馬亢，周慶峰，施傳信，裴冬麗，閆永峰（商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000）

?

激光共聚焦顯微鏡技術(shù)進(jìn)展

馬亢，周慶峰，施傳信，裴冬麗，閆永峰
（商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘476000）

摘要：激光共聚焦顯微鏡技術(shù)發(fā)展迅速，新技術(shù)主要集中于從提高分辨率、降低光毒性、提高掃描速度、活體觀察等方面提升激光共聚焦顯微鏡的功能，各種新技術(shù)帶來更多的生物學(xué)應(yīng)用潛力，因此有必要梳理分析各項(xiàng)新技術(shù)的原理。本研究歸納分析了光門控、白激光、GaAsP光譜檢測(cè)器、超高分辨率、活細(xì)胞工作站、光片成像系統(tǒng)、多光子、相干反斯托克斯拉曼散射、激光捕獲顯微切割等技術(shù)的原理和應(yīng)用潛力。并指出了現(xiàn)有技術(shù)在掃描速度、兼容性、樣品適用性等方面的不足，展望了下一步的研究方向。該論文供研究人員在熟悉和了解新技術(shù)的基礎(chǔ)上更加清晰的獲知“基于什么樣的技術(shù)能夠達(dá)到什么樣的生物學(xué)功能”，進(jìn)而獲得更多的實(shí)驗(yàn)思路。

關(guān)鍵詞：激光共聚焦顯微鏡；實(shí)驗(yàn)室管理；大型精密儀器；超高分辨率

0　引言

激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用廣泛，作為生物學(xué)熒光分析的頂級(jí)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，分析處理軟件功能豐富?？蓪?duì)活細(xì)胞組織或細(xì)胞切片進(jìn)行連續(xù)掃描，進(jìn)而獲得高分辨率的細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器和細(xì)胞膜系統(tǒng)的三維圖像，可以通過定量軟件在亞細(xì)胞水平上分析Ca2+，pH值，膜電位等生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化。在細(xì)胞及分子生物學(xué)、抗癌藥物篩選、大腦和神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)、形態(tài)學(xué)、食品衛(wèi)生、發(fā)酵、遺傳學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域具有不可替代的作用。近幾年隨著技術(shù)的突破，尤其是2012年以后各主要廠家主力產(chǎn)品升級(jí)換代后，大量新技術(shù)獲得突破和授權(quán)，并成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。尤其是以超高分辨率、多光子、活體工作站、相干反斯托克斯拉曼散射為代表的新技術(shù)使激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)具備了更強(qiáng)大的功能和更豐富的生物學(xué)應(yīng)用潛力。各種新技術(shù)組件執(zhí)行不同的功能、能夠達(dá)到不同的生物學(xué)功能，并且不同組件之間具有成套性，例如門控共聚焦組件和白激光搭配，多光子系統(tǒng)和相干反斯托克斯拉曼散射能夠獲得更好效果。因此有必要梳理和分析激光共聚焦顯微鏡的最新技術(shù)的原理、優(yōu)勢(shì)和不足，以供研究人員或科研管理人員更好的使用和了解激光共聚焦顯微鏡，在熟悉和了解新技術(shù)原理的基礎(chǔ)上更加清晰的獲知“基于什么樣的配置平臺(tái)能夠達(dá)到什么樣的生物學(xué)功能”，進(jìn)而獲得更多的實(shí)驗(yàn)思路。

1　激光共聚焦顯微鏡

激光共聚焦顯微鏡是高度集成化的光學(xué)顯微鏡，在農(nóng)業(yè)科學(xué)的形態(tài)學(xué)研究中具有極重要的地位［1］。其基本原理是以激光作為光源，采用共軛聚焦技術(shù)消除焦點(diǎn)以外雜散光的干擾，極大的提高了分辨率。利用快速掃描成像和Z軸步進(jìn)可以實(shí)現(xiàn)三維成像和光學(xué)切片。系統(tǒng)包括研究級(jí)顯微鏡、激光器、檢測(cè)器、掃描器、工作站、防震臺(tái)等主要部件［2］。

2　現(xiàn)有最新商用技術(shù)解決的問題和思路

近幾年投入商用的重要技術(shù)包括：光門控、白激光、GaAsP光譜檢測(cè)器、超高分辨率顯微術(shù)、活細(xì)胞工作站、光片成像系統(tǒng)、多光子顯微鏡、相干反斯托克斯拉曼散射、激光捕獲顯微切割技術(shù)。

