宋　奇，王　琴，吳韋黎，邵　敏，張　宇，張在軍，王玉強，陶　亮

(1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州　510080；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所，廣東 廣州　510632)

?

新藥T-006對東莨菪堿所致記憶障礙模型動物學(xué)習(xí)記憶的改善作用

宋奇1，王琴1，吳韋黎1，邵敏1，張宇1，張在軍2，王玉強2，陶亮1

(1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州510080；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所，廣東 廣州510632)

摘要：目的探討新藥T-006對東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響及其作用機制。方法將72只♂昆明小鼠隨機分為6組：正常對照組、模型組(給予東莨菪堿)、陽性藥對照組(多奈哌齊+東莨菪堿)、T-006組(T-006+東莨菪堿，包括T-006 1 mg·kg-1組、T-006 3 mg·kg-1組和T-006 10 mg·kg-1組)。連續(xù)給藥14 d，給藥d 11進行Morris水迷宮實驗。水迷宮實驗連續(xù)進行5 d，前4 d為定位航行實驗，d 5為空間探索實驗。定位航行實驗時，除正常對照組外，每天每只小鼠于入水前20 min腹腔注射2 mg·kg-1東莨菪堿造模，正常對照組腹腔注射等量無菌生理鹽水?？臻g探索實驗時，實驗動物不再給予東莨菪堿造模并且不進行T-006給藥。5 d水迷宮實驗結(jié)束后，立即取樣并檢測大腦海馬和皮層抗氧化能力相關(guān)指標(biāo)以及乙酰膽堿酯酶活性。結(jié)果與正常對照組比較，模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低，海馬和皮層中超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽(GSH)含量明顯下降，丙二醛(MDA)含量明顯升高，乙酰膽堿酯酶(AchE)活性明顯增高；各劑量的T-006均能明顯改善小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，所試劑量(3、10 mg·kg-1)的T-006明顯提高腦組織中SOD活性和GSH含量，并降低MDA含量和AChE活性。結(jié)論T-006能明顯改善東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，該作用機制可能與其抗氧化作用以及抑制乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：T-006；東莨菪堿；Morris水迷宮；昆明小鼠；海馬；皮層；學(xué)習(xí)記憶能力

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力減退、認(rèn)知功能障礙等精神癥狀[1-2]。AD 典型的病理變化包括大腦組織中老年斑沉積(主要由Aβ蛋白形成)，神經(jīng)元纖維纏結(jié)和膽堿能神經(jīng)元丟失[3]。AD的發(fā)病機制目前仍未完全闡明，“Aβ級聯(lián)學(xué)說”是目前較為公認(rèn)的 AD 發(fā)病學(xué)說之一[3-4]，該學(xué)說認(rèn)為，AD發(fā)生時，Aβ蛋白異常沉積引起一系列級聯(lián)反應(yīng)，包括氧化應(yīng)激毒性、神經(jīng)炎癥、鈣穩(wěn)態(tài)破壞等，直接或間接地?fù)p傷神經(jīng)元細(xì)胞，導(dǎo)致Aβ沉積，周圍膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，從而產(chǎn)生記憶損傷。

目前國內(nèi)外批準(zhǔn)用于AD治療的藥物多為膽堿酯酶抑制劑，代表藥為多奈哌齊，其主要通過抑制乙酰膽堿酯酶活性而抑制乙酰膽堿降解，增加局部乙酰膽堿濃度，從而改善神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能。但多奈哌齊只針對輕、中度AD，隨著病程發(fā)展，功能完整的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，多奈哌齊的作用也會隨之減弱。因此，開發(fā)治療AD 的新型藥物十分重要。川芎嗪(TMP)來源于中藥川芎的干燥根莖，具有抗炎、抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡等多方面藥理作用，但生物利用度不高[5]。J147是美國索克生物研究所合成的化合物，具有保護神經(jīng)突觸功能的作用[6]。T-006是我們將TMP分子連接到J147上，經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾而得到的新型化合物，前期體外實驗證明，T-006在應(yīng)激細(xì)胞模型中可表現(xiàn)出明顯的抗氧化應(yīng)激作用，可保護神經(jīng)細(xì)胞免于損傷[5]，提示該化合物有可能成為治療AD的新型藥物。本研究以東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙作為模型，就T-006對該模型中小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其可能機制進行初步探討。

