽(yáng)離子高分子聚合物，其中脂質(zhì)體又分為陽(yáng)離子、陰離子及中性脂質(zhì)體。陽(yáng)離子脂類通過(guò)靜電作用與DNA形成脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物(lipoplex)。常用的陽(yáng)離子高分子聚合物包括天然高分子聚合物和合成高分子聚合物，天然高分子聚合物主要有殼聚糖及其衍生物[5,6]，合成聚合物主要有聚賴氨酸[7,8]、聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)[9,10]、樹(shù)形高分子(dendrimer)等[11]。脂質(zhì)體和陽(yáng)離子高分子非病毒載體也存在著一些缺點(diǎn)，例如，缺乏靶向特異性、轉(zhuǎn)染效率低、毒性較高、血清存在時(shí)不穩(wěn)定等[12]，直接限制了它們?cè)谂R床的應(yīng)用。為了克服傳統(tǒng)非病毒基因載體的缺點(diǎn)，本文利用天然氨基酸的優(yōu)點(diǎn)制備了具有細(xì)胞穿膜功能的寡肽序列R8。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)化學(xué)系大學(xué)四年級(jí)化學(xué)生物學(xué)專業(yè)的學(xué)生開(kāi)設(shè)，化學(xué)生物學(xué)專業(yè)共有學(xué)生約18人，以每三個(gè)學(xué)生為一組協(xié)作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)融合了基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)、儀器分析化學(xué)以及生物學(xué)等知識(shí)，作為本科生綜合實(shí)驗(yàn)，可以使學(xué)生較早地接觸前沿科學(xué)，了解化學(xué)專業(yè)不再是一個(gè)單調(diào)、乏味的學(xué)科，而是一個(gè)與生物、物理、材料等學(xué)科交叉的前沿性學(xué)科，是一個(gè)很有發(fā)展前景的學(xué)科。

1　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

(1)掌握多肽固相合成技術(shù)的原理和操作方法。

(2)熟悉電噴霧電離質(zhì)譜儀(ESI-MS)的操作方法。

(3)了解凝膠電泳的一般原理并掌握凝膠電泳等基本生物實(shí)驗(yàn)操作。

2　實(shí)驗(yàn)原理

寡(多)肽是不同氨基酸從C端(羧基端)向N端(氨基端)直接通過(guò)肽鍵連接而成。過(guò)去的寡(多)肽合成一般是在溶液中進(jìn)行的，稱為液相合成法。為了提高產(chǎn)品的純度和降低合成難度，發(fā)展了固相合成技術(shù)。固相合成是在密閉的防爆玻璃反應(yīng)器中使氨基酸按照已知順序(序列，一般從C端-羧基端向N 端-氨基端)不斷添加、反應(yīng)、合成，最終得到寡(多)肽[13]，多肽合成的流程圖如圖1所示。本實(shí)驗(yàn)采用固相合成技術(shù)合成了細(xì)胞穿膜肽R8，利用電噴霧電離質(zhì)譜儀對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，并通過(guò)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)考察了R8作為基因載體的基本條件。

在陽(yáng)離子寡(多)肽中，氨基基團(tuán)的正電荷與DNA的磷酸根基團(tuán)的負(fù)電荷通過(guò)靜電吸附作用而發(fā)生電性中和，與DNA自組裝成穩(wěn)定的復(fù)合物(complexes)，使DNA不易被核酸酶降解。R8與DNA形成的復(fù)合物主要通過(guò)非特異性的細(xì)胞內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，包括網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)性內(nèi)吞(clathrin-mediated endocytosis)、細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷(caveolae-mediated endocytosis)、大分子胞飲內(nèi)吞(macropinocytosis) 等[14,15]。R8與DNA復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后形成內(nèi)涵體，復(fù)合物從內(nèi)涵體中快速逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行基因表達(dá)。