各種最新技術(shù)以組件形式加裝于現(xiàn)有激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)，主要解決提高分辨率、降低光毒性、提高掃描速度、厚樣品觀察、活體觀察等方面。其中分辨率和降低光毒性是相互矛盾難以平衡的，提高分辨率需要加強(qiáng)熒光信號(hào)，增強(qiáng)激光照射功率和時(shí)間，這樣會(huì)降低染料熒光壽命，降低樣品的存活率等。而降低光毒性意味著減少激光照射的功率和時(shí)間，明顯是不利于熒光信號(hào)的收集［3］。所以各種最新技術(shù)如光門控、磷砷化鎵混合檢測(cè)器、高速掃描、光片技術(shù)、超高分辨率等都是以降低背景信號(hào)、增強(qiáng)靈敏度、在使用較弱功率激光下提高信號(hào)強(qiáng)度為目的。圖1為激光共聚焦顯微鏡最新商用技術(shù)主要解決的問題和思路。

3　激光共聚焦顯微鏡最新商用技術(shù)組件解析

3.1光門控

熒光染料的激發(fā)和發(fā)射之間存在一個(gè)時(shí)間距離即熒光壽命（多在ns級(jí)別）。光門控技術(shù)（Light Gate）是用脈沖光源在極短的時(shí)間內(nèi)對(duì)熒光染料刺激，然后在可調(diào)整時(shí)間的窗口內(nèi)（ns級(jí)別）用高速檢測(cè)器檢測(cè)熒光信號(hào)，由于檢測(cè)時(shí)間窗口可以根據(jù)熒光染料的性質(zhì)調(diào)整最佳檢測(cè)時(shí)間從而避免了背景信號(hào)的干擾。此外由于使用了脈沖信號(hào)和高速檢測(cè)器的聯(lián)動(dòng)（類似相機(jī)快門原理），因此可以有效的去除自發(fā)熒光的干擾信號(hào)。實(shí)際應(yīng)用中可以利用光譜分析技術(shù)（rectangular lambda square plot）根據(jù)熒光壽命分離染料完成多色成像——即通過光譜掃描分析得到樣品中染色熒光的最佳時(shí)間窗口，一次只收集一種熒光的信號(hào)可以去除自發(fā)熒光及反射和散射光的干擾信號(hào)、進(jìn)而獲得更高的信噪比。

圖1　激光共聚焦顯微鏡最新商用技術(shù)

3.2白激光

傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡使用激光管作為激發(fā)光源，常用的例如紫外激光器（405 nm）、HeNe激光器（543、633 nm）、Ar離子激光器（458、476、488、496、514 nm）受制于激光器的制約，常用激光激發(fā)譜線比較少。只具有少量的固定的激發(fā)譜線。在實(shí)際研究中，尤其是針對(duì)自發(fā)熒光較多的樣本的研究中，以上幾種常用激發(fā)譜線并不能很好的完成任務(wù)。白激光是一種脈沖激光，使用1060 nm的皮秒激光作為原始光源在功率放大后經(jīng)超連續(xù)光纖提供完整的可見光譜［4］。在AOBM的配合下可以同時(shí)獲得最多8束光線可以獲得在470～670 nm之間的連續(xù)激發(fā)譜線。白激光技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)光譜分析技術(shù)（rectangular lambda square plot）和門控技術(shù)（Light Gate），可以在470～670 nm之間篩選熒光蛋白、鑒定自然熒光、為自發(fā)熒光的樣品找到最佳的標(biāo)記染料、自動(dòng)獲得最優(yōu)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射區(qū)間。

3.3 GaAsP光譜檢測(cè)器（磷砷化鎵光譜檢測(cè)器）

傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡一般采用PMT檢測(cè)器（光電倍增管檢測(cè)器），入射光子在1000 V的電壓下通過級(jí)聯(lián)倍增輸出陽極。新型的磷砷化鎵混合檢測(cè)器，入射光子經(jīng)GaAsP（磷砷化鎵光陰極）在8.5 kV真空高壓加速下獲得電子轟炸增益和雪崩增益輸出陽極。相比PMT檢測(cè)器具有低本底噪聲、高靈敏度、寬動(dòng)態(tài)范圍等優(yōu)點(diǎn)。更高的靈敏度和更低的本底噪聲意味著對(duì)樣品可以使用更低的激光強(qiáng)度，可以減少對(duì)樣品的光毒害進(jìn)而獲得更高的細(xì)胞成活率。由于磷砷化鎵混合檢測(cè)器的檢測(cè)特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)光子計(jì)數(shù)提供更加精確的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果［5］。

3.4超高分辨率顯微術(shù)

