沈曉麗　周靜　王永華　王一鳴　顧偉忠寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院（寧波500）浙江中醫(yī)藥大學(xué)（浙江005）浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院（浙江000）

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川芎嗪對慶大霉素耳聾豚鼠SOD同工酶蛋白表達(dá)的調(diào)控

沈曉麗1周靜1王永華2王一鳴2顧偉忠3
1寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院（寧波315100）2浙江中醫(yī)藥大學(xué)（浙江310053）3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院（浙江310003）

【摘要】目的研究川芎嗪（tetraethylplyrazine，TMP）對慶大霉素（Gentamycin，GM）耳蝸毒性的抗氧化作用并探討該機(jī)制與銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxide dismutase，Cu/Zn SOD或SOD1）、錳超氧化物歧化酶（Mn-superox?ide dismutase，Mn SOD或SOD2）及細(xì)胞外超氧化物歧化酶（ECSOD或SOD3）蛋白表達(dá)的關(guān)系。方法將60只聽力正常成年豚鼠隨機(jī)分為4組，即GM組、TMP組、GM+TMP組、對照組。GM組（15只）肌注硫酸慶大霉素120mg·kg-1·d-1，連續(xù)12天；TMP組（15只）腹腔注射鹽酸川芎嗪30mg·kg-1·d-1，連續(xù)12天；GM+TMP組（15只）肌注硫酸慶大霉素120 mg·kg-1·d-1及腹腔注射鹽酸川芎嗪30mg·kg-1·d-1，連續(xù)12天；對照組（15只）腹腔注射與GM組等量的生理鹽水2.5ml·kg-1·d-1，連續(xù)12天。每組豚鼠首次用藥前及末次用藥后第一天均行ABR檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將豚鼠斷頭處死并取耳蝸標(biāo)本，免疫組化法對其細(xì)胞內(nèi)SOD1、SOD2、SOD3蛋白表達(dá)進(jìn)行定位研究。結(jié)果用藥后GM組聽力閾值明顯升高，與正常組、GM+TMP組比較有明顯差異（P＜0.01），正常對照組與TMP組聽力閾值用藥前后相比無顯著性差異（P＞0.05）。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)處模型組和拮抗組SOD1、SOD2、SOD3陽性蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），毛細(xì)胞處拮抗組SOD1、SOD2陽性蛋白表達(dá)較模型組明顯（P＜0.05），SOD3陽性蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論慶大霉素具有耳毒性，可導(dǎo)致豚鼠耳蝸毛細(xì)胞損傷，川芎嗪可通過對毛細(xì)胞處SOD1、SOD2的蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制來實(shí)現(xiàn)抗氧化防護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】慶大霉素；川芎嗪；耳毒性；抗氧化；SOD1；SOD2；SOD3

氨基糖甙類抗生素（Aminoglycoside Antibiotics，AmAn）是臨床上治療革蘭陰性桿菌感染的重要藥物。但其致命的弱點(diǎn)是會(huì)造成耳蝸感音結(jié)構(gòu)及螺旋神經(jīng)節(jié)損傷而引起聽覺障礙，其中以慶大霉素（Genta?mycin，GM）引起的耳聾發(fā)生率最高，主要表現(xiàn)為聽覺系統(tǒng)的慢性中毒，導(dǎo)致耳蝸及前庭毛細(xì)胞死亡［1］。

川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是川芎的重要成分，屬酰氨類生物堿，具有強(qiáng)心、降低血壓、抗氧自由基和抑制血小板聚集、抗組織纖維化等作用，有實(shí)驗(yàn)研究表明［2，3］，TMP也可有效減輕GM耳毒性損傷，且與TMP具有抗氧化作用有關(guān)，但尚不明確其確切的抗氧化機(jī)制。超氧化物歧化酶（superoxide dis?mutase，SOD）是機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線［4］，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有三種同工酶，分別是位于胞漿的銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD或SOD1）、位于線粒體的錳超氧化物歧化酶（MnSOD或SOD2）和分泌到細(xì)胞外的細(xì)胞外超氧化物歧化酶（ECSOD或SOD3），基本功能分別是降低細(xì)胞內(nèi)的O2-濃度、清除由呼吸鏈相關(guān)反應(yīng)產(chǎn)生的O2-和胞外環(huán)境的主要抗氧化酶。本研究前期［5］已表明慶大霉素作用于豚鼠，引起耳毒性的發(fā)生與血清中SOD活性的降低具有相關(guān)性，川芎嗪的作用可使SOD活性升高從而減輕內(nèi)耳的損傷，但目前尚不明確該機(jī)制與SOD1、SOD2、SOD3蛋白表達(dá)的關(guān)系。