3　實(shí)驗(yàn)儀器及藥品

3.1藥品

氨基以及側(cè)基的胍基分別被9-芴甲氧羰基和2,2,4,6,7-五甲基-2H-苯并呋喃-5-磺?；Ｗo(hù)的精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)、苯并三氮唑-N,N,N′N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)以及2-氯-三苯甲基氯樹(shù)脂(2-chlorotrityl chloride resin，100－200目，負(fù)載量：1.2 mmol?g－1)、哌啶(piperidine)、三氟乙酸(TFA)、1,2-乙二硫醇(EDT)、嗎啡啉、茚三酮，分析純。二異丙基乙胺(DIEA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷，化學(xué)純。熒光素酶質(zhì)粒pGL-3 DNA在E.Coli JM109大腸桿菌中擴(kuò)增，質(zhì)粒的提取和純化使用Qiagen endotoxin-free plasmid Gigaprep試劑盒，通過(guò)去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化過(guò)程完成。人源宮頸癌細(xì)胞(HeLa)購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基干粉、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)于Gibco。

圖1　多肽固相合成流程圖

3.2儀器

多肽合成玻璃柱，電噴霧電離質(zhì)譜儀(ESI-MS)，瓊脂糖凝膠電泳儀，電泳成像儀，細(xì)胞培養(yǎng)箱，生物安全柜，激光共聚焦顯微鏡。

4　實(shí)驗(yàn)過(guò)程

4.1多肽序列的合成及表征

(1)參考文獻(xiàn)方法[16,17]，稱取1.5 g 2-氯-三苯甲基氯樹(shù)脂(負(fù)載量：1.2 mmol?g－1)至多肽合成裝置，加入10 mL干燥的DMF浸泡樹(shù)脂數(shù)小時(shí)，使之充分溶脹，最后排出溶劑DMF。

(2)稱取2.34 g(3.6 mmol) Fmoc-Arg(Pbf)-OH于稱量瓶中，用10 mL DMF將其溶解，然后將該溶液轉(zhuǎn)入到上步含有處理過(guò)的樹(shù)脂的多肽合成裝置中，再加入3.3 mL催化劑二異丙基乙胺(DIEA)，室溫下讓Fmoc-Arg(Pbf)-OH與樹(shù)脂相互作用約1.5 h，使其充分固定在樹(shù)脂上。

(3)用4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂。

(4)加入13 mL 50%嗎啡啉/DMF(體積比)溶液到上一步的樹(shù)脂中，反應(yīng)2 h，脫去Arg上的Fmoc保護(hù)基。

(5)用4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂，用茚三酮檢驗(yàn)脫保護(hù)是否完全。

(6)稱取2.34 g(3.6 mmol) Fmoc-Arg(Pbf)-OH，1.8 g(4.752 mmol) HBTU，0.64 g(4.752 mmol) HOBt于稱量瓶中，用10 mL DMF溶解，將該溶液轉(zhuǎn)入到上步處理后的多肽合成裝置中，再加入2 mL DIEA，縮合反應(yīng)1.5 h。

(7)用4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂。

(8)加入13 mL 50%嗎啡啉/DMF(體積比)溶液到樹(shù)脂中，反應(yīng)2 h，脫去Asp上的Fmoc保護(hù)基。

(9)用4×10 mL DMF洗滌樹(shù)脂，用茚三酮檢驗(yàn)脫保護(hù)是否完全。

(10)依次分別稱取6次等量Fmoc-Arg(Pbf)-OH 2.34 g(3.6 mmol)，分別重復(fù)步驟6－9。

(11)用4×10 mL CH2Cl2洗滌樹(shù)脂，充分洗干，于真空干燥箱中干燥24 h。

(12)脫側(cè)基保護(hù)基(Pbf)，切落多肽：將25 mL TFA，0.6 mL乙二硫醇，2 mL苯酚，1.3 mL H2O，1.3 mLTIS，1.3 mL苯甲硫醚的混合液加到干燥后的樹(shù)脂中，反應(yīng)2 h。

(13)收集濾液TFA，用少量TFA洗樹(shù)脂，收集洗液，合并濾液和洗液，用適量的無(wú)水乙醚進(jìn)行沉淀，靜置。沉淀充分后，抽濾，洗滌，干燥，得產(chǎn)品R8，用電噴霧電離質(zhì)譜儀(ESI-MS)檢測(cè)多肽的相對(duì)分子質(zhì)量。ESI-MS檢測(cè)的單電荷分子離子峰[M+H]+= 1268.5，計(jì)算得到的相對(duì)分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量(M = 1267.5)相吻合。寡肽序列的ESI-MS圖譜如圖2所示。

