王朝元，劉亮亮

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

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bHGA對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞活性的影響

王朝元，劉亮亮

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

摘要為探討12b-羥基-去-D-杰氏山竹子素A(bHGA)的體外潛在成骨活性，用bHGA處理MC3T3-E1成骨細(xì)胞，研究了其對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性、礦化、骨相關(guān)基因表達(dá)及早期成骨分化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響.結(jié)果表明：bHGA處理細(xì)胞后，對(duì)Runx2 mRNA表達(dá)無顯著影響，而對(duì)OsxmRNA的表達(dá)具有一定抑制作用.bHGA能同時(shí)促進(jìn)骨鈣蛋白基因OCN和Ⅰ型膠原Col1 mRNA的表達(dá)，但抑制堿性磷酸酶 mRNA的表達(dá)，其對(duì)骨橋蛋白基因OPNmRNA的表達(dá)沒有顯著影響.說明bHGA不利于骨早期分化，但它通過促進(jìn)骨鈣蛋白和I型膠原mRNA的表達(dá)而促進(jìn)骨成熟.

關(guān)鍵詞12b-羥基-去-D-杰氏山竹子素A；成骨活性；骨相關(guān)基因；成骨分化相關(guān)基因

人面果(Garciniaxanthochymus)是我國的一種傳統(tǒng)傣藥，是藤黃科藤黃屬植物，一般生長于海拔100～1000 m的丘陵、溝谷和潮濕的密林中，在我國其主要分布于云南省南部及西南部.作為傳統(tǒng)中藥，它具有清熱退火，消腫止痛，活血化瘀的療效，可用于跌打損傷，風(fēng)濕關(guān)節(jié)疼痛的治療[1].它含有二苯甲酮衍生物、黃酮、三萜和口山酮類等化合物，其中一些化合物具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗糖尿病、抗菌、抗細(xì)胞毒素和抗HIV病毒等[2]. 12b-羥基-去-D-杰氏山竹子素A為黃色無定形固體，是從傣藥人面果中提取的藥物小分子化合物, 具有抗菌、抗腫瘤作用[3]，其成骨生物活性尚不清楚.本文通過對(duì)其進(jìn)行了體外成骨活性的相關(guān)測試，為中藥人面果臨床上的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料和儀器

小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3-E1購自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心，α-MEM 培養(yǎng)基(Thermo 賽默飛世爾生化制品有限公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25% 胰蛋白酶(Thermo)，Alamar Blue 試劑盒(北京泛博生物化學(xué)有限公司)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，SYBR Green 熒光染料(日本 TOYOBO 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo).

細(xì)胞培養(yǎng)瓶, 96 孔、24 孔、6 孔培養(yǎng)板，酶聯(lián)免疫分析儀(MULTISKAN ASCENT 354 型，Thermo)，CO2培養(yǎng)箱(HF90/240 型，利康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán))，凝膠成像分析儀(JS-380A，上海培清科技)，熒光定量PCR儀(ABI7500Fast，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司).

1.2bHGA的結(jié)構(gòu)

從云南西雙版納收集的人面果中分離提取bHGA，其分子結(jié)構(gòu)見圖1，分子量為442，通過NMR，質(zhì)譜，HRMS數(shù)據(jù)鑒定得到[4].

圖1　bHGA的分子結(jié)構(gòu)Fig.1　Molecular structure of bHGA

1.3bHGA儲(chǔ)存液的配制

將bHGA溶于DMSO，60℃加熱30 min助溶，制得初始濃度為16 mM的貯存液，保存在-20℃?zhèn)溆?

1.4細(xì)胞培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基加入100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素.誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終溶度為50 μg/mL抗壞血酸、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉.

1.5bHGA細(xì)胞毒性的測試

用Alamar Blue實(shí)驗(yàn)檢測bHGA對(duì)細(xì)胞存活率的影響[5]. MC3T3-E1細(xì)胞以1×103/孔的密度接種于96孔板中，細(xì)胞粘附后換用含不同濃度bHGA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(bHGA終濃度分別為0, 2, 4, 8, 16 μM)，每組設(shè)3個(gè)平行樣，將培養(yǎng)板放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0，24，72 h，每孔加入18 μL的Alamar Blue試劑使其最終體積分?jǐn)?shù)為10%，黑暗條件孵化4 h，用熒光酶標(biāo)儀于540 nm檢測光吸收值(激發(fā)光544 nm,發(fā)射光590 nm)，以0.5% DMSO為陰性對(duì)照.

