陳思禮，吳匯蘭，陳　潔

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

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魚腥藻PCC7120質(zhì)粒上毒素-抗毒素基因?qū)lr9029/asr9028的初步研究

陳思禮，吳匯蘭，陳潔

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

摘要指出了大腸桿菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)(TAs)能介導(dǎo)解離后致死機(jī)制維持細(xì)菌質(zhì)粒的穩(wěn)定性和參與環(huán)境脅迫誘導(dǎo)細(xì)菌生長抑制或死亡，在魚腥藻PCC7120質(zhì)粒上的基因?qū)lr9029/asr9028具有與TA系統(tǒng)較高的同源性.為了證實(shí)該基因?qū)儆赥A系統(tǒng)，通過生物信息學(xué)分析了alr9029/asr9028的遺傳結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增得到大小為198 bp的asr9028和387 bp的alr9029. PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Hind Ш 雙酶切后被插入pMD18-T和pET-30a中，依次構(gòu)建克隆載體和表達(dá)載體. 經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，含有His6標(biāo)簽的表達(dá)蛋白相對(duì)分子量分別為12.4 kDa和19.2 kDa，且為可溶性蛋白. 故初步認(rèn)定asr9028為抗毒素基因，alr9029為毒素基因，二者共同構(gòu)成一個(gè)TA系統(tǒng).

關(guān)鍵詞魚腥藻PCC7120；TA系統(tǒng)；alr9029；asr9028

TA系統(tǒng)廣泛存在于原核生物體中，由分別編碼穩(wěn)定的、具有功能的毒素蛋白和不穩(wěn)定抗毒素蛋白的兩個(gè)基因組成[1].毒素主要在轉(zhuǎn)錄、翻譯及膜結(jié)構(gòu)的形成過程中發(fā)揮作用，而抗毒素蛋白能通過與毒素形成復(fù)合體而抑制其毒性[2].普遍認(rèn)為質(zhì)粒上的TA系統(tǒng)能介導(dǎo)解離后致死機(jī)制使質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳或抵抗不相容質(zhì)粒的入侵[3-5]，而染色體上的TA系統(tǒng)是基因水平轉(zhuǎn)移進(jìn)化而來[6,7]，盡管推測(cè)II型系統(tǒng)是壓力應(yīng)答模塊，尚無充分證據(jù)證明這一推論.

隨著大量生物體全基因組的完成和公布，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在魚腥藻PCC7120的染色體和質(zhì)粒上存在著大量的TA系統(tǒng)，但只有極少數(shù)TA系統(tǒng)被鑒定，且相關(guān)功能的研究進(jìn)展緩慢.分析魚腥藻PCC7120質(zhì)粒上的TA系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒Epsilon上基因?qū)lr9029-asr9028與大腸桿菌中的Phd-Doc家族同源，alr9029具有Doc的保守結(jié)構(gòu)域，而asr9028有RHH1結(jié)構(gòu)域可與DNA結(jié)合，故推測(cè)alr9029-asr9028屬于TA家族.本文分別克隆了asr9028基因和alr9029基因，并插入帶有His6融合標(biāo)簽的載體pET-30a中構(gòu)建了表達(dá)載體并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，初步研究了其相關(guān)分子生物學(xué)的特征，旨在完善魚腥藻TA系統(tǒng)鑒定，為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1材料和儀器

PCC7120(Anabaenasp.PCC7120) 購于中國科學(xué)院水生生物研究所，由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病原分子生物學(xué)研究室保存，在BG 11培養(yǎng)基中26 ℃和100 μmol photons/(m2·s)的光照條件下靜置培養(yǎng).E.coli菌株 DH5α、BL21 (DE3)、載體pET-30a (+) 由本實(shí)驗(yàn)室保存.載體pMD-18T、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和Hind Ш、DNA聚合酶、T4連接酶、DNA Mark DL2000、DL5000(TaKaRa公司).抗生素(Biosharp公司)，氨芐青霉素100 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL.引物的合成和相關(guān)基因測(cè)序由Genescript(Nanjing) Co., Ltd公司完成.

雙人超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD型, 蘇州凈化設(shè)備有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(5810R, 5417R, Eppendorf)，空氣浴振蕩器(HZQ-C型, 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠)，水平電泳儀(DYCP-31BN, 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)，垂直電泳儀(JKY-700型, 寧波江南儀器廠公司).