本研究在建立慶大霉素引發(fā)豚鼠內(nèi)耳損傷模型的基礎(chǔ)上，觀察川芎嗪對慶大霉素耳毒性作用的抗氧化機(jī)制，并初步探討該機(jī)制與SOD1、SOD2和SOD3在耳蝸內(nèi)蛋白表達(dá)的關(guān)系，試圖為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年健康豚鼠60只，雌雄不拘，體重290～350g，均經(jīng)電耳鏡檢查排除外耳道炎及中耳炎，耳廓反射靈敏。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK（浙）2008-0037，標(biāo)準(zhǔn)飼料養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

主要試劑：硫酸慶大霉素注射劑（8萬單位/支，20111215，浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司）；注射用鹽酸川芎嗪（40mg/支，110505A2，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司）；免疫組化檢測試劑盒EnVisionTM Two-Step （1701777A，丹麥DAKO公司）；SOD1 antibody （abl6831，abcam公司）；SOD2 antibody（abl16956，ab?cam公司）；SOD3 antibody（abl80946，abcam公司）。

主要儀器：ZEP腦干誘發(fā)電位儀（北京中科電氣高技術(shù)公司）；MICROM HM340E石蠟切片機(jī)（德國MICROM公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

60只豚鼠適應(yīng)性分籠飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組，即GM組、TMP組、GM+TMP組、對照組。GM組（15只）肌注硫酸慶大霉素120mg·kg-1·d-1，連續(xù)12天；TMP組（15只）腹腔注射鹽酸川芎嗪30mg·kg-1· d-1，連續(xù)12天；GM+TMP組（15只）肌注硫酸慶大霉素120mg·kg-1·d-1及腹腔注射鹽酸川芎嗪30mg· kg-1·d-1，連續(xù)12天；對照組（15只）腹腔注射與GM組等量的生理鹽水2.5ml·kg-1·d-1，連續(xù)12天。每組豚鼠首次用藥前及末次用藥后第一天檢測ABR閾值，末次檢測完畢后，斷頭處死豚鼠并取耳蝸標(biāo)本，制備耳蝸組織石蠟切片，免疫組化法測其蛋白表達(dá)。整個(gè)過程中避免接觸噪聲，每天測量體重以調(diào)整藥量并嚴(yán)密觀察豚鼠的毛發(fā)及精神狀況等變化。

1.2.2聽性腦干誘發(fā)電位反應(yīng)（ABR）測試

動(dòng)物用1%戊巴比妥鈉40mg·kg-1腹腔注射麻醉后，在隔音的電屏蔽室內(nèi)用ZEP誘發(fā)電位儀進(jìn)行ABR測試。將記錄電極置雙耳廓上緣連線中點(diǎn)之顱頂正中，參考電極放置于給聲耳的耳后皮下，接地電極放置在對側(cè)耳的耳后皮下。刺激聲為交替短聲（click），帶通濾波100～3000Hz，TDH-39型耳機(jī)輸出，耳機(jī)距離豚鼠外耳道口約0.5cm，刺激聲重復(fù)率為10次/秒，疊加512次，掃描時(shí)程10ms。測試強(qiáng)度由110dB SPL開始，按10dB遞減，接近閾值時(shí)按5dB逐檔遞減，聽閾確定以測定以Ⅲ波為基準(zhǔn)。ABR閾值檢測于每組豚鼠首次用藥前及末次用藥后第一天進(jìn)行。

1.2.3耳蝸組織石蠟切片

ABR檢測結(jié)束后，將豚鼠立即斷頭處死，迅速取出雙側(cè)聽泡，打開聽泡即可見耳蝸，用尖針在蝸尖鉆孔，沿圓窗剪開其下緣骨壁，再將蹬骨輕輕推入卵圓窗，從蝸尖注入10%福爾馬林固定液，看到固定液從圓窗和卵圓窗流出后，將標(biāo)本置于該固定液中，4℃固定24h以上，脫鈣4周，常規(guī)石蠟包埋，平行于蝸軸方向連續(xù)切片，片厚5μm，烘干，室溫儲(chǔ)藏備用。