1.6bHGA對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

將MC3T3-E1細(xì)胞按1×104/孔接種于24孔板中，每孔加入2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基.細(xì)胞粘附后，加入bHGA(終溶度為2，4，8 μM)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù), 含0.5% DMSO誘導(dǎo)培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照. 培養(yǎng)細(xì)胞8 d、16 d，每孔加入600 μL的0.1% Triton PBS裂解液，4℃放置12 h裂解細(xì)胞，用堿性磷酸酶試劑盒檢測細(xì)胞堿性磷酸酶活性.

1.7bHGA對(duì)成骨細(xì)胞體外礦化的影響

將MC3T3-E1細(xì)胞按7.5×103/孔接種于48孔板中，分別加入含有3種不同濃度bHGA(bHGA終濃度為2，4，8 μM)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以含0.5% 的DMSO作為陰性對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行樣，培養(yǎng)細(xì)胞沒2～3 d更換一次培養(yǎng)基, 分別培養(yǎng)8 d和16 d后，用PBS將樣品洗2次.室溫條件下，加入-20℃冰冷的甲醛固定細(xì)胞10 min，用dH2O洗2次，加入1% 茜素紅孵化10 min，用dH2O洗若干次后風(fēng)干，置倒置顯微鏡下觀察.

為了定量測定細(xì)胞礦化，在每孔中加入10% 的乙酸800 μL，室溫放置30 min，間歇震蕩.后用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，加入10% 的醋酸，漩渦震蕩30 s，再加入200 ～300 μL礦物油覆蓋，加熱至85℃，10 min，轉(zhuǎn)移至冰上5 min, 20000 r/min離心15 min.取每管上清液300～400 μL轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL的離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為10% 的氫氧化銨200 μL中和酸，取上清液150 μL轉(zhuǎn)移至96孔板中于405 nm檢測吸光值.

1.8bHGA對(duì)成骨細(xì)胞骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

將MC3T3-E1細(xì)胞按7.5×103/孔接種于48孔板中，加入含有bHGA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(bHGA的終濃度為2，4，8 μM)，每組3個(gè)重復(fù)，0.5% 的DMSO為陰性對(duì)照.培養(yǎng)8 d和16 d，收集細(xì)胞，用Trizol法裂解細(xì)胞提取總RNA[6].按試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一條鏈.熒光定量PCR的引物[7]見表1，GAPDH為內(nèi)參基因.PCR循環(huán)參數(shù)如下：初始變性：95℃，10 min；變性：95℃，15 s；退火和延伸：60℃，60 s；循環(huán)數(shù)：45.用軟件SDS2.2.2處理數(shù)據(jù)，通過2-△△CT計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)影響[8].

表1　PCR引物序列

1.9統(tǒng)計(jì)分析

采用t-檢驗(yàn)法(student′s t-test)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，置信度p取值0.05.

2結(jié)果與分析

2.1bHGA對(duì)細(xì)胞存活率的影響

bHGA對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖的影響結(jié)果如圖2.如圖2所示，到第3 d，不同濃度bHGA(0～16 μM)與對(duì)照組相比，16 μM組對(duì)成骨細(xì)胞具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性.故選定3種濃度(2，4， 8 μM)用于后續(xù)細(xì)胞成骨活性實(shí)驗(yàn).

圖2　bHGA對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖的影響(n=3)Fig.2　Effect of bHGA on osteoblast viability in vitro

2.2bHGA對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

bHGA對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響結(jié)果見圖3，如圖3所示，與對(duì)照組相比，4 μM和8 μM bHGA處理8 d顯著抑制了細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性.但處理16 d后，3種濃度的bHGA對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性無明顯抑制.說明這些濃度的bHGA對(duì)成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性存在短期抑制作用.

與對(duì)照比較,*p<0.05, n=3圖3　bHGA對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響Fig.3　Effect of bHGA of different concentrations on osteoblastalkaline phosphatase activity in osteoblasts in vitro

2.3bHGA對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞基質(zhì)礦化的影響

2、4、8 μM三種濃度bHGA處理細(xì)胞8 d后, 所測A405平均值分別為0.11、0.12、0.13, 處理16 d后A405平均值分別為1.13、0.98、1.0.其中對(duì)照組8 d 和16 d A405平均值分別為0.11和1.10.三種濃度bHGA處理結(jié)果與對(duì)照組相比，不存在顯著性差異，未影響細(xì)胞外基質(zhì)的礦化.

