李　媚， 周　娟， 彭長連

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

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超表達GLDH擬南芥植株對高光脅迫的響應(yīng)

李媚， 周娟， 彭長連*

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

摘要：研究在短時間高光脅迫下2種基因型擬南芥植株(GLDH基因超表達植株gldh236OE和哥倫比亞野生型Col)的表型、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒獾壬頂?shù)據(jù)的變化.結(jié)果表明，超表達植株的抗壞血酸表達量顯著高于野生型，高光對超表達植株葉片的傷害也小于對照野生型；野生型植株葉片葉綠素含量在高光處理前后并無明顯變化，而超表達植株的葉綠素含量顯著降低；PSII有效光化學(xué)效率Yield和光合電子傳遞速率ETR呈明顯降低趨勢，對照野生型的降低程度更明顯，說明高光脅迫使PSII結(jié)構(gòu)與功能受到一定程度的損傷與破壞，而抗壞血酸含量的增加能在一定程度上緩解高光脅迫所帶來的傷害.

關(guān)鍵詞：擬南芥; 抗壞血酸; 高光脅迫; 超表達GLDH

植物在高光脅迫下過剩的光能可能通過多種途徑在葉綠體內(nèi)產(chǎn)生有害的活性氧(ROS)[1]，活性氧會導(dǎo)致氧化脅迫，使生物大分子、細胞膜可逆及不可逆損傷，嚴重時甚至引起細胞死亡[2-4]，因此植物體內(nèi)形成了不同的活性氧清除系統(tǒng)，其中抗壞血酸起著重要作用.

抗壞血酸是植物細胞中主要的抗氧化物質(zhì)，它可以直接與單線態(tài)氧、超氧自由基、過氧化氫、羥自由基等活性氧反應(yīng)[5].其次，抗壞血酸同時也是植物光合作用的光保護劑以及過量光能耗散機制的重要組成成分[6]：抗壞血酸作為在水水循環(huán)的一部分，有效地避免了PSII的過度還原和光損壞；抗壞血酸也可以作為紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)的輔助因子參與葉黃素循環(huán)[7]，而葉黃素循環(huán)在耗散過量光能以及防御光破壞中起重要作用.此外抗壞血酸還參與了一些衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[8]，其含量的變化與植物衰老有著密切的聯(lián)系.

植物抗壞血酸合成途徑主要有：L-半乳糖途徑[9]、半乳糖醛酸途徑[10]、古洛糖途徑[11]和肌醇途徑[12].目前公認L-半乳糖途徑是植物抗壞血酸合成的主要途徑，而L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯脫氫酶( L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，簡稱GLDH)直接氧化L-半乳糖內(nèi)酯生成抗壞血酸(ASC)，是L-半乳糖途徑中最后一步的關(guān)鍵酶[9,13-14].研究表明，GLDH與抗壞血酸含量以及植物衰老密切相關(guān)[15].通過反義RNA技術(shù)抑制煙草GLDH基因的表達使得轉(zhuǎn)基因煙草的抗壞血酸含量降低25%左右，且細胞生長緩慢[16].相反，通過正義RNA技術(shù)增加GLDH基因的表達使得轉(zhuǎn)基因煙草抗壞血酸含量增加1.5～2.0倍，細胞的生長加快，抗衰老能力增強[17].此外超表達水稻GLDH基因可提高水稻葉片抗壞血酸的含量，延緩水稻衰老，結(jié)實率增加；而干涉型水稻GLDH基因表達量下調(diào)，抗壞血酸含量減少，水稻衰老提前，結(jié)實率低[18].

本研究比較2種基因型植株在短時間高光處理前后表型、生理及其光合參數(shù)方面的變化差異，探討擬南芥抗壞血酸合成關(guān)鍵酶基因(GLDH)超表達和抗壞血酸含量的增長與植物高光耐受性的關(guān)系，為抗壞血酸含量與植物衰老關(guān)系奠定理論基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1植物材料

所用擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)為哥倫比亞野生型(Col)；gldh突變體株系gldh2306OE(經(jīng)鑒定為GLDH基因超表達植株)圖1.gldh突變體購于擬南芥突變體種子庫(http://www.arabidopsis.org/).

取少量種子置于1.5 mL離心管，加入900 μL滅菌水后于4 ℃春化3 d，加入100 μL次氯酸鈉消毒10 min，70%乙醇消毒1 min后在超凈工作臺上無菌水沖洗4～5次后間隔均勻鋪于MS培養(yǎng)基上.10 d后即可移至營養(yǎng)土中生長，培養(yǎng)溫度為18～22 ℃, 光暗周期為16 h光照/8 h黑暗, 光照強度為70～80 μmol/(m2·s).

圖1　2種基因型擬南芥植株GLDH基因表達

1.2高光處理

將苗齡4周的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至光照強度為1 600 μmol/(m2·s)的高光下處理8 h，以相同處理下野生型擬南芥作為對照，該裝置經(jīng)過循環(huán)水帶走絕大部分熱量以避免高溫脅迫.