Fig 1　Flowchart of animal experiments

1材料與方法

1.1試劑與儀器

T-006由暨南大學(xué)藥學(xué)院合成；多奈哌齊由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供；氫溴酸東莨菪堿和AchE試劑盒均購自Sigma公司；SOD試劑盒、GSH試劑盒、MDA試劑盒及考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Morris水迷宮測試系統(tǒng)購自淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司。

1.2動物與分組

健康♂成年昆明小鼠72只，體質(zhì)量(20±2) g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SPF級，許可證號SCXK(粵) 2011-0015]。動物隨機分為6組：正常對照組、模型組(給予東莨菪堿)、陽性藥對照組(多奈哌齊+東莨菪堿)、T-006組(T-006+東莨菪堿，包括T-006 1 mg·kg-1組、T-006 3 mg·kg-1組和T-006 10 mg·kg-1組)，每組12只。隨機分組后d 2開始給藥，連續(xù)給藥14 d，實驗流程圖見Fig 1。每只小鼠采用灌胃方式給藥，正常組與模型組灌胃給予相應(yīng)劑量的藥物溶劑(0.64 mol·L-1DMSO)。

1.3東莨菪堿致學(xué)習(xí)記憶障礙模型的建立

模型組、陽性藥對照組和T-006 3個劑量組分別在水迷宮實驗時小鼠入水前20 min腹腔注射2 mg·kg-1東莨菪堿造成記憶障礙，正常對照組小鼠注射相應(yīng)劑量無菌生理鹽水。

Fig 2　Results of Morris water maze assays(n=12)

1:Control;2:Model;3:Donepezil;4:T-006 1 mg·kg-1;5:T-006 3 mg·kg-1;6:T-006 10 mg·kg-1;*P<0.05vsmodel group.

1.4Morris水迷宮實驗

實驗方法參照文獻[7]，并作適當(dāng)修改。實驗時間總共5 d，以定位航行、空間探索為指標(biāo)。定位航行實驗連續(xù)進行4 d，觀察和記錄實驗動物尋找并爬上隱藏平臺所需時間。最后1 d(水迷宮實驗d 5)進行空間探索實驗，記錄動物第1次到達原平臺位置的時間(即潛伏期)、穿越平臺位置的次數(shù)以及在目標(biāo)象限活動的時間和路程。

1.5乙酰膽堿酯酶活性的測定

Morris水迷宮實驗結(jié)束后，立即對小鼠進行麻醉，以冰冷生理鹽水灌流后將動物斷頭取腦、分離海馬和皮層。分別按海馬和皮層重量加9倍蛋白裂解液制備腦組織勻漿，10 000×g離心30 min，取上清于-20℃冰箱保存。根據(jù)Sigma乙酰膽堿酯酶活性測試盒的說明書測定乙酰膽堿酯酶活性，用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。

1.6SOD活性及GSH、MDA含量測定

按上述方法制備海馬和皮層組織勻漿，10 000×g離心30 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的SOD活性、GSH含量和MDA含量測定說明書，測定SOD活性及GSH和MDA含量，用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。

1.7數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計

2結(jié)果

2.1水迷宮實驗結(jié)果

定位航行實驗結(jié)果中，隨著實驗的進行，正常對照組動物找到隱藏平臺時間逐漸縮短，表明該訓(xùn)練方法有效。與正常對照組相比，模型組動物找到平臺時間的平均值無明顯變化，表明東莨菪堿致記憶障礙模型建模成功；與模型組相比，多奈哌齊組動物找到平臺時間的平均值明顯縮短，表明陽性藥多奈哌齊在該模型中可以有效逆轉(zhuǎn)東莨菪堿造成的學(xué)習(xí)記憶障礙；與模型組相比，T-006 3個劑量組動物找到平臺時間均值明顯縮短(P<0.05)，效果與多奈哌齊相當(dāng)，見Fig 2A。