2.4bHGA對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

骨生長期間，一系列骨相關(guān)基因的表達(dá)水平能反映出成骨細(xì)胞的成骨活性狀況.本研究結(jié)果中，bHGA對(duì)成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶mRNA表達(dá)具有一定的抑制作用(見圖4).培養(yǎng)8d和16 d后，各實(shí)驗(yàn)組的堿性磷酸酶mRNA均顯著低于對(duì)照組(p<0.05，p<0.01，見圖4a).bHGA對(duì)成骨細(xì)胞的I型膠原及骨鈣蛋白mRNA表達(dá)均具有顯著的促進(jìn)作用(p<0.05，p<0.01)，見圖4b，4d).bHGA對(duì)骨橋蛋白mRNA的表達(dá)無顯著影響(p>0.05，見圖4c).bHGA對(duì)成骨細(xì)胞骨涎蛋白mRNA表達(dá)則具有一定時(shí)間依賴性，長時(shí)間處理(16 d)可以促進(jìn)其表達(dá)(p<0.05)，短期處理(8 d)則無顯著影響(p>0.05，見圖4e).

與對(duì)照組比較，*p<0.05；**p<0.01, n=3a) 堿性磷酸酶；b) 骨鈣蛋白；c) 骨橋蛋白；d) I型膠原；e) 骨涎蛋白圖4　bHGA對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.4　Effect of bHGA on bone-related mRNA expression in osteoblasts in vitro

同時(shí)，研究了bHGA對(duì)早期成骨分化相關(guān)基因Runx2、Osx及BMP2 mRNA的表達(dá)的影響(如圖5).bHGA對(duì)Runx2 mRNA表達(dá)似乎沒有影響(僅在高濃度bHGA長期處理是顯示出一定的抑制作用，如圖5a所示.與Runx2不同，bHGA對(duì)OsxmRNA表達(dá)具有顯著的抑制作用，如圖5b所示.bHGA對(duì)BMP2 mRNA的影響具有一定的時(shí)間依賴性，2 μM及4 μM bHGA長期處理可以一定程度上提高BMP2的表達(dá)，如圖5c所示.

a)Runx2；b)Osx；c)BMP2與對(duì)照組比較，*p<0.05,**p<0.01, n=3圖5　bHGA對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5　Effect of bHGA on expression of osteogenic differentiaton-related genes in osteoblasts in vitro

3討論

生物體內(nèi)成骨細(xì)胞的發(fā)育分為3個(gè)階段：前成骨細(xì)胞的分化階段(Runx2和Osterix參與)，骨基質(zhì)形成階段(APL，Col1，OPN，OCN和BSP等參與)和骨基質(zhì)礦化階段.在骨細(xì)胞成熟階段中，骨相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)骨基質(zhì)和骨基質(zhì)鈣化的形成起著關(guān)鍵性的作用[9,10].

Runx2和Osx是早期骨原細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞過程中的兩個(gè)關(guān)鍵基因[11,12].Runx2通過結(jié)合到Osx基因的啟動(dòng)子上，促進(jìn)MSC(間充質(zhì)干細(xì)胞)表達(dá)Osterix，最終使MSC分化為前成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞[13].Osterix是一種成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，它只在骨組織發(fā)育階段和成骨細(xì)胞中表達(dá)[14].本研究中, bHGA對(duì)Runx2基因mRNA表達(dá)影響不大，但是對(duì)Osx的表達(dá)具有一定的抑制作用，這表明bHGA是不利于充質(zhì)干細(xì)胞分化形成早期成骨細(xì)胞，具體作用機(jī)制尚不明確.

骨相關(guān)基因在骨基質(zhì)形成過程中起著關(guān)鍵作用[15].本研究發(fā)現(xiàn)，bHGA顯著的促進(jìn)I型膠原和骨鈣蛋白的表達(dá).I型膠原是骨的主要有機(jī)成分，骨鈣蛋白也是成骨晚期表達(dá)的主要成分之一[16].因此，bHGA對(duì)于成骨晚期具有顯著的促進(jìn)作用.

堿性磷酸酶活性是早期成骨細(xì)胞的標(biāo)志之一[17]，在成骨早期高度表達(dá)，隨后會(huì)逐漸降低表達(dá)水平.在研究bHGA對(duì)堿性磷酸酶mRNA表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，bHGA對(duì)堿性磷酸酶mRNA具有顯著的抑制作用，但bHGA對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性無明顯影響.說明bHGA可能通過調(diào)控堿性磷酸酶mRNA表達(dá)之外的其他途徑調(diào)控堿性磷酸酶活性.

綜上研究結(jié)果表明：bHGA對(duì)成骨的晚期，即骨基質(zhì)的形成和鈣化具有顯著的促進(jìn)作用，但是在其應(yīng)用的早期會(huì)對(duì)基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，以及成骨細(xì)胞早期的活性有一定的不利影響.

