吳麗麗，孫慧誌，孫冉，趙楠，3，王勇，古強，3，董學(xué)易，3，劉芳，3，孫保存，3，4

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缺氧誘導(dǎo)因子-1α對結(jié)直腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲遷移的影響

吳麗麗1，孫慧誌1，孫冉2，趙楠1，3，王勇1，古強1，3，董學(xué)易1，3，劉芳1，3，孫保存1，3，4

目的探討缺氧是否能促進不同分化程度結(jié)直腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），并分析缺氧對結(jié)直腸癌細胞侵襲、遷移的影響。方法分別選取HCT116（低度分化）和HT-29（高度分化）結(jié)直腸腺癌細胞。觀察0、10、25、50、100及150 mg/L氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)2種細胞48 h后的形態(tài)變化。分析0、10、25、50及100 mg/L CoCl2處理48 h后缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α蛋白表達變化，篩選出CoCl2誘導(dǎo)細胞缺氧的最適合濃度。MTT實驗檢測不同時間點（0、24、48、72及96 h）CoCl2誘導(dǎo)2種結(jié)直腸癌細胞的增殖情況，篩選出CoCl2誘導(dǎo)缺氧的最佳時間。最佳濃度和時間條件下，對HCT116和HT-29細胞分別進行缺氧（缺氧組）和常氧（常氧組）處理，Transwell侵襲和劃痕實驗檢測2組2種細胞的侵襲、遷移情況；Western blot實驗和RT-PCR實驗檢測2組HIF-1α、E-cadherin及Vimentin的蛋白及mRNA表達水平。結(jié)果50 mg/L CoCl2作用48 h時2種細胞均出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變。2組HCT116、HT-29細胞的HIF-1α蛋白表達水平隨CoCl2濃度增加均呈先增后減趨勢，50 mg/L為最適宜濃度（P＜0.05）。0～96 h時2種細胞不論有無缺氧，細胞增殖能力均呈先增后減趨勢（P＜0.05），48 h為最佳作用時間。HCT116和HT-29細胞系中缺氧組穿膜細胞數(shù)和細胞遷移率均明顯高于常氧組（P＜0.05）。HCT116、HT-29細胞系中缺氧組HIF-1α、Vimentin的蛋白和mRNA表達水平均高于常氧組，而E-cadherin的蛋白和mRNA表達水平低于常氧組（均P＜0.05）。結(jié)論缺氧能誘導(dǎo)不同分化程度結(jié)直腸癌細胞均發(fā)生EMT，并能增強2種結(jié)直腸癌細胞的侵襲、遷移能力。

缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；結(jié)直腸腫瘤；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；細胞增殖；腫瘤侵潤；細胞運動

微環(huán)境缺氧是實體瘤普遍存在的現(xiàn)象，腫瘤為適應(yīng)缺氧可發(fā)生一系列生物學(xué)改變，這一過程主要由缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α介導(dǎo)［1］。HIF-1α可通過參與RNA轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，從而影響腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力，并促進腫瘤血管的生成［2］。在腫瘤侵襲、遷移過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）可表現(xiàn)為上皮源性標志物減少或缺失，間葉源性標志物增加［3-5］。HIF-1α介導(dǎo)的缺氧信號傳導(dǎo)是調(diào)節(jié)EMT的重要機制。目前，關(guān)于缺氧微環(huán)境在不同分化程度的腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中是否均產(chǎn)生了影響尚無定論。本研究選擇2種不同分化程度的結(jié)直腸癌細胞系，通過構(gòu)建體外缺氧模型，探討缺氧是否均能促進不同分化程度結(jié)直腸癌細胞發(fā)生EMT，并分析缺氧對結(jié)直腸癌細胞侵襲、遷移的影響。