1.2同源基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)已鑒定的細(xì)菌TA系統(tǒng)的基因序列及TA系統(tǒng)的遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在NCBI中對(duì)魚腥藻PCC7120的基因組進(jìn)行檢索和分析，確定目的基因的位置和結(jié)構(gòu)，并利用CDD和UniProt對(duì)其蛋白的保守性及相關(guān)蛋白分子性能進(jìn)行在線分析.

1.3引物設(shè)計(jì)和目的基因PCR

已從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得目的基因asr9028和alr9029的基因序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則利用Oligo7.0獲得表1中兩對(duì)引物. 以魚腥藻PCC7120基因組為模板，引物asr9028-F和asr9028-F擴(kuò)增asr9028基因，alr9029-F和alr9029-R擴(kuò)增alr9029基因，通過降落式PCR擴(kuò)增得到目的片段，經(jīng)DNA回收試劑盒純化后回收，于-20 °C保存?zhèn)溆?

PCR程序如下：94 ℃ 4 min預(yù)變性；94 ℃ 1 min變性，51 ℃(0.5↓) 1 min退火，72 ℃ 40 s延伸，10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 1 min變性，48 ℃ 1 min退火，72 ℃ 40 s延伸，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min.

表1　引物序列

1.4克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

將目的片段與克隆載體PMD18-T連接并分別轉(zhuǎn)化到由CaCl2法制備的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在涂有氨芐青霉素(100 μg/mL)的固體培養(yǎng)基上經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲得陽性重組菌，菌落PCR及測(cè)序檢驗(yàn)正確后保留菌種.隨后，用BamHⅠ和Hind Ш對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶將目的片段連接到pET-30a的相應(yīng)酶切位點(diǎn)上構(gòu)建pET-30a-asr9028和pET-30a-alr9029，經(jīng)卡那霉素(50 μg/mL)固體平板篩選、雙酶切檢驗(yàn)及測(cè)序正確后獲得重組表達(dá)載體.

1.5在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)

為了分析毒素抗毒素的表達(dá)情況，用終濃度50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)pET-30a-asr9028和pET-30a-alr9029，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)菌體濃度OD600至0.4～0.6，加入0.8 mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá).誘導(dǎo)條件在以往實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上改良，37 ℃、220 r/min誘導(dǎo)8 h[8].

1.6蛋白樣品處理

全菌樣品處理：收集1 mL菌液，12000 r/min離心5 min后棄上清950 mL，加入1×上樣Buffer混勻，沸水浴3 min后靜置冷卻至室溫，12000 r/min離心15 min，取上清8 μL點(diǎn)樣. 上清蛋白樣品處理：12000 r/min離心5 min收集5 mL菌體，用PBS buffer懸浮清洗2次.超聲波破碎細(xì)胞：200 W超聲1 s，間隔1 s，破碎15 min.12000 r/min離心30 min后收集上清蛋白裂解物，沉淀用200 μL無菌水重懸，渦旋混勻.將上清和沉淀分別加入50 μL 5×上樣Buffer混勻，沸水浴煮6 min，冷卻后12000 r/min離心15 min，取上清10 μL點(diǎn)樣.