Eric Betzig，Stefan W.Hell，W.E.Moerner三位科學(xué)家因在超高分辨率熒光顯微鏡方面的研究獲得了2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。光學(xué)顯微鏡分辨率存在一個(gè)極限：如果光經(jīng)過的不是一條狹縫，而是一個(gè)圓孔，那么圓孔會(huì)在各個(gè)方向上限制光的傳播，從而光在各個(gè)方向上發(fā)生衍射，得到的不是一個(gè)理想的點(diǎn)，而是一個(gè)有一定大小的衍射斑或者叫愛里斑（Airy Disk）［6］。由于光的衍射現(xiàn)象顯微鏡不能把光匯集成無限小的點(diǎn)，當(dāng)2個(gè)點(diǎn)離得很接近時(shí)，兩者的愛里斑會(huì)重合形成一個(gè)圓斑，在光學(xué)顯微鏡中2個(gè)點(diǎn)就變得不可分辨。因此愛里斑的直徑就是光學(xué)顯微鏡的理論最高分辨率，經(jīng)估算約為200 nm，被稱為阿貝極限。而突破200 nm光學(xué)極限的顯微技術(shù)被稱為超高分辨率或納米顯微技術(shù)（Nanoscopy）［7］。目前能夠?qū)崿F(xiàn)商業(yè)化并和激光共聚焦顯微鏡成套使用的技術(shù)主要有以下幾種。

3.4.1受激發(fā)射損耗顯微術(shù)（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED）2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主之一的Stefan W.Hell發(fā)明的受激發(fā)射損耗顯微術(shù)（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED），目前已被授權(quán)給德國(guó)徠卡公司（現(xiàn)已被美國(guó)丹納赫公司收購(gòu)）并實(shí)現(xiàn)了在激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)上的商用。STED技術(shù)中使用兩束光，一束為激發(fā)光、一束為損耗光，兩束光以同心圓形式（損耗光直徑大于激發(fā)光）照射樣品，激發(fā)光使衍射斑內(nèi)的熒光分子處于激發(fā)態(tài)，損耗光使激發(fā)光光斑外周的電子以受激發(fā)射的方式回到基態(tài)，失去發(fā)射熒光分子的能力。而激發(fā)光光斑位置不受損耗光影響繼續(xù)以自發(fā)熒光的方式回到基態(tài)。由于在受激發(fā)射過程中所發(fā)出的熒光和自發(fā)熒光的波長(zhǎng)及傳播方向均不同，因此真正被探測(cè)器所接受到的光子均是由位于激發(fā)光斑中心部分的熒光樣品通過自發(fā)熒光方式產(chǎn)生的。由此，有效熒光的發(fā)光面積得以減小，從而提高了系統(tǒng)的分辨率［8］。增加損耗光的強(qiáng)度可以提高STED的分辨率?，F(xiàn)有技術(shù)下可以實(shí)現(xiàn)50 nm以下的分辨率［9］。由于STED技術(shù)采用激發(fā)光和損耗光2種激光掃描樣品，高度依賴于染料的熒光壽命。配合白激光和磷砷化鎵混合檢測(cè)器及光門控技術(shù)可以降低STED所需的光強(qiáng)度，降低對(duì)樣品和染料的損耗。提高系統(tǒng)活細(xì)胞成像的性能。STED技術(shù)不需要一個(gè)個(gè)的讀取熒光分子，可以通過光斑的大小控制分辨率，實(shí)現(xiàn)在20～200 nm之間可控的分辨率變化，觀察時(shí)可在分辨率和掃描速度之間靈活掌握，有利于快速的觀察活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)變化。此外STED技術(shù)另一優(yōu)勢(shì)是對(duì)樣品沒有特殊要求，不需要內(nèi)源性的特殊熒光標(biāo)記蛋白，理論上任何適用于激光共聚焦顯微鏡的樣品都可以觀察（但若要獲得更高的分辨率，需要保證樣品高密度的熒光標(biāo)記），目前可以用多條STED激光線的形式實(shí)現(xiàn)多色超高分辨率觀察，允許同時(shí)對(duì)樣品使用多種熒光染料［10-11］。缺陷在于Z軸方向的三維成像分辨率遠(yuǎn)低于其他超高分辨率技術(shù)，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜價(jià)格昂貴。