水迷宮空間探索實驗結(jié)果中，與正常對照組相比，模型組動物潛伏期明顯延長(P<0.05)，多奈哌齊組動物潛伏期與模型組相比明顯縮短(P<0.05)，T-006 3個劑量組動物潛伏期與模型組相比明顯縮短(P<0.05)，見Fig 2B。與正常對照組相比，模型組動物穿越平臺區(qū)域次數(shù)明顯減少(P<0.05)，多奈哌齊組動物穿越平臺次數(shù)與模型組相比明顯增加(P<0.05)，T-006 3個劑量組動物穿越平臺次數(shù)與模型組相比明顯增加(P<0.05)，見Fig 2C。與正常對照組相比，模型組動物在目標(biāo)象限游泳路程明顯減少(P<0.05)，多奈哌齊組動物在目標(biāo)象限路程與模型組相比明顯增加(P<0.05)，T-006 3個劑量組動物在目標(biāo)象限路程與模型組相比明顯增加(P<0.05)，見Fig 2D。與正常對照組相比，模型組動物在目標(biāo)象限活動時間明顯減少(P<0.05)，多奈哌齊組動物目標(biāo)象限活動時間與模型組相比明顯增加(P<0.05)，T-006 3個劑量組動物目標(biāo)象限活動時間與模型組相比明顯增加(P<0.05)，見Fig 2E；各組動物之間的平均游泳速度沒有明顯差異(P>0.05)，排除了動物體力差異對結(jié)果的影響，見Fig 2F。

Fig 3　AchE activities in hippocampus and cortex(n=4)

Note see Fig 2.*P<0.05vsmodel group.

2.2乙酰膽堿酯酶(AchE)活性測定結(jié)果

與正常對照組相比，模型組海馬和皮層中AChE活性均明顯升高(P<0.05)。在海馬組織中，與模型組相比，T-006(10 mg·kg-1)組和多奈哌齊組AChE 活性明顯降低(P<0.05)；在皮層組織中，與模型組相比，T-006(1、3、10 mg·kg-1)組和多奈哌齊組AChE 活性明顯降低(P<0.05)，見Fig 3。

2.3GSH、SOD及MDA含量測定結(jié)果

2.3.1SOD測定結(jié)果與正常對照組相比，模型組小鼠海馬和皮層SOD活性明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組海馬和皮層SOD活性無明顯升高(P>0.05)，T-006(1、3、10 mg·kg-1)組海馬和皮層SOD活性明顯升高(P<0.05)；與多奈哌齊組相比，T-006(10 mg·kg-1)可明顯升高海馬SOD活性(P<0.05) ，見Fig 4。

Fig 4　SOD activities in hippocampus and cortex(n=4)

Note see Fig 2.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsdonepezil group.

2.3.2GSH測定結(jié)果與正常對照組相比，模型組小鼠海馬和皮層GSH含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組海馬和皮層GSH含量無明顯升高(P>0.05)；與模型組相比，T-006(3、10 mg·kg-1)組海馬GSH含量明顯升高(P<0.05)，T-006(1、3、10 mg·kg-1)組皮層GSH含量明顯升高(P<0.05)；與多奈哌齊組相比，T-006(10 mg·kg-1)可明顯升高海馬GSH含量(P<0.05) ，見Fig 5。

2.3.3MDA測定結(jié)果與正常對照組相比，模型組小鼠海馬和皮層MDA含量明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組海馬和皮層MDA含量無明顯降低(P>0.05)；與模型組相比，T-006(3、10 mg·kg-1)組海馬和皮層MDA含量明顯降低(P<0.05)；與多奈哌齊組相比，T-006(3、10 mg·kg-1)可明顯降低皮層MDA含量(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 5　GSH levels in hippocampus and cortex(n=4)

Note see Fig 2.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsdonepezil group.

3討論

本實驗使用東莨菪堿致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙作為模型，東莨菪堿是乙酰膽堿的競爭性拮抗劑，小鼠腹腔注射東莨菪堿能阻滯M膽堿受體傳遞，模擬乙酰膽堿分泌不足造成的可逆性學(xué)習(xí)記憶障礙[9-10]。因此，東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙模型被認(rèn)為是AD藥物研究經(jīng)典的初篩模型。本研究在該模型上評價了新型化合物T-006對動物學(xué)習(xí)記憶的影響，實驗結(jié)果表明，T-006可明顯改善癡呆模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力；同時發(fā)現(xiàn)，T-006作用機制可能與抗氧化應(yīng)激作用和抑制乙酰膽堿酯酶活性有關(guān)。

