王艷實(shí)，吳瓊，王晨，趙云霞，武昕

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽(yáng)110001）

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Smad4和Ras在外陰鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

王艷實(shí)，吳瓊，王晨，趙云霞，武昕

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽(yáng)110001）

摘要目的探討Smad4和Ras在外陰鱗狀細(xì)胞癌（VSCC）中的表達(dá)情況，分析兩者與VSCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法采用免疫組化方法檢測(cè)Smad4和Ras在VSCC中的表達(dá)情況，并結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行分析。結(jié)果Smad4在VSCC的表達(dá)明顯低于正常外陰皮膚（P＜0.05），在VSCCⅢ期中表達(dá)明顯低于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05），中低分化的表達(dá)明顯低于高分化（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）。Ras蛋白在VSCC的表達(dá)明顯高于正常外陰皮膚（P＜0.05），在VSCCⅢ期中表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05），VSCC低、中分化以及高分化之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明：在VSCC中Smad4和Ras的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論Smad4的低表達(dá)及Ras的高表達(dá)可能與VSCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞外陰鱗狀細(xì)胞癌；Smad4；Ras；免疫組織化學(xué)

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外陰癌是女性生殖道惡性腫瘤之一，約占女性生殖道腫瘤的5%［1］，其5年生存率為58.9%～68.9%，病因尚未完全明確。

TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在維持上皮細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)時(shí)發(fā)揮重要作用。TGF-β1首先與TβRⅡ結(jié)合，使TβRⅠ及下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Smads發(fā)生磷酸化后，與Smad4形成三聚體并轉(zhuǎn)移至胞核，在細(xì)胞核內(nèi)通過與特異的DNA結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)［2］。Smad4是TGF-β/Smad信號(hào)通路中的關(guān)鍵性分子，在一些腫瘤中低表達(dá)。Ras是一種原癌基因，定位于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)表面上，可通過MEK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)Smad4的降解，抑制Smad2/3與Smad4復(fù)合物的形成，干擾TGF-β/Smad信號(hào)通路傳導(dǎo)，在一些腫瘤中高表達(dá)。在外陰鱗狀細(xì)胞癌（vu1ar squamous ce11 carcinoma，VSCC）中這2種基因蛋白的表達(dá)是否與外陰癌變有關(guān)尚待探討。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象：選取2004年至2014年于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的VSCC組織標(biāo)本25例（所有患者術(shù)前均未行放化療）及外陰整形術(shù)中去除的正常外陰皮膚組織15例。標(biāo)本制成石蠟塊，進(jìn)行HE染色后，由2位資深的病理醫(yī)師確認(rèn)。收集VSCC患者的臨床病理資料，年齡33～85歲，平均年齡（57.8±3.6）歲，按照2009年FIGO臨床分期分為Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ期6例；分化程度為高分化20例，中低分化5例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例。

1.1.2主要試劑：兔抗人Smad4單克隆抗體和鼠抗人Ras單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），SP免疫組化試劑盒和DAB染色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟水化。3%H2O2于室溫孵育20 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，再進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫下羊血清孵育20 min，滴加一抗Smad4（1∶200）及Ras（1∶20）于4℃冰箱過夜，生物素分別標(biāo)記山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG，室溫孵育15 min，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。利用顯微圖像分析系統(tǒng)Meta Morph （UIC/OLUMPUS.US/JP）進(jìn)行積分光密度值測(cè)定，每張切片高倍鏡下選取5個(gè)不同視野，每個(gè)視野正常皮膚包括表皮全層和部分真皮，癌組織包括癌巢和間質(zhì)，計(jì)算同一張切片的平均積分光密度值，其代表陽(yáng)性染色細(xì)胞在該組織中的表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1Smad4在正常外陰皮膚組織及VSCC中的表達(dá)情況

Smad4在正常外陰皮膚中表達(dá)于基底細(xì)胞和近基底細(xì)胞（圖1A），陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為0.280 5±0.008 4，在VSCC中Smad4表達(dá)于癌巢細(xì)胞質(zhì)，強(qiáng)弱不均（圖1B），表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為0.241 8±0.013 8，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2Ras在正常外陰皮膚組織及VSCC中的表達(dá)情況

Ras在正常外陰皮膚中陽(yáng)性細(xì)胞多位于表皮基底細(xì)胞層，表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)（圖2A），陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為0.038 7±0.006 4，在VSCC中Ras表達(dá)于癌巢細(xì)胞質(zhì)，間質(zhì)也有表達(dá)（圖2B），表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值為0.384 7±0.203 1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3Smad4和Ras表達(dá)相關(guān)性的分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：Smad4和Ras在VSCC中的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r =-0.521，P＜0.001），見圖3。