3.4.2光激活定位顯微技術(shù)（Photo Activated Localization Microscopy，PALM）2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主之一的Eric Betzig發(fā)明的光激活定位顯微技術(shù)（Photo Activated Localization Microscopy，PALM）目前已被授權(quán)給德國(guó)卡爾蔡司公司并實(shí)現(xiàn)了在激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)上的商用。其基本原理是：PALM是一種單分子顯微技術(shù)需要對(duì)樣品標(biāo)記光切換蛋白（如PA-GFP，未激活前不發(fā)光，經(jīng)405 nm激光激活后，才可經(jīng)488 nm激光激發(fā)出綠色熒光），通過405 nm激光低強(qiáng)度照射細(xì)胞表面，一次只激活極少量的PA-GFP熒光分子，然后再通過488 nm激光照射精確定位這些熒光分子，定位后用較長(zhǎng)時(shí)間的488 nm激光漂白已經(jīng)正確定位的熒光分子（使之不能再被激活）。之后，分別用405 nm和488 nm激光來激活和漂白其他的熒光分子，依此循環(huán)上百次，獲得目的區(qū)域內(nèi)的所有熒光分子的精確位置，即可合成超高分辨率圖像［12］。最高可實(shí)現(xiàn)的橫向20 nm和軸向50 nm的分辨率。PALM技術(shù)需要對(duì)樣品標(biāo)記光切換蛋白，只能觀察外源表達(dá)的蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)源的蛋白質(zhì)無法觀察。

3.4.3隨機(jī)光學(xué)重建顯微法（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）STORM技術(shù)（StochasticOpticalReconstructionMicroscopy，STORM）是華裔科學(xué)家莊曉薇開發(fā)的一種超高分辨率技術(shù)，目前日本尼康公司已將此技術(shù)實(shí)現(xiàn)商用。STORM技術(shù)原理和流程類似于PALM技術(shù)，主要區(qū)別在于使用了具有光激活性的化學(xué)熒光分子代替了外源表達(dá)的光切換蛋白。利于具有光激活性的化學(xué)熒光分子（如Cy3和Cy5的交聯(lián)分子）交聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來標(biāo)記細(xì)胞的內(nèi)源蛋白。改進(jìn)了PALM技術(shù)只能觀察外源表達(dá)的蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)源的蛋白質(zhì)無法觀察的缺陷。改進(jìn)的STORM技術(shù)可以使用兩種或以上的熒光分子探針，可以同時(shí)觀察多種蛋白的空間相對(duì)位子［13］。最大分辨率可以達(dá)到XY軸20～30 nm，Z軸50 nm。但是因?yàn)榭贵w標(biāo)記的內(nèi)源蛋白并是一對(duì)一的。因此STOM不能量化蛋白質(zhì)分子的數(shù)量［14］。

3.4.4飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)（Saturated Structure Illumination Microscopy，SSIM）蔡司公司和GE旗下的API公司都推出了基于SSIM技術(shù)（Saturated Structure Illumination Microscopy，SSIM）的超高分辨率技術(shù)，其中蔡司的SSIM可搭載于原有激光共聚焦平臺(tái)，并可與PALM技術(shù)同平臺(tái)共同使用。SSIM基于莫爾紋原理，通過非線性結(jié)構(gòu)光學(xué)照明將多重相互衍射的光照射樣品，然后從收集的發(fā)射光模式中提取分辨率信息［15-16］。最大分辨率可以達(dá)到50 nm，優(yōu)勢(shì)在于使用任何熒光染料都可以達(dá)到XY軸100 nm的分辨率［17］。

3.4.5圖像超分辨率重構(gòu)（Super Resolution，SR）圖像超分辨率重構(gòu)（Super Resolution，SR）主要通過配合60X或100X油鏡將共聚焦焦點(diǎn)小孔縮小，以強(qiáng)激光將樣品掃描20～50次后通過軟件將低分辨率的圖像合成為高分辨率圖像。這并不是一種真正意義上的超高分辨率，存在一定的假信號(hào)風(fēng)險(xiǎn)，觀察時(shí)必須使用高倍油鏡。且運(yùn)行中需要以強(qiáng)激光對(duì)樣品掃描20～50次，熒光淬滅嚴(yán)重，不適于觀察活細(xì)胞［18］。其優(yōu)勢(shì)是適用范圍廣，不需要對(duì)樣品進(jìn)行特殊處理，幾乎適用于所有熒光樣品。XY軸分辨率最高可以達(dá)到120 nm。