AD的發(fā)病機制至今尚未被完全闡明，目前公認(rèn)的AD發(fā)病假說有“Aβ級聯(lián)假說”和“膽堿能假說”。Aβ級聯(lián)假說認(rèn)為，腦組織中沉積的Aβ蛋白會產(chǎn)生一系列的細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)，作用于膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞，其中包括氧化應(yīng)激損傷[4]，而SOD、GSH和MDA是反映機體氧化還原狀態(tài)的主要標(biāo)志物[8,11]；AD膽堿能假說認(rèn)為，乙酰膽堿酯酶活性升高會導(dǎo)致中樞乙酰膽堿含量降低，影響神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙[12-14]。本實驗結(jié)果顯示，T-006可顯著升高腦組織中SOD、GSH含量，降低MDA含量，且效果優(yōu)于多奈哌，并且T-006可有效拮抗東莨菪堿引起的乙酰膽堿酯酶含量升高，提示T-006的作用還可能與增強腦內(nèi)中樞膽堿能系統(tǒng)功能有關(guān)。

Fig 6　MDA levels in hippocampus and cortex(n=4)

Note see Fig 2.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsdonepezil group.

T-006是一種經(jīng)過篩選得到的具有開發(fā)價值的新型化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于多奈哌齊等傳統(tǒng)單靶點藥物，而是來源于多功能的中藥單體，故T-006應(yīng)具有多方面藥理活性。本研究首次發(fā)現(xiàn)，T-006具有多方面藥理作用，其增強學(xué)習(xí)記憶能力的機制可能與抑制乙酰膽堿酯酶合成，從而減少乙酰膽堿分解，提高腦內(nèi)乙酰膽堿水平有關(guān); 并且該化合物也可能通過抗氧化損傷作用，保護膽堿能神經(jīng)元，改善膽堿能系統(tǒng)功能，從而促進學(xué)習(xí)記憶能力。綜上所述，T-006是一種有前景的多靶點AD治療新藥，但仍需運用其它能夠多方面模擬AD病理特征的模型，如大鼠側(cè)腦室注射Aβ蛋白模型和APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，對其藥效進行進一步驗證并探究其深層次的機制。

(致謝：本實驗由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室陶亮課題組完成，受試藥T-006由暨南大學(xué)藥學(xué)院新藥研究所提供。實驗參與人員有：宋奇，吳韋黎，邵敏，張宇。)

參考文獻：

[1]Ikeda E, Shiba K, Mori H,et al.Reduction of vesicular acetylcholine transporter in beta-amyloid protein-induced rats with memory impairment[J].NuclMedCommun,2000,21(10) ：933-7.

[2]Hartman R E,Izumi Y,Bales K R,et al. Treatment with an amyloid-beta antibody ameliorates plaque load,learning deficits and hippocampal long-term potentation in a mouse model of Alzheimer′s disease[J].JNeurosci,2005,25(26)：6213-20.

[3]Van der Linden M. The myth of Alzheimer disease[J].RevMedSuisse,2013，9(371):244-5.

[4]Gackowski D, Rozalski R, Siomek A,et al.Oxidative stress and oxidative DNA damage is characteristic for mixed Alzheimer disease/vascular dementia[J].JNeuroSci,2008,266(1-2)：57-62.

[5]Chen H Y, Xu D P, Tan G L, et al.A potent multi-functional neuroprotective derivative of tetramethylpyrazine[J].JMolNeurosci,2015,56(4)：977-87.

[6]Chen Q, Prior M, Dargusch R,et al.A novel neurotrophic drug for cognitive enhancement and Alzheimer′s disease[J].PloSOne,2011,6(12): 27865.

[7]李愛萍，趙慧，李韶，等. 不同鼠種在 Morris 水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為中的種屬差異[J]. 中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2005，14(1): 29-31.

[7]Li A P,Zhao H,Li S,et al. Species differences of muridae in the learning and memory behavior in morris water maze[J].ChinJBehavMedSci，2005，14(1):29-31.

[8]張季，嚴(yán)春臨，張丹參，等. 大黃酚對鉛中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其機制研究[J]. 中國藥理學(xué)通報,2011,27(11)：1614-8.

[8]Zhang J,Yan C L,Zhang D S,et al.Effects of chrysophanol on learing and memory impairment induced by lead in mice and the study of its mechanisms[J].ChinPharmacolBull,2011,27(11)：1614-8.

