胡遠亮， 洪　文， 譚光迅

(1 湖北師范大學 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，黃石 435002； 2 華中農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070；3 湖北枝江酒業(yè)股份有限公司，枝江 443200)

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產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選與鑒定

胡遠亮1, 2， 洪文1，*， 譚光迅3

(1 湖北師范大學 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，黃石 435002； 2 華中農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070；3 湖北枝江酒業(yè)股份有限公司，枝江 443200)

摘要從自然界中采集土壤樣品，通過富集培養(yǎng)，平板分離，殼聚糖酶活力及粘度快速測定，獲得了3 株高活力產(chǎn)殼聚糖酶菌株. 采用薄層層析(TLC)分析了酶解產(chǎn)物，結果表明：水解產(chǎn)物中均含有殼寡糖. 結合形態(tài)、生理生化特征鑒定及16S rDNA序列分析，初步確定其為Mitsraria(屬)的一種.

關鍵詞殼聚糖；殼聚糖酶；菌株篩選；細菌鑒定

甲殼素(Chitin)脫去55%以上N-乙酰基時，通常稱之為殼聚糖(Chitosan). 甲殼素、殼聚糖在自然界中大量存在，年產(chǎn)量近100億 t，是地球上含量僅次于纖維素的天然高分子化合物.

殼聚糖酶能特異性作用于殼聚糖的β- (1,4)-糖苷鍵，產(chǎn)物為低分子量的水溶性殼聚糖.水溶性殼聚糖具有良好的生物相容性、吸附性、抗菌性和抗毒性，目前已經(jīng)廣泛應用于農(nóng)業(yè)、環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領域[1].

殼聚糖酶主要存在于細菌和真菌細胞中. 近年來，研究人員已經(jīng)從自然環(huán)境中篩選出并研究了Pseudomonas[2],Penicillium[3],Mmucor[4],Mitsuariachitosanitabida[5]等產(chǎn)殼聚糖酶菌株.本文分離出3株產(chǎn)殼聚糖酶高活力菌株，分析菌株的形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列，進行初步鑒定.

1材料與方法

1.1主要材料、試劑及培養(yǎng)基配方

氨基葡萄糖(GlcN·HCl)：武漢市華順生物技術公司；硅膠GF254：青島海洋化工廠.

殼聚糖：粉狀、不溶于水、脫乙酰度≥90%、分子量106萬，國藥集團.

PCR產(chǎn)物純化試劑盒：美國Omega Bio-Tek；PCR 反應體系試劑：美國Promega.

膠體殼聚糖：殼聚糖1 g，0.2 mol/L的鹽酸30 mL，85℃水浴10～12 h，完全溶解后，用1 mol/L NaOH緩慢調(diào)節(jié)至pH 5.0，加蒸餾水定容為1%和2%的溶液，121℃、滅菌30 min，4℃冷藏備用.

固體培養(yǎng)基配方：膠體殼聚糖0.5%，K2HPO40.2%，KH2PO40.1%，MgSO40.07%，NaCl 0.05%，CaCl20.01%，酵母粉0.05%，瓊脂 2%，pH 6.0.

富集培養(yǎng)液配方：膠體殼聚糖2%，K2HPO40.2%.

液體培養(yǎng)基M1配方：膠體殼聚糖0.5%，KH2PO40.03%，K2HPO40.07%， MgSO40.05%，酵母粉 0.03%，蛋白胨 0.03%，pH 6.0.

液體培養(yǎng)基M2配方：粉狀殼聚糖1%，其他與M1同.

1.2樣品采集

從富含纖維質(zhì)、幾丁質(zhì)(蝦、蟹)的自然環(huán)境中采集土壤樣品(如菜園，池塘污泥等)，取樣袋封存，并對取樣地點和土壤性質(zhì)作好記錄，當天稀釋處理、接種進行富集培養(yǎng).

1.3富集培養(yǎng)及平板初篩

將土壤樣品，用適量無菌水溶解，取0.5 mL，加至富集培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min 培養(yǎng)5 d. 取10-3、10-4、10-5稀釋培養(yǎng)液，均勻涂布于膠體殼聚糖平板上，28℃恒溫培養(yǎng)3 d，取周邊有透明圈且生長良好的單菌落，點接3次(呈等邊三角形)至殼聚糖平板上，培養(yǎng)3 d后，取出平板，測量菌落直徑(d)和菌落透明圈直徑(D)，用d值和D/d值為衡量指標，篩選出產(chǎn)殼聚糖酶能力強的菌株.