1.2.4免疫組化方法檢測耳蝸組織中SOD1、SOD2、SOD3表達(dá)

具體操作步驟參照免疫組化SABC法完成，一抗SOD1、SOD2和SOD3工作濃度參照試劑盒，設(shè)置陰性對照（以PBS液代替一抗，其他步驟相同），用DAB進(jìn)行呈色，常規(guī)脫水，透明，封片。每個(gè)耳蝸在光學(xué)顯微鏡200倍視野下分別選擇確定3-5個(gè)視野并拍照（在同等條件下選擇耳蝸的中回進(jìn)行觀察），對視野內(nèi)陽性的毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞采用im?age-plus 5.0圖像分析軟件進(jìn)行IOD值測量。淡黃色作為陽性表達(dá)，在螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，毛細(xì)胞和側(cè)壁的血管紋細(xì)胞胞漿上均可見表達(dá)，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，ABR反應(yīng)閾行自身前后對照比較應(yīng)用配對t檢驗(yàn)；組間比較采用單因素ANOVA分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ABR閾值檢測結(jié)果

各組豚鼠用藥前后ABR閾值結(jié)果如表1所示，用藥前各組豚鼠正常ABR閾值大小與文獻(xiàn)（使用ZEP誘發(fā)電位儀測試）報(bào)道基本一致［6］。用藥12天后GM+TMP組與GM組比較有明顯差異（P＜0.01），聽力閾值雖然也有升高，但較GM組明顯降低。

表1　用藥前后各組豚鼠ABR閾值比較（dB SPL±s）Table 1 Comparison of ABR threshold of each group before and after treatment（dB SPL±s）

表1　用藥前后各組豚鼠ABR閾值比較（dB SPL±s）Table 1 Comparison of ABR threshold of each group before and after treatment（dB SPL±s）

Note：Compared with the same group before treatment，▲▲P＜0.01；after treatment，compared with the normal control group，□□P＜0.01；compared with the GM group，**P＜0.01.

Group ABR threshold before　after normal control group GM group GM+TMP group TMP group 51.50±3.75 52.14±3.17 52.32±2.88 51.50±3.51 53.00±5.51 107.86±25.98▲▲△△86.25±15.91▲▲△△**50.83±4.17

2.2免疫組化檢測結(jié)果

2.2.1各組豚鼠耳蝸SOD1表達(dá)變化的影響

四組豚鼠耳蝸SOD1陽性反應(yīng)的表達(dá)IOD值結(jié)果如表2所示，在毛細(xì)胞處：與正常組比較，GM+TMP 組SOD1陽性細(xì)胞表達(dá)IOD值明顯上調(diào)（P＜0.05）；與GM組比較，GM+TMP組SOD1陽性細(xì)胞表達(dá)IOD值較高，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中GM組、TMP組與正常對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各實(shí)驗(yàn)組在毛細(xì)胞處SOD1陽性細(xì)胞表達(dá)情況見圖1。在螺旋神經(jīng)節(jié)（SGC）部位：GM組、GM+TMP組及正常組SOD1陽性細(xì)胞表達(dá)IOD值均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各實(shí)驗(yàn)組在SGC部位SOD1陽性細(xì)胞表達(dá)情況見圖4。

表2　各組耳蝸切片毛細(xì)胞處、螺旋神經(jīng)節(jié)（SGC）SOD1表達(dá)（IOD）±s）Table 2 expressions of SOD1 on hair cell and spiral ganglion cell in each group（IOD）±s）

表2　各組耳蝸切片毛細(xì)胞處、螺旋神經(jīng)節(jié)（SGC）SOD1表達(dá)（IOD）±s）Table 2 expressions of SOD1 on hair cell and spiral ganglion cell in each group（IOD）±s）

Note：Compared with the normal control group，□P＜0.05；compared with GM group，*P＜0.05.