[9]樸景華，蒲小平，馬建，等. 類葉升麻苷對東莨菪堿所致記憶獲得性障礙的改善作用[J]. 中國藥理學(xué)通報,2001,17(6)：625-7.

[9]Piao J H,Pu X P,Ma J, et al. Effects of acetoside on improving the ability of learning and memory in mice[J].ChinPharmacolBull,2001,17(6)：625-7.

[10]El-Sherbiny D A, Khalifa A E, Attia A S,Eldenshary Eel-D. Hypericum perforatum extract demonstrates antioxidant properties against elevated rat brain oxidative status induced by amnestic dose of scopolamine[J].PharmacolBiochemBehav,2003,76(3-4):523-33.

[11]Paamoni-Keren O, Silberstein T, Burg A, et al.Oxidative stress as determined by glutathione(GSH) concentrations in venous cord blood in elective cesarean delivery versus uncomplicated vaginal delivery[J].ArchGynecolObstet, 2007,276(1)：43-6.

[12]Zhang X J, Yang L, Zhao Q, et al.Induction of acetylcholinesterase expression during apoptosis in various cell types[J].CellDeathDiffer,2002,9(8)：790-800.

[13]Small D H, Michaelson S, Sberna G.Non-classical actions of cholinesterases：role in cellular differentiation, tumorigenesis and Alzheimer′s disease[J].NeurochemInt,1996,28(5-6)：453-83.

[14]Porter A C, Bymaster F P, DeLapp N W, et al.M1 muscarinic receptor signaling in mouse hippocampus and cortex[J].BrainRes,2002,944(1-2)：82-9.

Effects of new drug T-006 on improving learning and memory abilities in scopolamine-induced dementia Kunming mice

SONG Qi1，WANG Qin1，WU Wei-li1，SHAO Min1，ZHANG Yu1,ZHANG Zai-jun2，WANG Yu-qiang2，TAO Liang1

(1.DeptofPharmacology，ZhongshanSchoolofMedicine，SunYat-SenUniversity，Guangzhou510080，China；2.InstituteofNewDrugResearch，CollegeofPharmacy，JinanUniversity,Guangzhou510632，China)

Abstract:AimTo explore the effects of new drug T-006 on improving learning and memory abilities in scopolamine-induced dementia mice and its possible mechanism.Methods72 male Kunming mice were randomly divided into six groups: normal control group, model group, donepezil treatment group, T-006 treatment group with different doses(1, 3 and 10 mg·kg-1). All mice were treated by intragastric administration for 14 consecutive days. Learning and memory abilities were tested by a five-day Morris water maze trial from the 11th day. the first 4 days of the five-day Morris water maze, the navigation test was performed, the last day of Morris water maze is the spatial probe test.During the navigation test, mice were intraperitoneally given 2 mg·kg-1scopolamine 20 minutes before entering the water, while normal control group mice administrated with sterile saline instead. Mice were not given T-006 nor scopolamine in spatial probe test.After Morris water maze, all mice were sacrificed for hippocampus and cortex. The activities of AchE and SOD and the levels of GSH and MDA in hippocampus and cortex were measured after tissue harvesting.ResultsCompared with model group, T-006 could obviously improve learning and memory abilities in scopolamine-induced mice, significantly increase the levels of SOD and GSH and decrease the levels of MDA and AchE.ConclusionT-006 can significantly improve cognitive abilities in scopolamine-induced dementia mice, and its relevant mechanism may be closely related to its antioxidative effect and the ability to decrease AchE level.

Key words：T-006;scopolamine;Morris water maze; Kunming mice; hippocampus; cortex; learning and memory abilities

收稿日期:2016-02-01,修回日期:2016-03-15

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(No 81373439)；廣東省科技計劃項目(No 2014A020209032)；廣州市科技局科技攻關(guān)引導(dǎo)項目( No 201300000158)

作者簡介：宋奇(1991-)，男，碩士生，研究方向：細(xì)胞縫隙連接與疾病，E-mail:toyota87@163.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.015

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0812-06

中國圖書分類號：R-332；R322.81；R338.64；R745.7；R977.3

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.030.html

陶亮(1959-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：細(xì)胞縫隙連接與疾病，通訊作者，E-mail: taol@mail.sysu.edu.cn