王學(xué)穎，徐世宏，劉清華，李　軍

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滲透壓、pH、葡萄糖及離子溶液對夏牙鲆精子激活及運(yùn)動特征的影響

王學(xué)穎1，2，徐世宏1，劉清華1，李軍1

（1.中國科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

摘要：作者通過滲透壓計分別測定各溶液的滲透壓值，通過CASA精子分析系統(tǒng)，測定精子運(yùn)動參數(shù)，分析、比較了滲透壓、pH、葡萄糖及離子溶液對夏牙鲆（Paralichthys dentatus）精子激活及運(yùn)動特征的影響。結(jié)果表明： 夏牙鲆精子激活的滲透壓范圍為581～1260 mosm/kg； 在特定的滲透壓范圍內(nèi)（單位為mosm/kg），A組（581～650），B組（762～877），C組（931～1060），D組（1117～1260）中，與NaCl和KCl溶液相比較，葡萄糖溶液可以顯著提高夏牙鲆精子激活后的運(yùn)動率； 在相對高滲條件下（1091～1180），經(jīng)CaCl2400、EGTA400和無Ca2+人工海水激活的夏牙鲆精子運(yùn)動率存在顯著差異； 且夏牙鲆精子最適的激活pH范圍是7～7.5。綜上，激活劑的滲透壓決定了夏牙鲆精子能否激活并顯著影響了激活后精子的運(yùn)動率，同時葡萄糖、外源Ca2+及pH均在一定程度上影響了精子的運(yùn)動率。

關(guān)鍵詞：夏牙鲆（Paralichthys dentatus）； 精子； 滲透壓； pH； 運(yùn)動率

［Foundation： National Natural Science Foundation（No.31572602，No.31472264）； Modern Agro-industry Technology Research System（No.nycytx-50）； Marine Economy Innovative Development Project（No.12PYY001SF08）； The Innovation Key Program of the Chinese Academy of Sciences（No.KSCX2-EW-B-3）； Chinese Academy of Science and Technology Service Network Planning（No.KFJ-EW-STS-060）； National Infrastructure of Fishery Germplasm Resource ］

夏牙鲆（Paralichthys dentatus）隸屬于硬骨魚綱（Osteichthys）、鰈形目（Peuronetiformes）、鰈亞目（Plenronectoides）、鲆科（Bothidae）、牙鲆亞科（Paralichthyinae）、牙鲆屬（Paralichthys），學(xué)名大西洋牙鲆，犬齒牙鲆。主要分布于北美洲大西洋沿岸，因其肉質(zhì)細(xì)嫩，營養(yǎng)豐富，生長快，且耐高溫，所以具有較高的經(jīng)濟(jì)價值［1］。

魚類精子的活力不僅與自身質(zhì)量有關(guān)，而且與滲透壓、pH及離子等環(huán)境因子密切相關(guān)［2-6］。體外受精的魚類，精子在精漿中（等壓等滲條件）是靜止不動的。在淡水魚類中，淡水（相對低滲）可使精子激活，如斑馬魚（Danio rerio）［2］和瑪瑙石脂鯉（Brycon opalinus）［3］等，而在海水魚類中，海水（相對高滲）才能使精子激活。鯛科（Sparidae）魚類中的研究表明，水通道蛋白在滲透壓啟動精子激活過程中起到了重要作用［4］。此外，在鮭科（Salmonidae）魚類及鱘科（Acipenseridae）魚類中［5-6］，K+在精子激活過程中起到了關(guān)鍵作用，精漿中高濃度的 K+抑制精子的運(yùn)動，環(huán)境中 K+濃度的降低使 K+通過特定的膜通道外流，引起細(xì)胞膜超極化，從而使精子激活。有關(guān)鯡魚（Clupeidae）的研究則發(fā)現(xiàn)，其精子的激活呈現(xiàn)趨化性，需要卵釋放一種精子激活多肽（HSAPS）［7］。有關(guān)精子激活的研究，在人、鼠等哺乳動物中相對較多，且較成熟，繼通過膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)精子激活時內(nèi)部的鈣電流直觀表現(xiàn)之后，又發(fā)現(xiàn)了Catsper這一特有的精子鈣通道［8］，且在近兩年相繼證明了該通道在介導(dǎo)孕酮信號受精時的巨大作用［9-10］。在歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）上的最新研究表明［11］，精子激活后，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+和K+濃度升高，而細(xì)胞內(nèi)pH逐漸降低。但是關(guān)于海水鲆鰈魚類的精子激活相關(guān)研究卻鮮有報道。