1材料與方法

1.1實驗材料HT-29和HCT116分別為高、低度分化的結(jié)直腸腺癌細胞，均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞資源中心。DMEM/F12（Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12）和IMDM（ISCOVE’s modified DMEM）培養(yǎng)基均購自南京凱基生物公司，胎牛血清購自Thermo公司，Transwell小室購自美國FALCON公司，化學(xué)發(fā)光液A（Western Bright ECL）和B（Western Bright peroxide）購自Advansta公司。鼠抗人單克隆抗體HIF-1α、E-cadherin及Vimentin均購自美國Abcam公司。兔抗人多克隆抗體β-actin、山羊抗兔IgG抗體及山羊抗鼠IgG抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞系培養(yǎng)HT-29加入DMEM/F12培養(yǎng)基+5%胎牛血清，HCT116加入IMDM培養(yǎng)基+10%胎牛血清，加入100 U/mL的青霉素和100 mg/L的鏈霉素，于37℃5%CO2恒溫孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2不同濃度氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)2種結(jié)直腸癌細胞的形態(tài)變化HT-29、HCT116細胞分別培養(yǎng)至80%融合時，撤血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加梯度濃度的CoCl2（0、10、25、50、100 及150 mg/L）于完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于倒置顯微鏡（×100）下分別觀察HT-29、HCT116細胞的形態(tài)變化。

1.2.3 Western blot實驗檢測不同濃度CoCl2對結(jié)直腸癌細胞HIF-1α蛋白表達的影響取對數(shù)生長期的HT-29、HCT116細胞，撤血清繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化離心重懸，參照文獻［6］調(diào)整細胞濃度至1×106個/mL，分別接種于6孔板中，待細胞貼壁后加不同濃度CoCl2（0、10、25、50及100 mg/L）于完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用細胞裂解液充分裂解細胞，提取總蛋白，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉非特異性抗原后，加一抗，4℃孵育過夜，次日室溫恢復(fù)后，用TBST洗10 min×3次，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后，加入200 μL A發(fā)光液和200 μL B發(fā)光液混勻后顯影；掃描電泳條帶，以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)目的條帶與內(nèi)參條帶比值表示目的蛋白相對表達量。篩選出CoCl2誘導(dǎo)缺氧的最適合濃度。按照最適合濃度進行后續(xù)細胞實驗。缺氧組：HT-29和HCT116細胞分別進行缺氧處理（HT-29-H組、HCT116-H組）；常氧組：HT-29和HCT116細胞均進行常氧處理（HT-29-N組、HCT116-N組）。

1.2.4 MTT實驗檢測不同時間點CoCl2誘導(dǎo)2種結(jié)直腸癌細胞增殖情況取對數(shù)生長期的HT-29、HCT116細胞常規(guī)消化離心重懸后，調(diào)整細胞濃度至1×104個/mL后分別接種到5 個96孔板。待細胞貼壁后，缺氧組加入50 mg/L的CoCl2，常氧組加入等量的去離子水，每組設(shè)5個復(fù)孔，按不同時間點（0、24、48、72及96 h）分別取出一個96孔板，加入50 μL 1×MTT溶液，在37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長處檢測各孔的吸光度（A）值。實驗重復(fù)3次，取其平均值。結(jié)合1.2.2細胞形態(tài)變化篩選出CoCl2誘導(dǎo)缺氧的最佳時間。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測缺氧組和常氧組細胞侵襲情況Transwell小室包被Matirgel膠置于24孔板內(nèi)并于培養(yǎng)箱中過夜，缺氧組和常氧組細胞分別培養(yǎng)48 h后，胰酶消化離心重懸后，調(diào)整細胞濃度至1×105個/mL，小室內(nèi)加入200 μL（無血清或含5%血清）的細胞懸液，小室外加入含20%血清的完全培養(yǎng)基。待細胞培養(yǎng)48 h時，取出小室并放入加有500 μL冷甲醇的新孔內(nèi)固定20 min，用棉簽擦去小室內(nèi)的細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗小室內(nèi)部1～2遍，0.4%結(jié)晶紫加入到（新孔）小室外200 μL、小室內(nèi)50 μL，待染色40 min，用PBS沖洗小室內(nèi)部1～2遍后于倒置顯微鏡（×200）下隨機選5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)［7］，實驗重復(fù)3次，取其平均值。1.2.6細胞劃痕實驗檢測缺氧組和常氧組細胞遷移情況取對數(shù)生長期的HT-29、HCT116細胞分別接種于12孔板，待細胞達80%融合時，缺氧組給予50 mg/L CoCl2處理，常氧組加入等量去離子水分別作用48 h后，用中槍頭垂直于細胞表面進行劃痕，用無菌PBS洗去刮掉的細胞，加入完全培養(yǎng)基。此時記為劃痕0 h，分別在0 h和24 h于倒置顯微鏡（×40）下拍照測量細胞劃痕距離，實驗重復(fù)3次，取其平均值，計算細胞遷移率。