1.3測試分析

1.3.1實時熒光定量PCR采用SYBR?PremixEX TapTMII(Tli RNaseH Plus)(Takara)試劑盒進行定量PCR，具體步驟參照試劑盒使用說明書.

1.3.2抗壞血酸含量的測定參考文獻[19]的方法測定.

1.3.3葉綠素含量測定參照文獻[20]的方法并做改動，將擬南芥成熟蓮座葉剪碎后取鮮質(zhì)量40～60 mg，加入10 mL 80%丙酮，黑暗環(huán)境浸提24 h，用紫外-可見光分光光度計于663、645 nm測定并計算葉綠素a和葉綠素b的含量.

1.3.4葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定高光處理3 h后的植株葉片暗適應(yīng)30 min后用葉綠素?zé)晒鈨x進行測定，葉綠素?zé)晒鈪?shù)均由便攜式熒光測定儀(PAM-2100，Germany)測定和計算得出.先測定初始熒光Fo和暗下最大熒光Fm.經(jīng)光活化后，測定光下最大熒光Fm和穩(wěn)態(tài)熒光Fs，光化光強度為70 μmol/(m2·s).最大光化學(xué)效率Fv/Fm，有效光化學(xué)效率Yield，電子流速率ETR和非光化學(xué)淬滅系數(shù)qN按SCHREIBER等[21]公式計算.

1.4數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010軟件和SPSS 12.0軟件進行處理.通過單因素方差分析(One Way ANOVA)檢驗不同處理間的差異顯著性(P<0.05,差異顯著).采用Sigma Plot 12.0軟件作圖.

2結(jié)果與分析

2.1高光對2種基因型植株表型和GLDH基因表達的影響

圖2A為4周齡擬南芥植株在高光(1 600 μmol/(m2·s))脅迫處理8 h后的表型.高光處理前的GLDH基因超表達植株gldh236OE與野生型植株Col生成同等數(shù)量的蓮座葉，表型無差異；將植株置于1 600 μmol/(m2·s)光強照射后，葉片逐漸卷曲，對照Col植株尤為明顯，說明野生型葉片對高光更敏感.

圖2B表明，高光處理前野生型和超表達GLDH植株的GLDH基因表達量無差異，相對表達量分別為1.155和1.163，在高光處理8 h后，野生型植株表達量顯著下調(diào)(GLDH相對表達量為1.048)，而超表達GLDH植株顯著上調(diào)(GLDH相對表達量為1.29)(P<0.05).

2.2高光對2種基因型植株體內(nèi)抗壞血酸含量的影響

將2種基因型植株置于1 600 μmol/(m2·s)光強8 h后，與處理前相比，野生型植株抗壞血酸含量減少了7.25%，而超表達植株增長了9.75% (圖2C)，顯著高于野生型(P<0.05)，表明抗壞血酸含量與GLDH基因的表達量呈正比.

2.3高光對2種基因型植株光和能力的影響

高光對2種基因型植株葉片葉綠素含量的影響不同：野生型植株葉片葉綠素含量在高光處理前后的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，而超表達植株葉片在高光處理后植株葉綠素a、葉綠素a+b、葉綠素a/b含量均顯著降低(P<0.05)(表1).

圖2　高光對擬南芥野生型(Col)和超表達植株(gldh236OE)的表型(A)、GLDH基因表達量(B)、總抗壞血酸含量(C)的影響

Figure 2Effects of highlight on phenotype of wild-type (Col) and over-expression plant (gldh236OE) (A); theGLDHgene expression (B) and total ASC (C) inArabidopsis

表1　高光對擬南芥Col和gldh236OE植株葉片葉綠素含量的影響

注：不同字母表示差異具統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

植物受到高光脅迫后，葉片F(xiàn)v/Fm、Yield、ETR、qN的變化趨勢如圖3所示.Fv/Fm反映了(在最適條件下經(jīng)過暗適應(yīng)后的)PSII的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，在正常生長條件下，Col植株葉片的Fv/Fm略高于gldh236OE，但差異并不明顯(圖3A)，經(jīng)過3 h的高光脅迫，Col和gldh236OE植株葉片的Fv/Fm分別降低了32.86%和30.98%，兩者之間無明顯差異.圖3B為2種基因型植株葉片的PSII實際光化學(xué)量子產(chǎn)量(actual photo-chemical yield of PSII in the light, Yield)，高光脅迫后，Col植株葉片的Yield降至處理前的50.28%，而gldh236OE則為65.64%，顯著高于Col (P<0.05).Col和gldh236OE植株葉片的表觀光合電子傳輸速率(photosynthetic electron transport rate, ETR)在高光處理前后的變化趨勢與Yield相近(圖3C).而高光處理3 h后的Col熱耗散的非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)明顯上升(圖3D)，gldh236OE與Col趨勢相近.