Group normal control group GM group GM+TMP group TMP group IOD Hair cell　SGC 18.19±4.07 19.84±3.65 28.34±2.60△*17.82±2.84 9.49±2.70 11.02±4.53 10.44±3.06 6.71±1.58*

2.2.2各組豚鼠耳蝸SOD2表達(dá)變化的影響

四組豚鼠耳蝸SOD2陽性反應(yīng)的表達(dá)IOD值結(jié)果如表3所示，在毛細(xì)胞處：GM+TMP組SOD2陽性細(xì)胞表達(dá)IOD值明顯上調(diào)，與正常組、GM組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其中GM組、TMP組與正常對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各實(shí)驗(yàn)組在毛細(xì)胞處SOD2陽性細(xì)胞表達(dá)情況見圖2。在SGC部位：GM組、GM+TMP組SOD2陽性細(xì)胞表達(dá)IOD值明顯上調(diào)，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其中GM+TMP組與GM組比較，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各實(shí)驗(yàn)組在SGC部位SOD2陽性細(xì)胞表達(dá)情況見圖5。

2.2.3各組豚鼠耳蝸SOD3表達(dá)變化的影響

四組豚鼠耳蝸SOD3陽性反應(yīng)的表達(dá)IOD值結(jié)果如表4所示，在毛細(xì)胞處：GM組、GM+TMP組SOD3陽性細(xì)胞表達(dá)IOD值與正常組比較無明顯上調(diào)（P＞0.05）。各實(shí)驗(yàn)組在毛細(xì)胞處SOD3陽性細(xì)胞表達(dá)情況見圖3。在SGC部位：GM組、GM+TMP組、正常組、TMP組四組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各實(shí)驗(yàn)組在SGC部位SOD3陽性細(xì)胞表達(dá)情況見圖6。

表3　各組耳蝸切片毛細(xì)胞處、螺旋神經(jīng)節(jié)（SGC）SOD2表達(dá)（IOD）±s）Table 3 expressions of SOD2 on hair cell and spiral ganglion cell in each group（IOD）±s）

表3　各組耳蝸切片毛細(xì)胞處、螺旋神經(jīng)節(jié)（SGC）SOD2表達(dá)（IOD）±s）Table 3 expressions of SOD2 on hair cell and spiral ganglion cell in each group（IOD）±s）

Note：Compared with the normal control group，△P＜0.05；compared with GM group，*P＜0.05.

Group IOD Haircell　SGC normal control group GM group GM+TMP group TMP group 10.42±1.34 10.19±1.82 18.31±3.01△*11.30±2.11 12.37±2.05 19.51±5.69△20.44±4.86△15.46±3.20

表4　各組耳蝸切片毛細(xì)胞處、螺旋神經(jīng)節(jié)（SGC）SOD3表達(dá)（IOD）±s）Table 4 expressions of SOD3 on hair cell and spiral ganglion cell in each group（IOD）±s）

表4　各組耳蝸切片毛細(xì)胞處、螺旋神經(jīng)節(jié)（SGC）SOD3表達(dá)（IOD）±s）Table 4 expressions of SOD3 on hair cell and spiral ganglion cell in each group（IOD）±s）

Note：Compared with GM group，*P＜0.05.

Group normal control group GM group GM+TMP group TMP group IOD Hair cell　SGC 9.95±2.96 11.84±4.02 11.35±1.72 6.94±1.27*5.52±1.61 5.85±0.84 11.35±1.72 5.34±0.75

3　討論

氨基糖苷類抗生素通過導(dǎo)致耳蝸細(xì)胞內(nèi)氧自由基的過量生成［7］，引起線粒體膜性物質(zhì)損傷，線粒體功能障礙又進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)耳大量氧自由基蓄積和抗氧化酶過度消耗，誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡或死亡，最終引起耳聾。從本研究ABR測試結(jié)果來看，GM組、GM+TMP組與正常對照組相比較，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，GM組、GM+TMP組ABR閾值升高，驗(yàn)證了本次造模成功。而GM+TMP組聽力閾值雖然也有升高，但較GM組明顯降低（P＜0.01），TMP組聽力閾值用藥前后無改變，表明川芎嗪對正常豚鼠耳蝸聽閾無影響，但可使慶大霉素耳中毒豚鼠ABR閾值明顯降低，顯示川芎嗪能顯著降低慶大霉素耳毒性損傷而使聽力得以改善，該結(jié)果可能與SOD是抗氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵酶類之一有關(guān)。