圖2　R8寡肽序列ESI-MS圖譜

4.2生物學(xué)研究

4.2.1瓊脂糖凝膠的制備

(1)分別稱取140 mg瓊脂糖干粉、量取400 μL的TAE(Tris-醋酸)緩沖溶液和2 μL的GelRedTM染料，置入50 mL的錐形瓶中，加入20 mL的去離子水。然后將錐形瓶放入微波爐加熱至瓊脂糖完全溶解。

(2)待溶液冷卻至65°C后，倒入制膠板中冷卻靜置30分鐘。

(3)待膠完全凝固好后加入電泳槽中備用。

4.2.2R8/DNA復(fù)合物的制備

稱一定量的R8粉末溶在150 mmol?L－1的NaCl溶液中配成0.4 mg?mL－1的溶液，用220 nm的濾膜過(guò)濾滅菌。量取1.0μL DNA的TE溶液(100 ng?μL－1)加入0.5 mL的無(wú)菌離心管中，按照不同的N/P比(R8上胺基的物質(zhì)的量與DNA上磷酸根的物質(zhì)的量之比)加入不同體積的R8溶液與DNA混合，最后補(bǔ)加一定體積的150 mmol?L－1的NaCl溶液使總體積達(dá)到10.0μL。將10.0μL的混合液震蕩5 s后在37°C下靜置30 min后備用。

4.2.3凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

在37°C下靜置30 min后，在復(fù)合物中加入1.0μL溴酚藍(lán)溶液。隨后將N/P比分別為0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12的R8/DNA復(fù)合物加入含2.0μL GelRedTM染料的0.7% (g?mL－1)的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。電泳在80 V電壓下的Tris的醋酸溶液中進(jìn)行80 min，然后在凝膠成像儀(vilber lourmat)下通過(guò)紫外照射成像觀察。

陽(yáng)離子對(duì)DNA的絡(luò)合能力是考察其作為載體的一個(gè)首要條件。陽(yáng)離子載體與DNA通過(guò)靜電作用形成緊密絡(luò)合體，絡(luò)合體在進(jìn)入細(xì)胞后可避免被細(xì)胞內(nèi)的酶降解，從而可以順利地由內(nèi)涵體逃逸到細(xì)胞質(zhì)再進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行表達(dá)[18]。由圖3可看出，R8/DNA復(fù)合物在N/P比為6時(shí)，DNA被完全絡(luò)合。

圖3　R8與DNA形成復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

4.2.4復(fù)合物跨細(xì)胞膜實(shí)驗(yàn)

在復(fù)合物跨膜實(shí)驗(yàn)中，用綠色熒光探針YoYo-1標(biāo)記DNA，用藍(lán)色熒光探針Hoechst 33258標(biāo)記細(xì)胞核。HeLa細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度種到25 mm直徑的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后，吸棄舊培養(yǎng)基，加入R8/DNA復(fù)合物(N/P比為10)，在培養(yǎng)箱內(nèi)共同培養(yǎng)4 h。然后吸棄含復(fù)合物的舊培養(yǎng)基，用1 mL PBS淋洗細(xì)胞三次。將20μL Hoechst 33258(10 μg?μL－1)加入200μL DMEM，混勻后加入培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。20 min后棄去皿內(nèi)液體，用1 mL PBS淋洗細(xì)胞三次，加入1 mL新鮮的DMEM(含10% FBS)。將培養(yǎng)皿放在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照(波長(zhǎng)為488 nm 和405 nm，放大倍數(shù)為40×)。復(fù)合物4 h后部分跨過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，部分分布在細(xì)胞核周圍。共聚焦顯微鏡拍攝的復(fù)合物跨膜結(jié)果如圖4所示。

5　實(shí)驗(yàn)安排及建議

(1)本實(shí)驗(yàn)需要的時(shí)間為24課時(shí)，分3天完成，其中R8序列的合成需要16課時(shí)連續(xù)兩天完成，R8序列的結(jié)構(gòu)、相對(duì)分子質(zhì)量表征以及凝膠電泳實(shí)驗(yàn)需要8課時(shí)一天內(nèi)完成，建議將本實(shí)驗(yàn)作為學(xué)生的綜合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