2結(jié)果與分析

2.1alr9029-asr9028基因序列分析

對(duì)魚腥藻PCC7120基因組數(shù)據(jù)庫分析顯示：基因?qū)lr9029-asr9028位于Epsilon質(zhì)粒上(見圖1)，asr9028的開放閱讀框?yàn)?98 bp，位于其下游384 bp的閱讀框?yàn)閍lr9029.兩閱讀框之間有兩個(gè)堿基間隔且表達(dá)方向相同.其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與II型TA系統(tǒng)phd-doc家族相似，典型的II型TA系統(tǒng)由兩個(gè)基因組成，受控制于同一個(gè)操縱子，上游基因編碼抗毒素，下游編碼毒素[2].在數(shù)據(jù)庫中顯示：兩個(gè)目的基因表達(dá)的蛋白均為假定蛋白，但通過CDD的蛋白質(zhì)同源序列在線分析顯示(見圖2)，alr9029與細(xì)菌Doc家族具有相同保守序列，預(yù)測(cè)alr9029為毒素基因.而asr9028含有Ribbon-helix-helix 蛋白結(jié)構(gòu)域，可能是DNA結(jié)合蛋白.目前研究最透徹的Phd-Doc家族是大腸桿菌溶原噬菌體P1上的Phd和Doc蛋白.Phd蛋白在溶液中內(nèi)在無序，其N端與Phd-Doc上游啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控蛋白表達(dá)，C端與Doc的α螺旋緊密結(jié)合，形成異源三聚體抑制毒性作用[9-11].根據(jù)UniProt預(yù)測(cè)asr9028的編碼產(chǎn)物為65個(gè)氨基酸，分子量為7402，等電點(diǎn)為4.52，具有良好的水溶性；alr9029的編碼產(chǎn)物為127個(gè)氨基酸，分子量為14188，等電點(diǎn)為4.8.兩蛋白在生理?xiàng)l件下的電荷特點(diǎn)顯示，asr9028和alr9029的編碼產(chǎn)物通過靜電引力相互作用的可能性不大，其形成復(fù)合體的方式可能與Phd-Doc相似，通過折疊互補(bǔ)產(chǎn)生.

箭頭所示asr9028和alr9029轉(zhuǎn)錄方向 ; MYPU_4040 : Mycoplasma pulmonis UAB CTIP ; Br16M : Brucella melitensis bv. 1 str. 16M ;CaCB15: Caulobacter crescentus CB15 ; NeMC58 : Neisseria meningitidis MC58 ; PA0053: Pseudomonas aeruginosa PAO1 ;SP_0889: Streptococcus pneumoniae TIGR4 ; SaLT2 : Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium str. ;ViN16961: Vibrio cholerae O1 biovar El Tor str. N16961 ;YPO1833 : Yersinia pestis CO92 ; Nalr9029: Nostoc sp.PCC 7120a) alr9029-asr9028遺傳結(jié)構(gòu)示意圖; b) Alr9029與毒素蛋白doc保守序列比對(duì)圖1　asr9028和alr9029在PCC7120的Epsilon質(zhì)粒上的遺傳結(jié)構(gòu)圖Fig.1　Genetic construct map of asr9028and alr9029 on plasmid Epsilon of PCC7120

2.2表達(dá)載體的成功構(gòu)建

為了研究asr9028和alr9029的分子特性，PCR擴(kuò)增兩個(gè)基因，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由于引物設(shè)計(jì)時(shí)添加酶切位點(diǎn)，故預(yù)期的片段長度要增加10多個(gè)堿基，asr9028約為210 bp，alr9029約為400 bp (見圖2).結(jié)果表明：基因片段的實(shí)際大小與預(yù)期片段大小相符.

M) Mark DL2000; 1) 400 bp的alr9029; 2) 210 bp的asr9028圖2　基因?qū)lr9029-asr9028 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)Fig.2　Electrophoresis identification of alr9029-asr9028 PCR products

擴(kuò)增得到目的片段后，將其直接連接到pMD18-T上，將氨芐青霉素和藍(lán)白斑篩選得到的陽性克隆.選取BamH I和Hind Ш兩個(gè)酶切位點(diǎn)對(duì)的陽性克隆進(jìn)行雙酶切，電泳(見圖3)結(jié)果顯示，得到約210 bp和400 bp大小的片段，測(cè)序結(jié)果100%相同，表明克隆重組菌構(gòu)建成功.回收上述經(jīng)雙酶切的目的片段后經(jīng)T4連接酶連接過夜，使片段連接到pET-30a的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再轉(zhuǎn)化到BL21中，經(jīng)卡那霉素固體培養(yǎng)基篩選得到陽性重組菌.經(jīng)雙酶切檢驗(yàn)(見圖4)和測(cè)序證明，pET-30a-asr9028和pET-30a-alr9029兩個(gè)表達(dá)載體已構(gòu)建成功.