1.2.7 Western blot實驗檢測缺氧組和常氧組細胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin的蛋白表達情況方法同1.2.3。1.2.8反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測缺氧組和常氧組細胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin的mRNA表達水平用TRizol法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行，用2×Taq PCR MasterMix產(chǎn)品，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，退火（HIF-1α，55.8℃；E-cadherin，56℃；Vimentin，58.7℃；GAPDH，57.5℃）30 s，72℃延伸1 min；72℃延伸5 min，4℃冷卻10 min。HIF-1α基因為27個循環(huán)，其他基因為30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠100 V，25 min電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像分析儀拍照，電泳條帶用Quantity one軟件分析，待測基因條帶與內(nèi)參條帶比值作為目的基因的相對表達量。各基因引物序列見表1。

Tab. 1 Primer sequences of HIF-1α，E-cadherin，Vimentin and GAPDH表1　HIF-1α、E-cadherin、Vimentin及GAPDH引物序列

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（x ±s）表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，不同時間點兩兩比較用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1缺氧微環(huán)境下2種結(jié)直腸癌細胞的形態(tài)變化CoCl2誘導(dǎo)缺氧48 h時，0、10 mg/L細胞形態(tài)基本無變化；25 mg/L CoCl2細胞形態(tài)開始變化；50 mg/L CoCl2細胞均出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變，細胞間連接變得疏松，細胞偽足增多，呈間質(zhì)細胞樣改變；100、150 mg/L CoCl2細胞開始變圓，有部分細胞從培養(yǎng)板上脫落，細胞出現(xiàn)裂解、死亡，見圖1。

B：不同濃度的CoCl2作用于HT-29細胞Fig. 1 Morphological changes of HCT116 and HT-29 cells after treatment with different concentrations of CoCl2（×100）圖1　HCT116和HT-29細胞在不同濃度CoCl2作用下的形態(tài)學(xué)改變（×100）

2.2不同濃度CoCl2作用下2種細胞系中HIF-1α蛋白表達情況HCT116細胞和HT-29細胞的HIF-1α蛋白表達水平均呈先增后減趨勢，50 mg/L 時HIF-1α蛋白表達水平均最高（F分別為2620.77、1 320.95，n=3，P＜0.05），結(jié)合形態(tài)學(xué)變化，以50 mg/L 為CoCl2作用的最適宜濃度，見圖2。

＊50 mg/L時HIF-1α蛋白表達水平與0、10、25及100 mg/L比較，均P＜0.05；1～5分別為0、10、25、50及100 mg/L CoCl2作用Fig. 2 Effects of different concentrations of CoCl2on the expression of HIF-1α protein in colorectal cancer cells圖2　不同濃度CoCl2對結(jié)直腸癌細胞HIF-1α蛋白表達的影響

2.3缺氧微環(huán)境下2種結(jié)直腸癌細胞增殖能力的變化0～96 h時HCT116與HT-29細胞不論有無缺氧，細胞增殖能力均呈先增后減趨勢。其中，HCT116-H組72 h時最高，但48 h時A值增長幅度較72 h更大，HT-29-H組48 h時最高，因此，取48 h為最佳作用時間，見表2。

2.4缺氧微環(huán)境下2種結(jié)直腸癌細胞侵襲和遷移能力的變化HCT116和HT-29細胞系中缺氧組穿膜細胞數(shù)和細胞遷移率均明顯高于常氧組（P＜0.05），見圖3、4，表3。

Fig.3 Effects of hypoxiaon cell invasion（Crystal violet，×200）圖3　缺氧對細胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

Fig. 4 Effects of hypoxiaon cell migration（×40）圖4　缺氧對細胞遷移能力的影響（×40）

2.5缺氧微環(huán)境下結(jié)直腸癌細胞HIF-1α、E-cadherin及Vimentin蛋白和mRNA表達水平的比較HCT116- H組HIF- 1α及Vimentin蛋白和mRNA表達水平均高于HCT116-N組，而E-cadherin蛋白和mRNA表達水平低于HCT116-N組（均P＜0.05）；HT-29細胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin蛋白表達與HCT116細胞類似，見圖5、6和表4、5。