圖4　R8/DNA復(fù)合物跨膜過(guò)程

(2)考慮到細(xì)胞培養(yǎng)及操作實(shí)驗(yàn)需要無(wú)菌條件，建議將R8/DNA復(fù)合物跨膜的細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)作為學(xué)生的業(yè)余科研內(nèi)容，對(duì)復(fù)合物跨膜過(guò)程感興趣的學(xué)生可以到教師的研究課題組中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

(3)實(shí)驗(yàn)前需要學(xué)生查閱多肽合成及細(xì)胞生物學(xué)等相關(guān)知識(shí)。要求學(xué)生學(xué)習(xí)鞏固大學(xué)三年級(jí)學(xué)習(xí)的電噴霧電離質(zhì)譜、凝膠電泳成像儀的操作。

(4)實(shí)驗(yàn)針對(duì)大學(xué)四年級(jí)化學(xué)生物學(xué)專業(yè)學(xué)生開(kāi)設(shè)，實(shí)驗(yàn)人數(shù)共18人，每3個(gè)人一組，分6組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。要求組內(nèi)成員合理分工，協(xié)作完成實(shí)驗(yàn)。

(5)實(shí)驗(yàn)完成后，實(shí)驗(yàn)報(bào)告以研究性論文格式提交，要求對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行討論和總結(jié)。

6　思考題

(1)多肽固相合成的基本原理是什么？

(2)氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)的區(qū)別？

(3)多肽固相合成過(guò)程中茚三銅的作用是什么？

7　實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1)寡肽合成所用的DMF要先加無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾后減壓蒸餾，收集備用。

(2)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中使用GelRedTM染料時(shí)注意不能接觸到口、鼻和皮膚，做好的凝膠不能直接用手接觸，要帶醫(yī)用手套操作。

(3)實(shí)驗(yàn)完畢后清洗寡肽合成的玻璃柱。

(4)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)要在生物安全柜中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前要帶醫(yī)用手套，穿干凈實(shí)驗(yàn)服。所有從外面放入生物安全柜的用品要噴醫(yī)用酒精消毒。應(yīng)避免YoYo-1和Hoechst 33258熒光染料接觸皮膚。

8　實(shí)驗(yàn)特色和效果

本實(shí)驗(yàn)綜合基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)、高分子化學(xué)、材料化學(xué)、生物化學(xué)及儀器分析等實(shí)驗(yàn)的原理和操作方法，是集合成與表征為一體的綜合性較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)綜合考慮了實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科學(xué)研究的特點(diǎn)，將兩者緊密結(jié)合起來(lái)，可以增進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)與科學(xué)研究的聯(lián)系。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，不僅可以使學(xué)生掌握多肽序列的合成方法，加深對(duì)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)操作的理解，還可以培養(yǎng)學(xué)生在較高層次上了解多肽序列的特殊應(yīng)用，有利于擴(kuò)寬學(xué)生的知識(shí)面，培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)踐能力和創(chuàng)新能力。

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?化學(xué)實(shí)驗(yàn)?

Synthesis and Biological Research of Polycationic Oligopeptide: A Research-Based Experiment Recommended for Chemical Biology Majoring Students

SUN Yun-Xia*ZHANG Xian-Zheng
(Key Laboratory of Biomedical Polymers of Ministry of Education & Department of Chemistry, Wuhan University, Wuhan 430072, P. R. China)

Abstract:The oligopeptide R8was synthesized through the solid phase peptide synthesis (SPPS) protocols, and the molecular weight was measured by MS-ESI. The biological application of R8was investigated by agarose gel electrophoresis assay and endocytosis. Through this experiment, students can study and apply organic chemistry, polymer chemistry, and chemical biology, as well as develop their capability for analyzing and resolving problems.

Key Words:Amino acid; Oligopeptide; Peptide; Gel electrophoresis

中圖分類號(hào)：O6-33；G64

doi:10.3866/PKU.DXHX20160342

*通訊作者，Email: yx-sun@whu.edu.cn

基金資助：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21004046，51473126)