M) DL5000; 1) 210 bp的asr9028; 2) 400 bp的alr9029圖3　 asr9028/alr9029克隆載體雙酶切電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.3　Electrophoresis identification of asr9028/alr9029 cloningvector by double enzyme digestion

M) DL5000；1) 400 bp的alr9029；2) 210 bp的asr9028圖4　asr9028/alr9029表達(dá)載體雙酶切電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.4　Electrophoresis identification of asr9028/alr9029 expressionvector by double enzyme digestion

2.3蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

活化表達(dá)重組菌，目的片段位于T7啟動(dòng)子的控制下，用1 mM/L IPTG誘導(dǎo)8 h進(jìn)行體外表達(dá)，全菌SDS-PAGE(見圖5)表明：毒素、抗毒素蛋白在37 ℃、220 r/min、1 mM IPTG誘導(dǎo)條件下均能表達(dá)，但alr9029的表達(dá)水平明顯比asr9028表達(dá)水平低，初步認(rèn)定Alr9029為毒素蛋白.根據(jù)UniProt蛋白質(zhì)在線預(yù)測(cè)可知，Asr9028的分子量為7.402 KDa，Alr9029的分子量為14.188 KDa.由于蛋白一端添加了His6融合標(biāo)簽，故蛋白大小約增加5 KDa，實(shí)際檢測(cè)到的大小應(yīng)約為抗毒素蛋白12.4 KDa，毒素蛋白19.2 KDa，與圖5中蛋白條帶位置一致.

M) 蛋白Mark；1) 空載體空白對(duì)照；2) 誘導(dǎo)pET-30a-alr9029表達(dá)結(jié)果；3) 誘導(dǎo)pET-30a-asr9028表達(dá)結(jié)果圖5　IPTG誘導(dǎo)pET-30a-alr9029/asr9028表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.5　SDS-PAGE identification of TPTG induced pET-30a-alr9029/asr9028 expression

為進(jìn)一步驗(yàn)證毒素、抗毒素蛋白為可溶性蛋白，利用超聲波法破碎細(xì)胞，收集獲得蛋白裂解液，對(duì)上清及沉淀蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析(見圖6).如圖6所示，上清樣品能清楚看到毒素和抗毒素蛋白，說明毒素、抗毒素蛋白均為可溶性蛋白.

M) 蛋白Mark；1) pET-30a-asr9028上清蛋白；2) pET-30a-alr9029上清蛋白；3) pET-30a-asr9028沉淀蛋白；4) pET-30a-alr9029沉淀蛋白圖6　Asr9028和Alr9029可溶性分析SDS-PAGEFig.6　SDS-PAGE identification of Asr9028 and Alr9029 solublity

3討論

本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了PCC7120 Epsilon質(zhì)粒上的alr9029/asr9028基因?qū)儆诙舅乜苟舅叵到y(tǒng)，并設(shè)計(jì)了特異性引物，采用降落式PCR擴(kuò)增目的基因，構(gòu)建相應(yīng)的克隆和表達(dá)載體，測(cè)序正確后，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，分析蛋白分子的基本特性. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)alr9029的表達(dá)載體構(gòu)建較為困難，即使在經(jīng)過卡那霉素篩選和雙酶切驗(yàn)證之后仍不能保證該重組菌的正確性.重復(fù)測(cè)序結(jié)果表明：alr9029的堿基突變率明顯高于asr9028，推測(cè)可能與毒素基因的穩(wěn)定性有關(guān).

pET-30a-asr9028和pET-30a-alr9029轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21后，在1 mM IPTG、37 ℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)，全菌SDS-PAGE檢測(cè)獲得約12.4 KDa和19.2 KDa的His6融合型蛋白，但Alr9029的表達(dá)量明顯低于Asr9028，預(yù)示Alr9029為毒素蛋白. Alr9029具有Doc家族的保守結(jié)構(gòu)，Doc不同于其他mazEF家族通過核酸酶作用裂解mRNA，Doc通過與核糖體30s亞基結(jié)合抑制翻譯的延伸，抑制細(xì)胞生長[12].上清和沉淀蛋白分別經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示：在上清組分中都存在Asr9028和Alr9029，說明兩蛋白均為可溶性蛋白，沉淀組分中存在Asr9028，估計(jì)未能將蛋白完全從沉淀中分離.

TA系統(tǒng)廣泛存在于原核生物的染色體及質(zhì)粒上，不同種屬來源的TA家族同源程度存在差異，但遺傳結(jié)構(gòu)和功能非常相似.序列分析結(jié)果表明：alr9029編碼產(chǎn)物與Doc同源，但asr9028編碼產(chǎn)物含有RHH1結(jié)構(gòu)且與Phd的同源性較低，由于目前對(duì)Phd-Doc家族的認(rèn)識(shí)有限，故該基因?qū)κ欠窬哂蠵hd-Doc家族相同的生理功能和作用方式尚待深入研究.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)研究、蛋白質(zhì)相互作用、毒素蛋白靶標(biāo)定位等研究奠定了基礎(chǔ). 鑒于毒素與抗毒素家族之間可能存在的交叉作用，可進(jìn)一步從蛋白質(zhì)組學(xué)水平上完善TA系統(tǒng)的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控.