參考文獻(xiàn)

[1]鐘芳芳, 傣藥人面果樹皮的化學(xué)成分與生物活性研究[D]. 武漢：中南民族大學(xué), 2008.

[2]林艷芳, 依專, 趙應(yīng)紅.中國傣醫(yī)藥彩色圖譜[M]. 昆明: 云南民族出版社, 2003: 5.

[3]Wu Yunhua,Yang Guangzhong.Interaction between garcigenrin and DNA by spectrophotometry and fluorescence spectroscopy[J]. Spectrosc Lett, 2010, 43(1):28-35.

[4]Deng Tiezhong, Ai Yong, Chen Yu, et al. Triterpenoid fromGarciniaxanthochymus[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2009, 44(8): 891-894.

[5]王朝元，胡蝶.玉柏石松甾體化合物對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的活性的影響[J].中南民族大學(xué)(自然科學(xué)版)，2014，33(2)：22-27.

[6]王朝元，易繼凌，宋超，等.綠原酸對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞活性的影響[J].中南民族大學(xué)(自然科學(xué)版)，2013(2)：46-50.

[7]Lee S U, Park S J, Han B K, et al. Anabolic activity of ursolic acid in bone: Stimulating osteoblast differentiationinvitroand inducing new bone formationinvivo[J]. Pharmacol Res, 2008(5/6), 58: 290-296.

[8]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[9]Fisher L W, Termine J D. Noncollagenous proteins influencing the local mechanisms of calcification[J]. Clin Orthop Relat Res, 1985(200): 362-385.

[10]Mundlos S. Mutations involving the transcription factor CBFA1 cause cleidocranial dysplasia[J]. Cell, 1997, 89(5): 773-779.

[11]Nakashima K, Zhou X, Kunkel G, et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation[J]. Cell, 2002, 108(1): 17-29.

[12]Ohyama Y, Nifuji A, Maeda Y, et al. Spaciotemporal association and bone morphogenetic protein regulation of selerostin and ostetix expression during embryonic esteogenesis[J]. Endocrinology, 2004,10 (145): 4685-4692.

[13]Sun D M, Liu Z B, Zhao Y, et al. Runx2 is involved in regulating osterix promoter activity and gene expression[J]. Prog Biochem Biophys, 2006, 33(10): 957-964.

[14]Pockwinse S M, Wilming L G, Conlon D M, et al. Expression of cell growth and bone specific genes at single cell resolution during development of bone tissue-like organization in primary osteoblast cultures[J]. Cell Biochem, 1992, 49: 310-323.

[15]Fisher L W, Termine J D. Noncollagenous proteins influencing the local mechanisms of calcification[J]. Clin Orthop Relat Res, 1985, 200(200): 362-385.

[16]Raisz L G, Fall P M. Effects ofprostaglandinE2 on bone formation in cultured fetal rat calvariae: roleofinsulin-like growth factor-I[J]. Endocrinology, 1993, 133(4): 1504-1510.

[17]Effenberger K E, Johnsen S A, Monroe D G, et al. Regulation of osteoblastic phenotype and gene expression by hop-derived phytoestrogens[J]. Steroid Biochem Mol Biol, 2005, 96(5): 387-399.

Effects of bHGA on Activity of Cultured Osteoblastsinvitro

WangChaoyuan,LiuLiangliang

(College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

AbstractTo study the potential osteogenetic activity of 12b-hydroxy-des-D-garcigerr in A (bHGA)invitro, MC3T3-E1 was treated with bHGA and the alkaline phosphatase activity, mineralization, the expression of bone-related genes and the early osteogenic differentiation-related genes of MC3T3-E1 cells were measured. The results showed that the mRNA expression ofRunx2 was generally not affected by bHGA, however, it inhibited the mRNA expression ofOsx. bHGA promoted the expression ofOCNandCol1 but inhibited the mRNA expression ofAPL.OPNexpression was not affected by bHGA. Our study demonstrated that bHGA was not conductive to the early differentitation of bone, while it might stimulate bone maturation by enhancingOCNandCol1 mRNA expression.

Keywords12b-hydroxy-des-D-garcigerrin A; osteogenic activity; bone-related genes; osteogenic differentiation-related genes

收稿日期2015-12-09

作者簡介王朝元(1964-),男，教授,博士,研究方向:生物醫(yī)學(xué)工程,E-mail: wangchaoyuan@mail.scuec.edu.cn

基金項(xiàng)目湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013CFB450)

中圖分類號(hào)Q28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1672-4321(2016)02-0031-05