2.4Smad4和Ras的表達(dá)與VSCC臨床病理特征的關(guān)系

Smad4在Ⅰ～Ⅱ期VSCC組織中表達(dá)為0.258 5± 0.008 4，明顯高于Ⅲ期（0.225 2±0.008 7，P＜0.05），在高分化癌中為0.243 2±0.021 7，明顯高于中低分化（0.240 2±0.009 8，P＜0.05），在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中為0.264 0±0.008 6，明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（0.219 5±0.012 0，P＜0.05），見表2。Smad4的表達(dá)與年齡無關(guān)。

圖1　Smad4在正常外陰皮膚及VSCC中的表達(dá)SP×200Fig.1 Expression of Smad4 in normal vulvar tissues and VSCC SP×200

圖2　Ras在正常外陰皮膚及VSCC中的表達(dá)SP×200Fig.2 Expression of Ras in normal vulvar tissues and VSCC SP×200

表1　Smad4及RAS在正常外陰皮膚及VSCC的表達(dá)Tab.1 Expression of Smad4 and Ras in normal vulvar tissues and VSCC

圖3　Smad4和Ras蛋白表達(dá)量相關(guān)性分析Fig.3　Correlation analysis of expression levels of Smad4 and Ras proteins

Ras在Ⅲ期VSCC組織中表達(dá)為0.463 4±0.075 3，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（0.312 5±0.023 7，P＜0.05），在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中為0.471 8±0.130 2，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（0.337 9±0.076 4，P＜0.05），見表2。Ras的表達(dá)與分化程度、年齡無關(guān)。

3　討論

TGF-β/Smad信號(hào)通路是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中最常發(fā)生改變的信號(hào)通路之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等方面起重要作用。Smad4在TGF-β信號(hào)傳遞的過程中起到核心的作用，Smad4表達(dá)降低或功能缺陷可以使腫瘤細(xì)胞逃脫TGF-β的生長(zhǎng)抑制作用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和惡性轉(zhuǎn)化。Smad4是一種腫瘤抑癌基因，定位于人長(zhǎng)臂染色體18q21.1［3］，通過上調(diào)P27、Bim和Bad，抑制抗凋亡因子Bc1-w的活性及C-myc和Cyc1in D1的表達(dá)，阻礙細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c的釋放，加速線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖［4］。目前發(fā)現(xiàn)Smad4在一些癌中低表達(dá)，如大腸癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等［5-8］。本研究發(fā)現(xiàn)Smad4在VSCC中的表達(dá)顯著低于正常外陰皮膚，提示Smad4低表達(dá)與VSCC的發(fā)生有關(guān)。此外，張愛莉等［9］研究發(fā)現(xiàn)Smad4在腎癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織；在腎癌Ⅲ～Ⅳ期中表達(dá)明顯低于Ⅰ～Ⅱ期；中低分化的表達(dá)明顯低于高分化；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)明顯低于無淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。Leng等［10］研究報(bào)道在胃癌組織中分化程度越低，Smad4表達(dá)越少。Bian等［11］研究發(fā)現(xiàn)在肺腺癌中臨床分期越高，組織分化程度越低，且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，Smad4表達(dá)越少。A1azzouzi等［12］研究發(fā)現(xiàn)Smad4可以作為Dukes C期大腸癌的一種預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，并且Smad4高表達(dá)的患者總體生存率較高。本研究結(jié)果顯示，隨著臨床分期增加、分化程度降低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，Smad4表達(dá)降低，提示Smad4的低表達(dá)與VSCC的預(yù)后不良有關(guān)。