參考文獻(xiàn)

[1]Yamaguchi Y, Park J H, Inouye M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea[J]. Annu Rev Genet, 2011, 45:61-79.

[2]Pandey D P, Gerdes K. Toxin-antitoxin loci are highly abundant in free-living but lost from host-associated prokaryotes[J]. Nucleic Acids Res, 2005, 33(3): 966-76.

[3]Yarmolinsky M B. Programmed cell death in bacterial populations[J]. Science, 1995, 267(5199): 836-837.

[4]Gerdes K, Rasmussenb P B , Molin S. Unique type of plasmid maintenance function: postsegregational killing of plasmid-free cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1986, 83(10): 3116-3120.

[5]Cooper T F ,Heinemann J A. Postsegregational killingdoes not increase plasmid stability but acts to mediate the exclusion of competing plasmids[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(23): 12643-12648.

[6]Leplae R, Geeraerts D , Hallez R, et al. Diversity of bacterial type II toxin-antitoxin systems: a comprehensive search and functional analysis of novel families[J]. Nucleic Acids Res, 2011, 39(13):5513-25.

[7]Koonin E V , Wolf Y I. Genomics of bacteria and archaea: the emerging dynamic view of the prokaryotic world[J]. Nucleic Acids Res, 2008, 36(21): 6688-719.

[8]陳思禮, 梅菊. 魚腥藻 PCC7120 染色體上relBE同源基因的克隆及表達(dá)[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012, 31(1): 16-19.

[9]McKinley J E , Magnuson R D.Characterization of the Phd repressor-antitoxin boundary[J]. J Bacteriol, 2005,187(2):765-770.

[10]Smith J A ,Magnuson R D.Modular organization of the Phd repressor-antitoxin protein[J]. J Bacteriol,2004, 186(9): 2692-2698.

[11]Gazit E ,Sauer R T.The Doc toxin and Phd antidote proteins of the bacteriophage P1 plasmid addiction system form a heterotrimeric complex[J]. J Biol Chem,1999, 274(24): 16813-8.

[12]Liu M, Zhang Y, Inouye M, et al. Bacterial addiction module toxin Doc inhibits translation elongation through its association with the 30S ribosomal subunit[J]. PNAS, 2008, 105(15): 5885-5890.

Preliminary Study of a Pair of Toxin-Antitoxin Gene alr9029/asr9028 in Plasmid of Anabaena sp.PCC7120

ChenSili,WuHuilan,ChenJie

(College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

AbstractToxin-Antitoxin systems(TAs) inE.colican mediate post-segregational killing to maintain the stability of plasmids and induce bacterial growth inhibition or death responding to environmental stresses. Gene pairalr9029/asr9028 in plasmid ofAnabaenasp.PCC7120 is homologous with TAs. To verify that the genes belong to TAs, bioinformatic techniques were used to analyze the genetic structure ofalr9029/asr9028. The specific primers were designed to amplify target genesasr9028 with 198 bp andalr9029 with 387 bp by PCR. The products were inserted into pMD18-T and pET-30a by double digestion ofBamH I andHind Ш to construct clone and expression vectors successively. SDS-PAGE showed that the molecular weights of the expressed proteins with His6 tag were 12.4 kDa and 19.2 kDa respectively, and both were soluble. It was preliminarily determined that the gene pairalr9029-asr9028 constructed a toxin-antitoxin system, withasr9028 as antitoxin andalr9029 as toxin.

KeywordsAnabaenasp.PCC7120; toxin-antitoxin system;alr9029;asr9028

收稿日期2015-09-14

作者簡(jiǎn)介陳思禮(1955-)，男，教授，博士，研究方向：分子病院生物學(xué)，E-mail: sili.chen@163.com

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31001099/C190101)；中央高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(CJSl3003,CJS13004)；中南民族大學(xué)微生物與生物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(XJS09002)

中圖分類號(hào)Q71

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1672-4321(2016)02-0026-05