本試驗(yàn)擬通過研究滲透壓、pH、葡萄糖及離子溶液等環(huán)境因子對夏牙鲆精子活力的影響，初步闡明影響鲆鰈魚類精子激活的決定因素，以期為海水魚類精子的激活機(jī)制提供參考，有助于優(yōu)化種質(zhì)保存及育苗生產(chǎn)，同時也將有益于魚類精子生物學(xué)和繁殖生物學(xué)特性的深入研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用夏牙鲆精液取自山東東方海洋科技股份有限公司繁殖季節(jié)的親魚（2012年4月）。采用腹部擠壓法獲得若干親魚的精液，分別進(jìn)行鏡檢，將活力>于 80%的個體精液選出，預(yù)混，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2不同離子及非離子溶液的配置

配置 3種單一組分溶液： NaCl、KCl和葡萄糖，濃度分別為 50、100、150、300、400、500、600、800、1 000 mmol/L，共計 9個梯度（表1）。

表1　不同溶液的滲透壓（mosm/kg）Tab.1　The osmolality of the solutions of different concentrations

同時設(shè)無Ca2+/K+/Mg2+/HCO3-的4種單一離子缺陷型人工海水（人工海水配方參考張蓮蕾［12］）、天然海水等溶液組。所用藥品均為國藥分析純、超純水配制。

不同pH組天然海水的pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0（分別用0.01 mol/L HCl溶液或0.01 mol/L NaOH溶液進(jìn)行pH調(diào)整）。

1.3CASA活力檢測

分別用1.2中的溶液作用于夏牙鲆精子，初步篩選出精子可以激活的溶液濃度和滲透壓范圍，然后再精細(xì)測定在可激活滲透壓范圍下的精子運(yùn)動參數(shù)。通過計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（computer-assisted sperm analysis，CASA），0～300 s內(nèi)，每隔30 s測定采集一次精子運(yùn)動參數(shù)。每次測量5～6個重復(fù)，每個重復(fù)檢測 3個視野。分析、比較不同溶液對夏牙鲆精子激活及運(yùn)動特征的影響。

1.4滲透壓測定

通過滲透壓計對所配置的不同溶液進(jìn)行滲透壓測定（表 2）。滲透壓計型號： Osmolality—mosm/kg，The Fiske Micro—Osmometer Model 210。

表2　12種不同濃度溶液的滲透壓范圍Tab.2　The osmolality range of the solutions of different concentrations

當(dāng)單一組分溶液： NaCl和 KCl溶液的濃度是300 mmol/L，葡萄糖溶液的濃度為600 mmol/L時（3種溶液滲透壓相似），簡寫為 NaCl300-KCl300-葡萄糖600，并列標(biāo)記為A組，其他依次類推。

激活劑濃度為 NaCl300-KCl300-葡萄糖 600、NaCl400-KCl400-葡萄糖800、NaCl500-KCl500-葡萄糖1000-和NaCl600-KCl600-葡萄糖1200分別標(biāo)記為A/B/C/D 4組，單位為mmol/L。 各組中每種溶液（單一組分）的滲透壓值相似。

CaCl2溶液濃度為400 mmol/L時簡寫為CaCl2400（1180 mosm/kg），EGTA的溶液濃度為400 mmol/L時簡寫為EGTA400（1146 mosm/kg）與無Ca2+人工海水滲透壓（1091 mosm/kg）相似。比較在相似滲透壓下，外源Ca2+對夏牙鲆精子激活的影響。

此外，天然海水滲透壓為939，人工海水為1131，人工海水無K+為954，人工海水無Mg2+為1029，人工海水無HCO3-為1114，單位為mosm/kg。

1.5數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計分析

精子活力通過精子分析系統(tǒng)（CASA）采集。利用SPSS 18對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05 表示具有顯著性差異。描述性統(tǒng)計量用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1滲透壓對夏牙鲆精子激活和運(yùn)動特征的影響