3　討論

在乳腺癌、肝癌研究中顯示，腫瘤細胞缺氧微環(huán)境可導(dǎo)致腫瘤更具有侵襲性，更易于轉(zhuǎn)移［8-9］。HIF-1α受氧分壓的調(diào)控，能在缺氧條件下保持穩(wěn)定，并且是組織缺氧的內(nèi)在標志物。CoCl2是HIF-1α的特異性誘導(dǎo)劑，常用于體外模擬缺氧微環(huán)境［10］。

本研究形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細胞中，25 mg/L CoCl2作用時，細胞開始出現(xiàn)多角偽足，轉(zhuǎn)變成纖維母細胞樣，細胞間連接疏松，彼此間黏附性降低，易于細胞遷移運動；50 mg/L CoCl2作用時，細胞形態(tài)變化最顯著，當CoCl2濃度升高（100、150 mg/L）時，細胞偽足逐漸消失，開始變圓，部分細胞裂解死亡，表明CoCl2濃度對細胞形態(tài)改變具有雙向影響。Western blot結(jié)果顯示，HCT116和HT-29細胞的HIF-1α蛋白表達水平均呈先增后減趨勢，50 mg/L 時HIF-1α蛋白表達水平均最高，結(jié)合細胞形態(tài)變化與HIF-1α表達量的改變，因此，以50 mg/L CoCl2作為誘導(dǎo)缺氧的最適宜濃度。MTT實驗結(jié)果表明，隨著缺氧時間的延長，細胞增殖能力呈先增后減趨勢；缺氧達48 h、72 h時，缺氧組與常氧組相比，細胞增殖能力均顯著增強，且缺氧組48 h細胞增殖能力增強幅度大于72 h，提示48 h是誘導(dǎo)缺氧的節(jié)點；而HT-29細胞缺氧96 h時常氧組增殖率反而較缺氧組高，推測可能是由于隨缺氧時間的延長，CoCl2累積的毒性效應(yīng)或是CoCl2刺激細胞反應(yīng)性增生加重了缺氧程度，導(dǎo)致缺氧組細胞增殖能力下降。

Tab. 2 Comparison of the proliferation between hypoxia and normoxic groups of HCT116 and HT-29 cells表2　缺氧組和常氧組HCT116、HT-29細胞增殖能力的變化?。╪=15，A值，x ±s）

Tab. 3 Comparison of transmembrane numbers and migration rate between hypoxia and normoxia groups in two kinds of cells表3　2種細胞中缺氧組與常氧組穿膜細胞數(shù)和細胞遷移率的比較?。╪=3，x ±s）

Fig. 5 The expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin protein after treatment with hypoxiain HCT116 and HT-29 cells圖5　缺氧對HCT116、HT-29細胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin蛋白表達的影響

Fig. 6 The expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin mRNA induced by hypoxiain HCT116 and HT-29 cells圖6　缺氧對HCT116、HT-29細胞中HIF-1α、E-cadherin及Vimentin mRNA表達的影響

Tab. 4 Comparison of expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin protein表4　各組細胞HIF-1α、E-cadherin及Vimentin蛋白表達量比較?。╪=3，x ±s）

Tab. 5 Comparison of expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin mRNA表5　各組細胞HIF-1α、E-cadherin及Vimentin mRNA表達量比較?。╪=3，x ±s）

侵襲實驗和遷移實驗結(jié)果顯示，HCT116和HT-29細胞系中缺氧組穿膜細胞數(shù)和細胞遷移率均明顯高于常氧組，表明缺氧誘導(dǎo)不同分化程度細胞的侵襲、遷移能力均顯著增強。本研究結(jié)果顯示，HCT116-H組HIF-1α及Vimentin蛋白和mRNA表達水平均高于HCT116-N組，而E-cadherin蛋白和mRNA表達水平低于HCT116-N組，HT-29細胞類似，表明在HCT116、HT-29細胞中，缺氧誘導(dǎo)可使HIF-1α、Vimentin蛋白及mRNA水平表達增強，同時抑制E-cadherin蛋白及mRNA的表達。王永興等［11］研究顯示，缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白表達增加，而mRNA水平不變，與本研究不同，推測可能由于其使用缺氧培養(yǎng)箱誘導(dǎo)6 h與本實驗的CoCl2誘導(dǎo)48 h不同，引起HIF-1α在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其mRNA水平的改變不同所致。綜合本實驗結(jié)果，缺氧誘導(dǎo)的不同分化程度結(jié)直腸癌細胞均有EMT發(fā)生并促進了細胞侵襲、遷移能力。這與Cannito等［12］研究一致，推測機制可能是由于缺氧誘導(dǎo)HIF-1α表達增加，導(dǎo)致其調(diào)控EMT過程中的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了變化，進而誘導(dǎo)EMT標志物表達發(fā)生變化，最終導(dǎo)致細胞形態(tài)及功能發(fā)生變化。