3.5活細(xì)胞工作站（Live cell Imaging System）

為了更好的觀察活的細(xì)胞或組織活體等，各廠家均推出了作為組件可加裝于目前激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)的活細(xì)胞工作站（Live cell Imaging System）。其突出特點(diǎn)是利用各種工程技術(shù)起到活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間快速觀察的目的?；罴?xì)胞工作站的核心部件包括：（1）細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境控制，如二氧化碳、溫度、PH、適度等的調(diào)節(jié)。（2）零漂移補(bǔ)償系統(tǒng)，細(xì)胞會(huì)在培養(yǎng)基中漂移，為了實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的自動(dòng)觀察，需要對(duì)細(xì)胞位置進(jìn)行紅外定位，以保持顯微鏡焦平面始終跟隨目的樣品。（3）電動(dòng)載物臺(tái)，利于樣品中多細(xì)胞的快速觀察。（4）有的活細(xì)胞工作站還搭配了顯微操作系統(tǒng)，為轉(zhuǎn)基因、胚胎研究等提供了重要支持［19］。

3.6光片成像系統(tǒng)

光片成像主要是采用一層光束薄片從樣品側(cè)面激發(fā)熒光，與傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡相比，光片成像系統(tǒng)采用了線性的照明取代了點(diǎn)掃描，最大的優(yōu)勢(shì)是具有更好的成像速度、更低的光毒性及更低的光漂白效應(yīng)，因此對(duì)樣品和熒光染料更溫和，適宜于長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)觀察，配合活細(xì)胞工作站可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)數(shù)天的活體觀察。特別適用于活體成像和神經(jīng)學(xué)、胚胎發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域研究。在表達(dá)水平較弱的內(nèi)源表征水平研究中具有重要優(yōu)勢(shì)，例如近期的研究熱點(diǎn)CRISPR/Cas系統(tǒng)（成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)核酸酶）等人工核酸酶的基因組編輯方法使用熒光標(biāo)記內(nèi)原性蛋白質(zhì)。它們所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因生物體帶有目的基因，其表征水平較低，同時(shí)有較高的生理相關(guān)性。但共聚焦顯微鏡往往會(huì)迅速漂白相關(guān)分子的微弱熒光。因此采用光片成像系統(tǒng)能夠很好的觀察此類脆弱信號(hào)［20］。目前已有相關(guān)商用公司實(shí)現(xiàn)在共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上通過組件的形式搭建光片成像平臺(tái)。二者共用激光光源和成像設(shè)備，可以在研究中實(shí)現(xiàn)短時(shí)間共聚焦觀察和長(zhǎng)時(shí)間光片成像的結(jié)合。

3.7多光子顯微鏡（Multi-Photon Microscopy）

多光子激光顯微鏡（Multi-Photon Microscopy）是將多光子激發(fā)技術(shù)應(yīng)用于激光共聚焦顯微鏡的一種新技術(shù)。多光子激發(fā)的原理是：熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)或多個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，隨后熒光分子在經(jīng)過一個(gè)時(shí)間極短的激發(fā)態(tài)壽命后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子。這個(gè)過程與使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子的效果是一樣的［21］。多光子激發(fā)需要很高的激光光子密度（5×1012W/cm2），為了同時(shí)達(dá)到保證能量和不損傷細(xì)胞的目的，多光子激發(fā)需要特殊的激光器（飛秒級(jí)脈沖可調(diào)諧鎖模紅外激光器），其特點(diǎn)是具有很高的峰值能量和極高的頻率（脈寬100 FS，頻率80 MHz～100 MHz），從而達(dá)到降低平均能量的目的，在保證多光子激發(fā)的同時(shí)降低熱效應(yīng)和光毒性。為了將匯集足夠高的光子密度需要使用高數(shù)值孔徑的專用物鏡。由于多光子激發(fā)需要極高能量，因此只有在物鏡聚焦點(diǎn)上才能聚集足夠的光子密度達(dá)到多光子激發(fā)的效果，焦平面以外很少產(chǎn)生雜散光，因此多光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，具有更高的靈敏度和熒光信號(hào)收集率［22］。由于多光子激發(fā)使用的是遠(yuǎn)紅外波長(zhǎng)光，相比短波長(zhǎng)的光具有很多的天然優(yōu)勢(shì)：長(zhǎng)波長(zhǎng)相對(duì)短波長(zhǎng)光受散射影響較小所以具有更強(qiáng)的穿透性（單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達(dá)焦平面之前易被樣品吸收而衰減，不易對(duì)深層樣品激發(fā)）、長(zhǎng)波長(zhǎng)光相對(duì)短波長(zhǎng)光對(duì)細(xì)胞光毒性更小。此外由于聚焦方式不同，多光子顯微鏡不需要共聚焦針孔，多光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，只有焦平面上才會(huì)發(fā)生光漂白和光毒性，焦平面外的熒光分子不被激發(fā)使較多的激發(fā)光可以到達(dá)焦平面，使激發(fā)光可以穿透更深的標(biāo)本。因此由于兼具了更強(qiáng)的穿透性和更低的細(xì)胞光毒性，多光子顯微鏡更適宜長(zhǎng)觀察較厚樣品或活細(xì)胞（如胚胎、神經(jīng)細(xì)胞、活體觀察、電生理、人體組織等）［23］。其自身缺點(diǎn)有：分辨率不及共聚焦顯微鏡；熱效應(yīng)大對(duì)樣品有影響；無法觀察紅外光強(qiáng)吸收的樣本；結(jié)構(gòu)復(fù)雜，購(gòu)買和維護(hù)費(fèi)用遠(yuǎn)高于一般共聚焦顯微鏡。近期有些廠家開發(fā)出了多光子激發(fā)與超連續(xù)光譜、STED（受激發(fā)射損耗顯微術(shù)）或TIRF（全內(nèi)反射熒光成像）聯(lián)用的技術(shù)使多光子顯微鏡分辨率得到進(jìn)一步提升［24-25］。

