張震，王學梅，徐克

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.超聲科；2.放射介入科，沈陽110001）

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LY294002聯(lián)合姜黃素對人腎癌細胞的體外抑制作用

張震1，王學梅1，徐克2

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.超聲科；2.放射介入科，沈陽110001）

摘要目的研究磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）特異性抑制劑LY294002與姜黃素聯(lián)合對人腎癌細胞的抑制作用。方法應用CCK-8法檢測姜黃素單獨或聯(lián)合LY294002對人腎癌細胞786-O的抑制率；TUNEL及免疫熒光法檢測caspase-3，觀察姜黃素單獨或聯(lián)合LY294002對786-O細胞凋亡的影響。結果LY294002聯(lián)合姜黃素能顯著增加姜黃素對786-O細胞的抑制率，同時顯著增強姜黃素對細胞凋亡的誘導作用（P＜0.05）。結論PI3K特異性抑制劑LY294002通過促進786-O細胞凋亡提高其對姜黃素的敏感性，抑制PI3K/Akt信號轉導通路的活性能夠提高姜黃素的腫瘤殺傷作用。

關鍵詞磷脂酰肌醇-3激酶；抑制劑LY294002；姜黃素

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磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidy1inosito1 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號傳導通路是腫瘤細胞生存的最重要通路，與腫瘤細胞的生存、增殖、轉移、蛋白合成以及放化療的耐受密切相關，在腎癌的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，PI3K抑制劑LY294002能夠增強抗腫瘤藥物的敏感性和療效，部分逆轉化療的耐藥性［1-3］，但僅少量文獻報道涉及了腎癌。姜黃素是一種具有很強還原作用的試劑，能夠增強多種化療藥物的抗癌活性和對腫瘤細胞的殺傷作用，但是LY294002聯(lián)合姜黃素對人腎癌細胞的作用尚未見報道。本研究通過探討LY294002聯(lián)合姜黃素對人腎癌細胞增殖抑制的影響，進一步探究其可能的作用機制，為治療提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞培養(yǎng)：786-O細胞系在含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、95%濕度、5%CO2孵箱中孵育。長到對數(shù)生長期時用于研究。

1.1.2實驗分組：分為4組，即對照組、姜黃素單獨用藥組（10、20和40 μmo1/L姜黃素）、LY294002單獨用藥組（20 nmo1/L LY294002）、聯(lián)合用藥組（10、20 和40 μmo1/L姜黃素+20 nmo1/L LY294002）。

1.2方法

1.2.1CCK-8法檢測786-O細胞抑制率：取對數(shù)生長期的786-O細胞，向96孔板各孔中加入100 μL細胞懸液，保證每孔的細胞數(shù)為5×103個。將細胞放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待細胞貼壁后按照分組進行處理。共同孵育時間為24和48 h。棄掉原有培養(yǎng)液，向每孔加100 μL的培養(yǎng)液及10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后用酶標儀檢測OD490處各孔吸光度（absorbance，A）。計算各組細胞增殖抑制率（%）= （1-A實驗組/A對照組）×100。

1.2.2TUNEL染色：TUNEL試劑盒用于細胞凋亡檢測。各組處理后的786-O細胞染色依據(jù)試劑盒說明書中的步驟進行，腫瘤細胞用羅丹明染色，2 h后洗脫并計數(shù)。凋亡細胞計數(shù)和分析，使用日本O1ympus IX71-A12FL/PH倒置顯微鏡照相。

1.2.3免疫熒光染色：使用直接免疫熒光法檢測caspase-3和PI3K-p110γ蛋白表達。786-O細胞根據(jù)分組加入LY294002和姜黃素進行單獨或聯(lián)合處理，與caspase-3和PI3K-p110γ抗體（1∶100）室溫孵育40 min，避光，使用1 μmo1/L DAPI染核。陽性染色細胞照相使用O1ympus IX71-A12FL/PH倒置熒光顯微鏡。

1.3統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用x±s表示，使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學t檢驗和單因素方差分析。所有實驗均獨立重復3次，每組6個復孔。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1姜黃素和LY294002對腫瘤細胞的細胞毒性作用

姜黃素單獨用藥組、LY294002單獨用藥組和聯(lián)合用藥組與對照組比較，786-O細胞的生長率顯著受到抑制，各組A值均有下降，且腫瘤細胞的活性隨著姜黃素濃度增加而降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組腫瘤細胞的活性較單獨用藥組下降幅度稍大，表明二者聯(lián)合的細胞毒性大于單獨應用姜黃素。見表1。

2.2姜黃素下調PI3K-p110γ的表達

應用LY294002（20 nmo1/L）完全抑制PI3K-p110γ的表達。應用不同濃度姜黃素作用后，隨著姜黃素濃度的增加，PI3K-p110γ的表達顯著下降（P＜0.05）。提示姜黃素對抗腫瘤的作用可能與PI3K/ Akt信號轉導通路的活性有關。見圖1。