2.1.1夏牙鲆精子激活 1 s時，不同滲透壓下的運(yùn)動率

當(dāng)NaCl和KCl離子溶液濃度在300～600 mmol/L，葡萄糖溶液的濃度在600～1 200 mmol/L時，均可將夏牙鲆精子激活，也就是滲透壓<581或者>1 260 mosm/kg的不同離子溶液或者葡萄糖溶液，均不能將夏牙鲆精子激活（運(yùn)動率為0）。夏牙鲆精子激活的滲透壓范圍為581～1 260 mosm/kg，運(yùn)動率可達(dá)35.27%±11.61 %～85.25%±9.16%。在激活啟動，即激活1 s時，激活范圍內(nèi)的相似滲透壓下，A組（581～650），B組（762～877），C組（931～1 060），D組（1 117～1 260）4組，每組3種溶液，共12種溶液（表1），通過比較發(fā)現(xiàn)，NaCl和葡萄糖對于夏牙鲆精子的激活明顯優(yōu)于 KCl，且隨著滲透壓增大，顯著性增強(qiáng)（圖1）。

2.1.2夏牙鲆精子激活30 s時，不同滲透壓下的運(yùn)動率情況

通過 CASA精子輔助分析系統(tǒng)對精子的運(yùn)動率進(jìn)行檢測，由于瞬間激活時即激活 1 s時運(yùn)動過快，捕捉不夠精確，作者認(rèn)為取激活后30 s時更能代表激活的一個穩(wěn)定狀態(tài)，所采集到的數(shù)據(jù)更加具有說服力。

研究結(jié)果表明： 在30 s時，在相似的滲透壓下，A，B，C，D 組，NaCl、KCl、葡萄糖三者比較，葡萄糖對夏牙鲆激活及運(yùn)動特征的影響優(yōu)勢非常顯著（圖2）。A組，在相對低滲條件下，葡萄糖作用下的精子運(yùn)動

圖1　不同滲透壓下NaCl，KCl及葡萄糖處理組的精子運(yùn)動率（激活1s）Fig.1　Sperm motility in NaCl，KCl and glucose solutions under different osmolality（1 s after activationed）

圖2　不同滲透壓下NaCl、KCl及葡萄糖處理組的精子運(yùn)動率（激活30 s）Fig.2　Sperm motility in NaCl，KCl and glucose solutions under different osmolality（30 s after activationed）

率可以達(dá)到78.86%±6.70%，NaCl作用下為62.64%± 8.61%，KCl作用下僅為57.62%±4.04%。D組，在相對高滲條件下，葡萄糖作用下的運(yùn)動率可以達(dá)到

78.86%±6.70%，NaCl 作用下為 48.58%±9.44%，而

KCl作用下僅為26.35%±10.04%，差異顯著。

2.1.3夏牙鲆精子激活 300s 時，不同滲透壓下的運(yùn)動率

在激活300 s以后，葡萄糖溶液激活后的精子運(yùn)動率顯著高于NaCl、KCl，優(yōu)勢非常明顯，且隨著滲透壓的增加，優(yōu)勢愈加顯著。A組中，NaCl300-KCl300-葡萄糖600 mmol/L，滲透壓為581～650 mosm/kg，運(yùn)動率為 6.85%±1.61%～29.91%±5.53%； D組中，NaCl600-KCl600-葡萄糖 1 200 mmol/L，滲透壓為 1 117～1 260 mosm/kg，運(yùn)動率為4.16%±0.75%～18.31%± 0.22%（圖3）。

2.2pH 對夏牙鲆精子激活和運(yùn)動特征的影響

pH6～9范圍內(nèi)，在激活30 s時，pH7.5的天然海水作用下，精子運(yùn)動率最高，為 69.65%±6.52%，pH8.5的天然海水作用下，運(yùn)動率最低，為 41.43%± 2.99%。激活后30、60、90 s時，在pH為7及7.5天然海水作用下，運(yùn)動率顯著高于其他pH的作用。在180～300 s內(nèi)，不同pH的天然海水對運(yùn)動率的影響差異不顯著。夏牙鲆精子的最適激活pH為7～7.5，且對pH的變化較敏感（圖4）。

圖3　不同滲透壓下NaCl，KCl及葡萄糖處理組的精子運(yùn)動率（激活300 s）Fig.3　Sperm motility in NaCl，KCl，and glucose solutions under different osmolality（300 s after activationed）

圖4　pH對精子活力的影響（激活0～300 s）Fig.4　Effects of pH on sperm motility（0-300 s after activationed）

2.3離子對夏牙鲆精子激活和運(yùn)動特征的影響

2.3.1天然海水、人工海水、無Ca2+/K+/Mg2+/HCO3-的人工海水激活作用下，運(yùn)動率在 0～300 s內(nèi)的變化

激活后的1、90、180 s時，在天然海水作用下，夏牙鲆精子激活后運(yùn)動率均顯著高于其他單一離子缺陷型人工海水及全人工海水。在激活后0～300 s內(nèi)，人工海水無 Ca2+作用下，夏牙鲆精子的運(yùn)動率均顯著低于天然海水，但與其他溶液的作用相比較（無Mg2+人工海水除外），運(yùn)動率均無顯著性差異。由此說明，相對于天然海水，人工海水中的 Ca2+，K+，HCO3-在精子激活中很重要，而 Mg2+對運(yùn)動率的影響不顯著（圖5）。