3.8相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-stokes Raman Scattering，CARS）技術(shù)

相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-stokes Raman Scattering，CARS）是一種基于分子振動(dòng)能級(jí)的三階四波混頻非線性光學(xué)過程，需要有3個(gè)光子參與（泵浦光、斯托克斯光、探針光），通常泵浦光和探針光來自同一個(gè)光脈沖，托克斯光來自另外一個(gè)光脈沖。在泵浦光場(chǎng)Ep（ωp），斯托克斯光場(chǎng)Es（ωs）和探針光場(chǎng)E’P（ω’p）相互作用下的樣品分子會(huì)產(chǎn)生一個(gè)頻率為ωas=2ωp-ωs的反斯托克斯場(chǎng)Eas。CARS技術(shù)具有重大優(yōu)勢(shì)：首先，CARS是一個(gè)光的相干過程，觀察是基于樣品分子本身的分子結(jié)構(gòu)，不需要熒光染料即可觀察，對(duì)樣品本身幾乎沒有任何傷害。但是由于獲得樣品的完整信號(hào)，需要多次調(diào)節(jié)泵浦光，斯托克斯光以獲得不同特征震動(dòng)能級(jí)的CARS信號(hào)［26］。因此掃描時(shí)間過長(zhǎng)，很難獲得樣品的動(dòng)態(tài)圖像。為了克服以上缺點(diǎn)，目前有廠家開發(fā)出了將多光子、CARS和SHG（二次諧波成像）相結(jié)合的激光共聚焦顯微鏡平臺(tái)，利用各種技術(shù)的組合相互彌補(bǔ)缺陷［27］，將CARS和結(jié)構(gòu)照明的聯(lián)用，可以將CARS的空間分辨率提高到了120 nm［28］，此外，利用飛秒脈沖激光器可以同時(shí)激發(fā)CARS信號(hào)和雙光子熒光信號(hào)的特性，CARS與多光子顯微鏡聯(lián)用的潛力很大［29］。但是其成本，維護(hù)、保養(yǎng)和使用等方面的難度可想而知。

3.9激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser Capture Microdissection，LCM）

激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser Capture Microdissection，LCM）是利用激光將經(jīng)特殊處理的樣品按目的區(qū)域選擇性切割分離并收集的技術(shù)，其基本原理是將樣品處理后吸附在乙烯乙酸乙烯酯膜（EVA）上（因其最大吸收峰接近紅外波長(zhǎng)，對(duì)切割和觀察沒有太大影響）。在顯微鏡視野下選取目的區(qū)域（可以是組織或者單細(xì)胞等）利用氮激光切割相關(guān)區(qū)域EVA膜，然后經(jīng)收集系統(tǒng)收集實(shí)現(xiàn)顯微分割。因激光切割作用在EVA膜上，熱效應(yīng)被EVA膜吸收，實(shí)現(xiàn)了非接觸式分割，能夠保證樣品不受傷害［30］。目前LCM技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)XY軸上的切割。LCM技術(shù)可以較為方便的獲得單細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞PCR。因?yàn)槠淠軌蚪鉀Q組織中細(xì)胞異質(zhì)性問題，現(xiàn)已成為癌癥研究中的一項(xiàng)基礎(chǔ)技術(shù)［31］。LCM技術(shù)相對(duì)激光共聚焦顯微鏡需要特殊的物鏡（需要承受切割激光）、機(jī)械臂定位系統(tǒng)、專用的切割激光光源，以及一套專用的收集系統(tǒng)。