2.3姜黃素和LY294002誘導腫瘤細胞凋亡

TUNEL染色結果顯示，姜黃素單獨用藥組或聯(lián)合用藥組均能誘導786-O細胞凋亡，且隨著姜黃素的濃度增加呈增強趨勢；聯(lián)合用藥組與姜黃素單獨用藥組比較，凋亡細胞數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫熒光染色顯示，786-O細胞內的凋亡相關蛋白caspase-3表達也顯著上調（P＜0.05），且隨著濃度的增加表達呈增強趨勢；聯(lián)合用藥組與姜黃素單獨用藥組比較，凋亡細胞數(shù)的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。這些結果表明，LY294002有增強姜黃素誘導細胞凋亡的作用。

表1　LY294002和姜黃素對786?O細胞的抑制作用（%）Tab.1 Inhibitory rate of LY294002 and curcumin to 786?O cells （%）

3　討論

姜黃素是從姜黃根莖中提取出的一類黃色酚類物質，是姜黃的主要有效成分之一，方便易得。姜黃素具有抗腫瘤作用，可以通過多種機制誘導腫瘤細胞凋亡，如抑制細胞內脂肪酸合酶［1］、通過誘導活性氧簇產生細胞遺傳毒性效應［2］。miR-21介導姜黃素增殖、凋亡、轉移、抗癌耐藥性等多種效應，可結合于miR-21的啟動子，通過PTEN/PI3K/Akt傳導通路和核因子κB基因傳導通路下調miR-21的表達來實現(xiàn)［3］。

PI3K信號參與增殖、分化、凋亡等多種細胞功能的調節(jié)。PI3K是由催化亞單位p110和調節(jié)亞單位p85組成的二聚體蛋白，具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性。PI3K可通過Ras和p110直接結合導致PI3K的活化。研究發(fā)現(xiàn)，敲除PI3K-p110γ能夠通過引起腫瘤細胞在G0～G1期細胞周期停滯抑制細胞增殖［4］。PI3K及其下游分子蛋白激酶B（PKB或Akt）組成的信號通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。在腫瘤切除術后，PI3K能夠通過抑制凋亡和產生并誘導對化療藥物的耐藥性加速腫瘤生長［5］。

聯(lián)合LY294002抑制PI3K信號通路后，姜黃素

圖1　不同濃度姜黃素對PI3K?p110γ表達的影響Fig.1 Effects of curcumin at different concentrations on the expressions of PI3K?p110γ

圖2　TUNEL染色和caspase?3免疫熒光染色檢測786?O細胞凋亡Fig.2 Apoptosis of 786?O studied by TUNEL staining and immunofluorescence of caspase?3

顯著抑制結腸癌細胞系的增殖、轉移、侵襲和克隆形成，并上調caspase-3的表達，具有劑量依賴性［6］。在前列腺癌中，隨姜黃素藥物濃度增加，姜黃素上調p53和第15位絲氨酸磷酸化的表達，明顯活化caspase-3誘導的細胞凋亡［7］，與我們在786-O細胞系中觀察到的結果一致。

本研究中，姜黃素與PI3K抑制劑LY294002聯(lián)合作用效果顯著強于姜黃素單獨作用，LY294002能夠增強姜黃素的細胞毒性作用，增強對786-O細胞凋亡的誘導作用，強化凋亡相關蛋白caspase-3的表達。綜上所述，姜黃素可能通過抑制PI3K/Akt相關通路的活化來產生誘導786-O細胞凋亡的作用。

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（編輯陳姜）

Inhibitory Effectof LY294002 Combinedwith Curcuminoninvitro Cultured Renal Carcinoma Cells

ZHANGZhen1，WANGXuemei1，XUKe2
（1. Department of U1trasound，The First Hospita1，China Medica1 University，Shenyang 110001，China；2. Department of Radio1ogy and Intervention，The First Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110001，China）

AbstractObjective To investigate the inhibitory effect of phosphatidy1cho1ine-3 kinase（PI3K）specific inhibitor，LY294002，combined with curcumin onin vitro cu1tured rena1 carcinoma ce11s. Methods Rena1 carcinoma ce11s were treatedwith PI3K specific inhibitor LY294002，curcumin a1one，or in combination. CCK-8 assay was used to measure the inhibitory rate. TUNEL staining and immunof1uorescence of caspase-3 were app1iedtoeva1uatetheapoptoticeffects.Results Inhibitoryrateof786-Oce11swassignificant1yincreasedunderthecombinationadministrationofcurcumin and LY294002，and the apoptosis were significant1y induced（P＜0.05）. Conclusion Sensitivity to curcumin of 786-O cou1d be increased by LY294002throughtheapoptosis-re1atedmechanisms，and inhibition of PI3K/Aktpathwaymightbere1atedwiththeactivationofanti-tumoreffect bycurcumin.

Keywordsphosphatidy1cho1ine-3 kinase；inhibitor LY294002；curcumin

中圖分類號R34

文獻標志碼A

文章編號0258-4646（2016）06-0491-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.003

基金項目：國家自然科學基金（81600020，81471809）；遼寧省科學技術計劃（2013225049）

作者簡介：張震（1975 -），女，副教授，博士.

通信作者：徐克，E-mai1：wangzy@mai1.cmu.edu.cn

收稿日期：2016-03-21