SOD是機(jī)體抵抗自由基損害的第一道防線，能催化過氧化物陰離子自由基O2-形成O2及H2O2，H2O2又在抗壞血酸和過氧化氫酶的作用下生成O2及H2O，從而保護(hù)機(jī)體免受超氧陰離子的損害，使超氧陰離子自由基的產(chǎn)生和消除維持在一個(gè)平衡狀態(tài)。目前已知的哺乳動(dòng)物體內(nèi)SOD有三種同工酶，即SOD1、SOD2和SOD3。SOD3本質(zhì)上也是一種SOD2，是1982年Marklund等人首先在動(dòng)物血漿中發(fā)現(xiàn)的。已有研究發(fā)現(xiàn)在耳蝸中也有SOD1和SOD2的分布［8］。本研究采用免疫組化法進(jìn)行定位研究，對SOD同工酶在豚鼠耳蝸組織螺旋神經(jīng)節(jié)、毛細(xì)胞等部位的陽性表達(dá)進(jìn)行了檢測，除了發(fā)現(xiàn)有SOD1，SOD2的表達(dá)，還檢測到了SOD3的蛋白表達(dá)，三種同工酶在不同的組織及不同的疾病狀態(tài)下存在著活性及表達(dá)差異，在機(jī)體中發(fā)揮著獨(dú)立作用［9］。在螺旋神經(jīng)節(jié)處，GM組與GM+TMP組間三種超氧化物歧化酶同工酶陽性表達(dá)無顯著差異，但在毛細(xì)胞處，GM+TMP組較GM組SOD1及SOD2陽性細(xì)胞表達(dá)IOD值明顯上調(diào)，推測毛細(xì)胞是SOD1、SOD2蛋白表達(dá)水平變化的重要部位，而SOD3是胞外環(huán)境的抗氧化酶，主要分泌到細(xì)胞外，故未見SOD3蛋白表達(dá)在螺旋神經(jīng)節(jié)及毛細(xì)胞處的明顯變化。SOD同工酶在內(nèi)耳不同部位表達(dá)出現(xiàn)差異的原因，推測可能與不同內(nèi)耳組織所在的內(nèi)環(huán)境、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異和各自的功能不同引起生理生化條件不同有關(guān)。毛細(xì)胞處GM+TMP組較GM組SOD1及SOD2陽性細(xì)胞表達(dá)IOD值升高，推測川芎嗪可能主要通過作用于耳蝸毛細(xì)胞引起SOD1，SOD2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，高表達(dá)的SOD1、SOD2可清除早期產(chǎn)生的大量O2-，從而保護(hù)細(xì)胞，因此川芎嗪對耳蝸細(xì)胞起到了保護(hù)作用。

綜上所述，作為抗氧化劑，川芎嗪可通過毛細(xì)胞處SOD1、SOD2的蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制來拮抗慶大霉素耳中毒的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)抗氧化防護(hù)作用，但由于內(nèi)耳毛細(xì)胞及聽神經(jīng)復(fù)雜的氧化機(jī)制，川芎嗪對慶大霉素耳毒性作用的抗氧化機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

圖1　a-d光學(xué)顯微鏡200倍視野下各組耳蝸切片（中回）毛細(xì)胞處SOD1陽性細(xì)胞表達(dá)（1a、1b、1c、1d分別為GM組、GM+ TMP組、TMP組、正常對照組）Fig.1a-d Optical microscopic observation with magnification 200x shows the SOD1 expressing on hair cells in each cochlear slices group（middle area）（a1：GM group，a2：GM+TMP group，a3：TMP group，a4：normal control group）

圖2　a-d光學(xué)顯微鏡200倍視野下各組耳蝸切片（中回）毛細(xì)胞處SOD2陽性細(xì)胞表達(dá)（2a、2b、2c、2d分別為GM組、GM+ TMP組、TMP組、正常對照組）Fig.2a-d Optical microscopic observation with magnification 200x shows the SOD2 expressing on hair cells in each cochlear slices group（middle area）（2a：GM group，2b：GM+TMP group，b3：TMP group，b4：normal control group）

圖3　a-d光學(xué)顯微鏡200倍視野下各組耳蝸切片（中回）毛細(xì)胞處SOD3陽性細(xì)胞表達(dá)（3a、3b、3c、3d分別為GM組、GM+ TMP組、TMP組、正常對照組）Fig.3a-d Optical microscopic observation with magnification 200x shows the SOD3 expressing on hair cells in each cochlear slices group（middle area）（3a：GM group，3b：GM + TMP group，3c：TMP group，3d：normal control group）