4　展望

從上文總結(jié)來看，激光共聚焦顯微鏡在技術(shù)層面上為了獲得更好的觀察效果，著力于從提高分辨率、降低光毒性、提高掃描速度、厚樣品觀察、活體觀察等方面提升技術(shù)水平。目前來看最有效，對(duì)激光共聚焦顯微鏡技術(shù)推動(dòng)最大的是超高分辨率顯微術(shù)，突破光學(xué)極限使研究者能夠獲得更精細(xì)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有利于研究者更深刻的認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)。但是在獲得超高分辨率的基礎(chǔ)上，獲得活的動(dòng)態(tài)的圖片更能夠深刻解釋生命過程，因此激光共聚焦顯微鏡技術(shù)下一步的研究重點(diǎn)應(yīng)該集中在以下幾點(diǎn)。

4.1更快的掃描速度

目前共聚焦掃描速度受限于掃描設(shè)備的機(jī)械結(jié)構(gòu)，要想獲得更快的掃描速度只能犧牲分辨率。而很多生物過程非常迅速，目前仍然無法檢測(cè)。

4.2更完美的超高分辨率技術(shù)

目前超高分辨率技術(shù)有STORM、PALM、STED和SSIM幾種技術(shù)，分辨率從20～200 nm不等，但是各種技術(shù)均有一定缺陷，例如在樣品處理、Z軸方向、光毒性等方面還不近完美，在實(shí)際觀察中往往很難達(dá)到極限分辨率。

4.3更強(qiáng)的兼容性

激光共聚焦顯微鏡技術(shù)涉及到多種激發(fā)方式，例如上文提到的多光子和光片式觀察，相干反斯托克斯拉曼散射在理論上可以公用一套激光系統(tǒng)。超高分辨率顯微術(shù)可以搭配白激光技術(shù)。但目前由于各公司的專利問題，在成套性和兼容性上尚有改進(jìn)余地，目前的設(shè)備并無法充分發(fā)揮應(yīng)用的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

［1］Cannon J，Armas M.Laser Focus World，Ultraviolet lasers expand uses of confocal microscopes［J］.Laser Focus World，1993，29:99-104.

［2］王春梅.激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)［M］.西安:第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2004.

［3］Marx V.Is super-resolution microscopy right for you［J］？Nat Methods，2013（10）:1157-1163.

［4］劉江，劉昆，師紅星等.高功率全光纖中紅外超連續(xù)譜激光源［J］.中國(guó)激光，2014，09:27-31.

［5］劉翻.若干新型高靈敏度熒光檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建與評(píng)價(jià)［D］.上海:華東理工大學(xué)，2013.

［6］PawleyJ B.Handbook of Biological Confocal Microscopy，3rd［M］. USA:Springer，2006:20-42.

［7］干福熹，王陽.突破光學(xué)衍射極限，發(fā)展納米光學(xué)和光子學(xué)［J］.光學(xué)學(xué)報(bào)，2011，09:57-65.

［8］Klar T A，Jakobs S，Dyba M，et al.Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission［J］.Proc NatlAcad Sci USA，2000，97（15）:8206-8210.

［9］Westphal V，Rizzoli S O，Lauterbach M A，et al.Video-rate far-field optical nanoscopy dissects synaptic vesicle movement［J］.Science，2008，320（5873）:246-249.

［10］Meyer L，Wildanger D，Medda R，et al.Dual-color STED microscopy at 30-nm focal-plane resolution［J］.Small，2008，4（8）: 1095-1100.

［11］李帥，匡翠方，丁志華，等.受激發(fā)射損耗顯微術(shù)（STED）的機(jī)理及進(jìn)展研究［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2013，02:103-113.

［12］Betzig E，Patterson G H，Sougrat R，et al.Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution［J］.Science，2006，313（5793）:1642-1645.

［13］Rust M J，Bates M，Zhuang X.Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy（STORM）［J］.Nat Methods，2006，3（10）:793-795.

［14］呂志堅(jiān)，陸敬澤，吳雅瓊，等.幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進(jìn)展［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，12:1626-1634.

［15］吳美瑞，楊西斌，熊大曦，等.結(jié)構(gòu)光照明熒光顯微鏡突破衍射極限的原理和在生命科學(xué)中的應(yīng)用［J］.激光與光電子學(xué)進(jìn)展，2015，01: 23-33.

［16］陳建玲.結(jié)構(gòu)光照明超分辨微分干涉相襯顯微成像技術(shù)［D］.武漢:華中科技大學(xué)，2013.