HIF-1α是Snail、ZEB、Twist等轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)控因子［13］；而這些因子能夠識別E-cadherin啟動子序列，吸引各種輔助因子，從而抑制E-cadherin的表達［14-15］；E-cadherin表達下調(diào)是EMT發(fā)生的關(guān)鍵［16］。但缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)不同分化細胞EMT發(fā)生的分子機制是否相同尚無定論。HIF-1α可能成為逆轉(zhuǎn)EMT發(fā)生的靶點，但HIF-1α在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)的分子機制仍需進一步研究。

（圖1、3、4見插頁）

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（2015-12-09收稿2016-01-18修回）

（本文編輯陸榮展）

Effects of HIF-1α on epithelial-mesenchymal transition，invasion and migration in colorectal cancer cells

WU Lili1，SUN Huizhi1，SUN Ran2，ZHAO Nan1，3，WANG Yong1，GU Qiang1，3，DONG Xueyi1，3，LIU Fang1，3，SUN Baocun1，3，4
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Tianjin Nan Kai Hospital；3 Tianjin Medical University General Hospital；4 Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital Corresponding Author E-mail：sunbaocun@aliyun.com

Objective To explore whether hypoxia could promote epithelial-mesenchymal transition（EMT）in various differentiated colorectal cancer cells，and analyse the effect of hypoxia on invasion and migration of colorectal cancer cells. Methods HCT116（poorly differentiated）and HT-29（highly differentiated）colorectal adenocarcinoma cells were selected respectively. The morphological changes of two cell lines were observed after 0，10，25，50，100 and 150 mg/L cobalt chloride（CoCl2）treatment for 48 h. The expression of hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）protein was analysed after 0，10，25，50，100 and 150 mg/L CoCl2treatment for 48 h. An optimal concentration of CoCl2was then selected. Methylthiazolyl tetrazolium（MTT）assay was used to detect the proliferation of two kinds of colorectal cancer cells induced by CoCl2at different time points（0，24，48，72 and 96 h），and to select an optimal time. Under the optimal concentration and time conditions，the HCT116 and HT- 29 cells were processed by hypoxia（hypoxia group）and normoxia（normoxic group）. Transwell invasion assay and Wound healing assay were used to detect cell invasion and migration in two groups. Western blot assay and RT-PCR were used to detect protein and mRNA expression levels of HIF-1α，E-cadherin and Vimentin in two groups. Results Two kinds of cells showed obvious morphological changes after 50 mg/L CoCl2treatment for 48 h. HIF-1α protein level first increased and then decreased in two groups of cells with the increased concentration of CoCl2，and 50mg/L CoCl2was the optimal concentration（P＜0.05）. The cell proliferation showed a tendency to decrease after the increase in both kinds of cells with or without hypoxia for 0-96 h（P＜0.05），and 48 h was the optimal time. The transmembrane number and cell migration rate were significantly more in hypoxia group than those of normoxic group（P＜0.05）. The protein and mRNA levels of HIF-1α and Vimentin were significantly higher in hypoxia group than those of normoxic group in HCT116 and HT-29 cell lines（P＜0.05）. E-cadherin protein and mRNA levels were significantly lower in hypoxia group than those of normoxic group（P＜0.05）. Conclusion Hypoxia can promote EMT in different differentiated colorectal cancer cells，and can enhance invasion and migration of two kinds of colorectal cancer cells.

hypoxia-inducible factor1，α subunit；colorectal neoplasms；epithelial-mesenchymal transition；cell proliferation；neoplasm invasion；cell movement

R735.34

A

10.11958/20150385

國家自然科學(xué)基金重點項目（81230050）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81572872）

1天津醫(yī)科大學(xué)（郵編300070）；2天津市南開醫(yī)院；3天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院；4天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院

吳麗麗（1989），女，碩士在讀，主要從事腫瘤血管生成擬態(tài)的分子調(diào)控機制研究

E-mail：sunbaocun@aliyun.com