圖4　光學(xué)顯微鏡200倍視野下各組耳蝸切片（中回）螺旋神經(jīng)節(jié)處SOD1陽性細(xì)胞表達(dá)（4a、4b、4c、4d分別為GM組、GM+ TMP組、TMP組、正常對照組）Fig.4 Optical microscopic observation with magnification 200x shows the SOD1 expressing on spiral ganglion cells in each cochlear slices group（middle area）（4a：GM group，4b：GM+TMP group，4c：TMP group，4d：normal control group）

圖5　光學(xué)顯微鏡200倍視野下各組耳蝸切片（中回）螺旋神經(jīng)節(jié)處SOD2陽性細(xì)胞表達(dá)（5a、5b、5c、5d分別為GM組、GM+ TMP組、TMP組、正常對照組）Fig.5 Optical microscopic observation with magnification 200x shows the SOD2 expressing on spiral ganglion cells in each cochlear slices group（middle area）（5a：GM group，5b：GM+TMP group，5c：TMP group，5d：normal control group）

圖6　光學(xué)顯微鏡200倍視野下各組耳蝸切片（中回）螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞處SOD3陽性細(xì)胞表達(dá)（6a、6b、6c、6d分別為GM組、GM+TMP組、TMP組、正常對照組）Fig.6a-d Optical microscopic observation with magnification 200x shows the SOD3 expressing on spiral ganglion cells in each cochlear slices group（middle area）（6a：GM group，6b：GM+TMP group，6c：TMP group，6d：normal control group）

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·綜述·

Effects of TMPon Expression of SOD1，SOD2 and SOD3 in Cochlea of Guinea Pigs with Gentamycin-Induced Hearing Loss

SHEN Xiaoli，ZHOU Jing，WANG Yonghua，WANG Yiming，GU Weizhong
1Ningbo College of Health Sciences 315100 2Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine 310053 3 Children’s Hospital，Zhejiang University School of Medicine Corresponding author：SHEN XiaoliEmail：shenxiaoli515@126.com

【Abstract】Objective To study the anti-oxidant effects of tetraethylplyrazine（TMP）on cochlea hair cells and spiral ganglion cells damaged by gentamycin（GM）and the relations between such effects and the expression level and activity of Cu/Zn superoxide dismutase（Cu/Zn SOD or SOD1），Mn-superoxide dismutase（Mn SOD or SOD2）and ECSOD （SOD3）.Methods Sixty healthy guinea pigs were randomly divided into a model group（GM group），a GM+TMP treatment group，a TMP treatment group and a normal control group（n=15 in each group）.Animals in the GM group were injected with Gentamycin sulfate at 120 mg/kg/d；those in the TMP group were injected with TMP at 30 mg/kg/d；those in the GM+TMP group were injected with Gentamycin sulfate and TMP with the same dosages；and those in the normal control group were injected with saline at 2.5 ml/kg/d.All animals were injected for 12 consecutive days.Before injection and one day after the last injection，ABR thresholds were measured in all groups.At the end of the experiment，guinea pigs were sacrificed and immuno-histochemical methods were used to determine the level of SOD1，SOD2 and SOD3 protein expression in cochlear tissues.Results After treatment，ABR thresholds in the GM group were significantly high-er than the GM+TMP and normal control groups（P＜0.01），while ABR thresholds in the TMP and normal control groups did not change significantly from before treatment（P＞0.05）.There were no significant differences in the expression of SOD1，SOD2 or SOD3 in spiral ganglion cells when the GM and GM+TMP groups were compared（P＞0.05），but the expression of SOD1 and SOD2 in hair cells was different between the two groups（P＜0.05），although SOD3 expression in hair cells was not significantly different between the two groups（P＞0.05）.Conclusions GM is ototoxic and causes cochlea hair cell damage.TMP plays an anti-oxidant role through regulation of SOD1，SOD2 expression in hair cells.

【Keywords】GM；TMP；ototoxicity；anti-oxidant；SOD1；SOD2；SOD3

【中圖分類號】r917.795

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）03-408-6

DOI：10.3969 / j.issn.1672-2922.2016.03.020

作者簡介：沈曉麗，碩士，助教，研究方向：耳聾康復(fù)研究

通訊作者：沈曉麗，Email：shenxiaoli515@126.com

收稿日期：（2016-01-12審核人：翟所強(qiáng)）