3討論

在L-半乳糖途徑中，定位在線粒體內(nèi)膜外側(cè)的GLDH以細胞色素c為次級底物直接氧化L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯生成L-抗壞血酸(ASC)，是催化抗壞血酸生物合成最后一步的關(guān)鍵酶[9].有研究[15]表明GLDH對抗壞血酸的含量起著重要調(diào)節(jié)作用.在本試驗中GLDH基因超表達植株在高光處理后葉片GLDH表達量顯著增加，抗壞血酸的含量也顯著增加；野生型植株葉片的GLDH表達量則明顯下降，抗壞血酸的含量變化為相同的趨勢(圖1C)，表明GLDH的表達量與抗壞血酸含量確實有著緊密聯(lián)系.

植物進行光合作用時，葉綠體產(chǎn)生大量還原力，引起光合電子鏈的過度還原而產(chǎn)生ROS[22].抗壞血

圖3　高光對2種基因型植株葉片(Fv/Fm)(A),Yield(B),ETR(C) and qN(D)的影響

Figure 3Effects of highlight on chlorophyll fluorescence parameter of (Fv/Fm)(A), Yield of effective photochemical efficiency of PSII (B), ETR (C) and qN (D) in the leaves of twoArabidopsisphenotypes

酸是一種普遍存在于植物組織內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，可以通過抗壞血酸-谷胱胱肽循環(huán)、水水循環(huán)、玉米黃質(zhì)循環(huán)等途徑清除活性氧，保護植物免于氧化傷害[7].結(jié)合擬南芥植株在高光下的表型變化(圖1A)，超表達植株的卷曲程度明顯低于野生型，推測超表達GLDH引起抗壞血酸含量增加在一定程度上緩解植物所受到的氧化傷害，使植株葉片維持正常的表型.此外，超表達植株在高光脅迫后葉綠素a含量顯著降低，而葉綠素b含量則變化不明顯，導(dǎo)致葉綠素(a+b)含量以及葉綠素a/b比值也顯著下降(表1)，這可能是超表達植株適應(yīng)高光的一種表現(xiàn)：通過降低能將光能轉(zhuǎn)化為電能的葉綠素a的含量來減少由于光合電子鏈的過度還原所導(dǎo)致的活性氧的積累.

Fv/Fm值在非環(huán)境脅迫下波動小，受到脅迫時其值明顯降低, 因此作為受脅迫程度的指標[23]，本試驗中高光處理前后擬南芥的Fv/Fm值差異顯著，即PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率顯著下降, 表明植物的光化學(xué)活性明顯降低.同時，非光化學(xué)能量耗散增加，說明在高光強下植物能有效的調(diào)整和合理分配過量的能量，在一定程度上避免光抑制和光傷害[24-25].不過，植物葉片對強光的耗散能力也是有限的，當(dāng)光合機構(gòu)不能有效利用過多的激發(fā)能時，光抑制甚至光傷害也必然發(fā)生.經(jīng)1 600 μmol/(m2·s)強光處理后20 min 暗適應(yīng)恢復(fù)的植株，葉片PSII有效光化學(xué)效率(Yield)以及光合電子傳遞速率(ETR)顯著低于處理前的結(jié)果，表明光合能力下降，光合電子傳遞受阻，植株正常的光合作用受到影響，而超表達植株的下降水平顯著小于野生型，表明超表達植株葉片PSII對高光的耐受性較野生型強，因此高光脅迫下仍能維持較高的光合能力，推測植株內(nèi)GLDH基因超表達使得抗壞血酸含量的增加能緩解一部分光傷害，進而減少了高光脅迫對光系統(tǒng)的傷害作用.

綜上所述，GLDH超表達與抗壞血酸含量呈正比，超表達植株葉片抗壞血酸含量的增加能在一定程度上緩解高光傷害，使植物葉片維持正常的光合能力，適應(yīng)高光的能力更強.

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【中文責(zé)編：成文英文責(zé)編：李海航】

Response to High-Light Stress in Over-Expression GLDH Arabidopsis Thaliana

LI Mei, ZHOU Juan, PENG Changlian*

(School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Abstract：This study aims to test the highlight stress (1 600 μmol·m-2·s-1) on the echo-physiological characteristics of two gene-type plants(GLDHgene over-expression named asgldh236OEand the wild type). The results indicated that the content of total ascorbic acid in thegldh236OEwere increased, compared with the wild type (Col) plants, and the injury under highlight stress is more obvious in the wild type. The chlorophyll (Chl) content of wild type plants showed no difference before and after highlight stress while agldh236OEplant was reduced. Bothgldh236OEand wild type leaves showed a significant decrease in Yield and ETR values, however, the decrease rate for wild type was higher. This results indicated that highlight can impair the structure and function of PSII while the increase of ascorbic content can slow down the damage.

Key words：Arabidopsisthaliana; ascorbic acid; highlight stress; over-expressionGLDH

收稿日期：2015-03-31《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(31270287);廣東省自然科學(xué)基金重點項目(2015A030311023)

*通訊作者:彭長連，研究員，Email: pengchl@scib.ac.cn.

中圖分類號：Q945.3

文獻標志碼：A

文章編號:1000-5463(2016)01-0084-05