［17］陳良怡.運(yùn)用結(jié)構(gòu)光照明的活細(xì)胞超高分辨率成像技術(shù)［J］.中國(guó)科學(xué):生命科學(xué)，2015（9）:903-904.

［18］陳景楊.紅外顯微圖像超分辨重建算法研究［D］.北京:北京理工大學(xué)，2015.

［19］杜娟，孫劍會(huì)，李力，等.活細(xì)胞工作站使用中的視野漂移與矯正［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，18:1896-1900.

［20］De Angelis S，Ammannito E，Di Iorio T，et al.The spectral imaging facility:Setup characterization［J］.Rev Sci Instrum，2015，86（9）: 093101.

［21］Williams R M，Zipfel W R，Webb W W.Multiphoton microscopy in biological research［J］.Curr Opin Chem Biol，2001，5（5）:603-608.

［22］Denk W，Strickler J H，Webb W W.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy［J］.Science，1990，248（4951）:73-76.

［23］鐘家照.多光子顯微技術(shù)用于人體組織診斷的研究［D］.福州:福建師范大學(xué)，2012.

［24］任煜軒，于洋，王艷.超高分辨率顯微鏡推進(jìn)納米生物學(xué)研究［J］.生命科學(xué)，2014，12:1255-1265.

［25］崔權(quán)，梁小寶，黃順，等.超連續(xù)譜進(jìn)行多色雙光子成像［J］.激光生物學(xué)報(bào)，2015，01:1-7，16.

［26］劉偉，陳丹妮，劉雙龍，等.超衍射極限相干反斯托克斯拉曼散射顯微成像技術(shù)及其探測(cè)極限分析［J］.物理學(xué)報(bào)，2013，16:162-168.

［27］周前，袁景和，周衛(wèi)，等.相干反斯托克斯拉曼散射顯微成像技術(shù)及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.電子顯微學(xué)報(bào)，2015，03:261-271.

［28］Hajek K M，Littleton B，Turk D，et al.Amethod for achieving superresolved widefield CARS microscopy［J］.Opt Express，2010，18（18）: 19263-19272.

［29］Nan X L，Tonary A M，Stolow A，et al.Intracellular imaging of HCV RNA and cellular lipids by using simultaneous two-photon fluorescenceandcoherentanti-StokesRamanscattering microscopies［J］.Chembiochem，2006，7（12）:1895-1897.

［30］RobertsJP.Thecuttingedgeinlasermicrodissection［J］. Biophotonics International，2002，9:50-53.

［31］DattaS，MalhotraL，DickersonR，etal.Lasercapture microdissection:Big data from small samples［J］.Histol Histopathol，2015，30（11）:1255-1269.

The Progress of Confocal Laser Scanning Microscope

Ma Kang，Zhou Qingfeng，Shi Chuanxin，Pei Dongli，Yan Yongfeng
（Shangqiu Normal University Department of Life Science，Shangqiu 476000，Henan，China）

Abstract：At present，the technique of confocal laser scanning microscope is booming.The new techniques aim to improve the functions of the confocal laser scanning microscope from the following aspects：improving resolution，decreasing phototoxicity，and enhancing scanning speed and viviperception.Meanwhile，the potential of biological applications is great with the help of these new techniques，so it is necessary to sort out and analyze the principles of these new techniques.This essay mainly analyzed these techniques’principles and potential of light gate，white laser，GaAsP，ultrahigh-resolution，live cell imaging system，light-sheet，multi-photon microscopy，coherent anti-stokes raman scattering，laser capture microdissection.Besides，the future research direction and the shortcomings of the existing techniques in scanning speed，compatibility，applicability of samples were also analyzed.This essay can assist researchers to learn more about the new techniques and obtain biological functions based on corresponding kind of technique，and acquire more ideas for experiment research.

Key words：Confocal Laser Scanning Microscope；Laboratory Management；Large-scale Precision Instrument；Ultrahigh Resolution

中圖分類號(hào)：Q-336

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas16010025

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金“番茄MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子新基因ShMADSTF的抗病分子機(jī)制”（31571997）；河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目“微生物轉(zhuǎn)化法高效制備橄欖油活性成分羥基酪醇”（152102210125）。

第一作者簡(jiǎn)介：馬亢，男，1983年出生，河南商丘人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：實(shí)驗(yàn)室管理，科技產(chǎn)業(yè)化。

通信地址：476000河南省商丘市商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院。 476000河南省商丘市商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院。

通訊作者：閆永峰，男，1967年出生，河南杞縣人，教授，博士，研究方向：野生動(dòng)物調(diào)查和生態(tài)研究。

收稿日期：2016-01-29，修回日期：2016-04-21。