圖5　天然海水、人工海水及無Ca2+/K+/Mg2+/HCO3?人工海水對精子活力的影響（激活0～300 s）Fig.5　Effects of natural seawater，artificial seawater and artificial seawater without Ca2+/K+/Mg2+/HCO3?- on sperm motility（0-300 s after activationed）

2.3.2相似滲透壓下，CaCl2400/ EGTA400/無Ca2+人工海水作用下精子的運(yùn)動率變化

相似滲透壓（1091～1180 mosm/kg）下，EGTA400，CaCl2400，無 Ca2+人工海水對夏牙鲆精子激活和運(yùn)動特征的差異顯著，在相對高滲條件下，外源 Ca2+在激活和運(yùn)動過程中不但沒有使運(yùn)動率提高，反而降低。在CaCl2400作用 120 s后，精子運(yùn)動率僅為5%左右（圖6）。

圖6　CaCl2400、EGTA400和無Ca2+人工海水對精子活力的影響（激活0～300 s）Fig.6　Effects of CaCl2400，EGTA400 and artificial　seawater without Ca2+on sperm motility（0-300 s after activationed）

3　討論

3.1相似滲透壓下，不同濃度的NaCl、KCl和葡萄糖溶液對精子活力的影響

大部分硬骨魚類的精子在精巢的等滲環(huán)境下是靜止不動的。精子的激活發(fā)生在排放到外界環(huán)境以后，淡水魚的精子是排放到低滲的溶液中，而海水魚的精子是排放到高滲的溶液中啟動激活的。然而，不同的離子溶液及葡萄糖溶液對于魚類精子激活及運(yùn)動特征的影響具有種的特異性。本研究表明，在相似滲透壓下，與NaCl和KCl相比，葡萄糖可以顯著提高激活后的運(yùn)動率； 且隨著滲透壓增大，葡萄糖的優(yōu)勢愈加明顯。葡萄糖在淡水魚類如中華鱘（Acipenser sinensis）［13］，和凹目白鮭（Coregonus autumnalis）［14］，精子激活和運(yùn)動的作用顯著，可以顯著延長運(yùn)動時間和壽命。Gardiner［15］認(rèn)為，體外受精魚類的精子具有三羧酸循環(huán)代謝的能力，能夠通過氧化作用對細(xì)胞外源性葡萄糖加以利用，以此來補(bǔ)償自身運(yùn)動過程中所消耗的部分能量。然而，Bondarenko［16］的研究表明，滲透壓相似，在葡萄糖溶液作用下，美洲紅點(diǎn)鮭魚（Salvelinus fontinalis）精子運(yùn)動率顯著低于Na+溶液，細(xì)胞內(nèi)外的Na+交換對于精子激活起著非常重要的調(diào)控作用。不同離子或者葡萄糖溶液對魚類精子激活的作用具有顯著差異，具體的激活機(jī)制也可能存在種的差異性，還有待進(jìn)一步研究。此外，Mannowetz［17］對小鼠的研究表明，葡萄糖對精子激活早期是pH依賴性的，并對精子震動頻率具有重要的影響。

3.2不同pH對精子活力的影響

大多數(shù)魚類精漿pH偏堿性，精子在中性或中性偏堿性的溶液中活力較高。在本實(shí)驗(yàn)中，研究結(jié)果表明pH在6～9范圍內(nèi)，30、60、90 s時，pH為7～7.5時，夏牙鲆精子激活和運(yùn)動特征最佳。淡水魚類翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis）最適合的精子運(yùn)動的pH在8.5［18］； 人工精漿中培養(yǎng)金鱒（Oncorhynchus mykiss）偽雄魚精子，在提高 pH后其活力顯著提高，壽命亦延長［19］； 長鰭籃子魚（Siganus canaliculatus）和點(diǎn)籃子魚（Siganus guttatus）最適pH為8［20］，圓斑星鰈（Verasper variegatus）的最適pH范圍為7～8［21］，過酸性或過堿性的溶液都降低了精子活力。夏牙鲆精子激活的pH范圍為中性偏堿性，與其他魚種已有研究結(jié)果一致，且對 pH的變化較敏感。pH敏感性的變化對于魚類精子最后的成熟與排放以及冷凍保存過程的抗凍性可能具有一定的影響。