Ras是一類具有小GTP酶活性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在Ras-GTP/RAS-GDP 2種構(gòu)象間轉(zhuǎn)換，當(dāng)Ras與GTP結(jié)合時(shí)則處于激活狀態(tài)，而當(dāng)Ras與GDP結(jié)合時(shí)則處于失活狀態(tài)。一旦Ras處于激活狀態(tài)，它就能持續(xù)地刺激GTP水解酶的活性，使信號(hào)持續(xù)傳導(dǎo)，造成細(xì)胞生長(zhǎng)失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Ras蛋白主要通過RAF/MEK/ERK/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)cyc1in D1的表達(dá)，使細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)有絲分裂原和黏附信號(hào)的需求降低，G1期縮短，從而加速細(xì)胞的生長(zhǎng)［13］。RAS也可以通過抑制Smad2/3向核內(nèi)轉(zhuǎn)移和核內(nèi)的聚集，阻斷TGF-β/Smad信號(hào)通路傳導(dǎo)，抵抗TGF-β介導(dǎo)的抗增殖作用［14］。Ras還可以通過MEK/ ERK信號(hào)通路促進(jìn)Smad4的降解，抑制Smad2/3與Smad4復(fù)合物的形成，降低Smad4蛋白表達(dá)，阻止其核轉(zhuǎn)位，使細(xì)胞喪失對(duì)TGF-β的抑制作用［15］，由此打破Ras通路和Smad通路之間的平衡。最新研究［16］表明，在小鼠的胰腺中僅是Smad4的沉默并不會(huì)激發(fā)腫瘤的生成，而Smad4的缺失和K-ras的活化則會(huì)導(dǎo)致腫瘤迅速發(fā)生。這說明失活的Smad4能夠加速K-ras基因誘導(dǎo)胰腺癌的發(fā)生。同時(shí)，活化的K-ras和失活的Smad4能夠促進(jìn)胰腺導(dǎo)管癌的侵襲及轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步說明活化的K-ras和失活的Smad4協(xié)同作用的重要性［17］。本研究發(fā)現(xiàn)Ras在VSCC中表達(dá)高于正常皮膚，且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Smad4與Ras呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步提示兩者在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有協(xié)同作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Ras在VSCC中隨著臨床分期增加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)表達(dá)增加。Li等［18］研究發(fā)現(xiàn)Ras可以做為乳腺癌的一種預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，在Ⅲ期乳腺癌患者中Ras的表達(dá)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期。曹壘等［19］研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Ras蛋白著色程度隨腫瘤分期增高呈上升趨勢(shì)，在Ⅲ～Ⅳ期膠質(zhì)瘤顯著高于Ⅱ期膠質(zhì)瘤。Li等［20］研究發(fā)現(xiàn)Ras在浸潤(rùn)式生長(zhǎng)的胃癌組織高于膨脹式生長(zhǎng)，且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，Ras表達(dá)越高。本研究結(jié)果與之相似，提示Ras高表達(dá)與VSCC的預(yù)后不良有關(guān)。

表2　Smad4和Ras的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 The relationship of Smad4 and Ras expression with clinicopathological features of VSCC

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（編輯于溪）

Expressionsof Smad4and Rasin Vulvar Squamous Cell Carcinomaand the Clinical Significance

WANGYanshi，WUQiong，WANGChen，ZHAOYunxia，WUXin
（Department of Gyneco1ogy，The First Hospita1，China Medica1 University，Shenyang110001，China）

AbstractObjective To investigate the expression of Smad4 and Ras in vu1var squamous ce11 carcinoma（VSCC），and exp1ore their association with deve1opment of disease.Methods Immunohistochemica1 staining was conducted to detect the expression of Smad4 and Ras in VSCC. Then the re1ationship between the expression of Smad4，Ras protein and c1inica1 and patho1ogica1 data of patients with VSCC were ana1yzed. Results The expression of Smad4 in VSCC was significant1y 1ower than norma1 vu1va skin tissue（P ＜ 0.05）. Smad4 expression in VSCC tissue of stage Ⅲ was significant1y 1ower than that of stage Ⅰ-Ⅱ（P ＜ 0.05）. The expression of Smad4 in the moderate1y and poor1y differentiated VSCC was 1ower than those we11differentiatedVSCC（P ＜0.05）.Theexpression of Smad4in cases with 1ymphnodemetastasiswas1owerthanthosewithout1ymphnodemetastasis（ P ＜ 0.05）. The expression of Ras in VSCC was significant1y higher than norma1 vu1va skin tissue and the difference was statistica11y significant （P ＜ 0.05）. The expression of Ras was higher in Ⅲ stage than in Ⅰ-Ⅱ stage（P ＜ 0.05）. The expression of Ras in cases with 1ymph node metastasis was higher than those without 1ymph node metastasis（P ＜ 0.05）. Ras expression had no statistica11y significant difference between the poor1y and moderate1y differentiated VSCC and the high1y differentiatedones（P ＞0.05）.The Spearmancorre1ationana1ysisshowed that Smad4 and Rasexpression was negative1y corre1ated in vu1va squamous ce11 carcinoma. Conclusion The expression of Smad4 and Ras was associated with occurrence and deve1opment of the VSCC.

Keywordsvu1var squamous ce11 carcinoma；Smad4；Ras；immunohistochemistry

中圖分類號(hào)R737.35

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)0258-4646（2016）06-0506-04

DOI：10.12007/j.issn.0258-4646.2016.06.007

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（30973190）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2014021057）

作者簡(jiǎn)介：王艷實(shí)（1990 -），女，碩士研究生.

通信作者：武昕，E-mai1：xinwu.1964@a1iyun.com

收稿日期：2015-09-28