3.3外源Ca2+對精子活力的影響

EGTA400、CaCl2400溶液、無Ca2+人工海水對于夏牙鲆精子激活和運(yùn)動特征的影響差異顯著。適當(dāng)濃度的EGTA溶液及無Ca2+人工海水同樣可以將夏牙鲆精子激活，且在0～300 s內(nèi)，EGTA400溶液、無Ca2+人工海水比CaCl2400溶液作用下，精子運(yùn)動率高，說明相似滲透壓（可激活滲透壓范圍內(nèi)相對較高時）下，外源Ca2+在夏牙鲆精子激活和運(yùn)動過程中，不能使其運(yùn)動率提高，但是可能對運(yùn)動軌跡、直線運(yùn)動速率、路徑運(yùn)動速率、曲線運(yùn)動速率等運(yùn)動參數(shù)具有一定的影響。鯉魚是在不需要Ca2+的低滲環(huán)境中激活的，當(dāng)激活時有 Ca2+存在，其精子運(yùn)動軌跡是環(huán)形的，且很快停止運(yùn)動，處于靜息狀態(tài)； 而Ca2+對蝦虎和鯰魚精子激活及運(yùn)動過程與鯉魚相比差別很大［22］。所以，外源Ca2+在不同的魚種精子激活時所起的作用可能不同。在歐洲鰻鱺上的最新研究表明［11］，精子激活后，細(xì)胞內(nèi)的 Ca2+濃度增加。夏牙鲆精子頭部一般含有2～5個線粒體，在激活過程中，精子內(nèi)源性 Ca2+含量和狀態(tài)變化目前還不是很清楚。

4　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，滲透壓是夏牙鲆精子激活的決定性因素； 在相似滲透壓下，與NaCl和KCl相比，葡萄糖可以顯著提高激活后的運(yùn)動率； 而在較高的可激活滲透壓條件下，外源 Ca2+使激活后的精子運(yùn)動率降低； 夏牙鲆精子最適激活pH為7.0～7.5，且對pH的變化較為敏感。

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（本文編輯： 譚雪靜）

Effects of osmolality，pH，glucose，and ion solutions on sperm motility of the summer flounder Paralichthys dentatus

WANG Xue-ying1，2，XU Shi-hong1，LIU Qing-hua1，LI Jun1
（1.Key Laboratory of Experimental Marine Biology，Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，China； 2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Received: Mar.5，2015

Key words:Paralichthys dentatus； sperm； osmolality； pH； motility

Abstract:In the present study，we evaluated the effects of osmolality，pH，glucose，and ion solutions on the sperm motility of summer flounder（Paralichthys dentatus）using a computer-assisted sperm analysis system.According to the results，the moderate osmolality for sperm activation was 581-1260 mosm/kg under the osmolality ranges as follows： among group A（581-650 mosm/kg），B（762-877 mosm/kg），C（931-1060 mosm/kg），and D（1117-1180 mosm/kg）.The glucose solution had an advantage over NaCl and KCl on sperm motility.Under high osmolality（1091-1180 mosm/kg），sperm motility significantly varied in EGTA400，CaCl2400，and artificial seawater without Ca2+.The optimum pH for the sperm activation of summer flounder was 7-7.5.In conclusion，the present study indicated that osmolality is the most pronounced factor influencing the sperm activation of summer flounder.Additionally，glucose，exogenous Ca2+，and pH influence sperm motility to different degrees.

中圖分類號：Q256

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3096（2016）03-0040-07

doi：10.11759//hykx20150305003

收稿日期：2015-03-05； 修回日期： 2015-04-03

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31572602，31472264）； 鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（nycytx-50）； 海洋藥源生物種質(zhì)資源庫建設(shè)（12PYY001SF08）；現(xiàn)代生態(tài)海洋農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新（KSC2-EW-B-3）； 中國科學(xué)院 STS項(xiàng)目（KFJ-EW-STS-060）； 國家水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺

作者簡介：王學(xué)穎（1985-06），女，河北保定人，博士研究生，主要從事海水魚類生殖細(xì)胞發(fā)育研究，E-mail： haiyangshengya@126.com； 李軍，通信作者，研究員，E-mail： junli@qdio.ac.cn； 劉清華，通信作者，副研究員，E-mail： qinghualiu@qdio.ac.cn