1.4復篩測定酶活力

將活化后的菌株，以1%接種至膠體殼聚糖培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min培養(yǎng)60 h，4000 r/min離心10 min，收集上清酶液. 1%膠體殼聚糖∶酶液∶pH 4.0檸檬酸緩沖液以1∶1∶2混合，測定酶活力[6].

1.5復篩烏氏粘度計快速測定

用蒸餾水將各菌株發(fā)酵液稀釋為酶活力0.5 U/mL，取1 mL，與1 mL 1%膠體殼聚糖溶液混合，37℃反應10 min，沸水浴5 min，立即用蒸餾水稀釋至10 mL，用烏氏粘度計快速測定，記錄流出時間Tn. 對照樣：先將酶液沸水浴5 min，使酶失活，再用上述方法處理，記錄時間T0. 根據(jù)根據(jù)公式ηr=Tn/T0來計算相對粘度[7].

1.6酶水解產(chǎn)物的薄層層析(TLC)分析

將1%膠體殼聚糖∶酶液∶pH 4.0檸檬酸緩沖液以1∶1∶2混合，反應60 min后，以1∶1加無水乙醇，4500 r/min離心10 min，取上清液，旋轉濃縮15～20倍，測定還原糖含量(DNS法)，并加入適量蒸餾水，至還原糖含量為2%. 以硅膠GF254板為層析板，正丙醇∶25%氨水=2∶1為層析液，0.1%茚三酮乙醇溶液為顯色劑，進行檢測[8].

1.7菌株的16S rDNA序列分析

提取純化細菌總 DNA , 上下游 PCR引物分別為P0(5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) 和PC3 (5′-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3′) . PCR程序為：預變性94℃、3 min，變性94℃、1 min，復性45℃、1 min，延伸72℃、1 min，循環(huán)30次，總延伸72℃、8 min. PCR產(chǎn)物采用Omega Bio-Tek試劑盒純化回收，測序由北京奧科生物技術有限公司完成，測序引物為P0、PC3. 序列提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫進行比對. 然后運用ClustalX 2.1 進行比對分析，利用 MEGA 5.0 軟件，采用Neighbor-Joining算法，構建系統(tǒng)發(fā)育樹.

2結果與分析

2.1富集培養(yǎng)及平板初篩

從自然界中采集42份土壤樣品，富集培養(yǎng)5 d觀察，有19個三角瓶中的富集培養(yǎng)液明顯變渾濁，且部分形成了密集的直徑約2～4 mm的菌絲球.

產(chǎn)殼聚糖酶的菌株會分解殼聚糖成透明狀小分子，在白色不透明的殼聚糖平板上形成了透明的水解圈. 菌株產(chǎn)酶活性越高，降解能力就越強，d值和D/d值就越大. 經(jīng)平板分離，19個樣品中，均有菌落長出. 部分菌落疏松，與霉菌特征吻合，周圍有明顯的不規(guī)則的透明區(qū)域. 更多菌落呈較規(guī)則的圓形，直徑約1～3 mm，含水量較高，為細菌特征，個別菌落周圍有較明顯的透明圈. 根據(jù)菌落生長情況及透明圈大小，從中挑選10株細菌，點接種進行平板分離篩選(圖1). (d值和D/d見表1)

圖1　菌株在平板上的形態(tài)特征Fig.1　The morphology of bacteria strains on the plate

2.2殼聚糖酶活力及烏氏粘度計快速測定

初篩精確度不高，通過三角瓶培養(yǎng)測定殼聚糖酶活力進行復篩. 復篩中，培養(yǎng)基M1以膠體殼聚糖作為主要碳源，而培養(yǎng)基M2直接添加粉狀殼聚糖作為碳源之一，分別考察菌株利用殼聚糖的能力(表1). 結果表明菌株141、252和282殼聚糖酶活力最高，分別為0.785、0.769、0.729 U/mL；在M1中，殼聚糖酶活力高于M2，其原因是膠體殼聚糖分子量已大大降低，菌體容易利用，生長較好，從而產(chǎn)酶量高. 而粉狀殼聚糖，菌體生長困難，導致產(chǎn)酶量低.

殼聚糖酶有外切和內(nèi)切之分，外切酶逐個將糖基切除，長鏈分子降解成低聚糖速度較慢，短時間內(nèi)粘度下降不明顯，而內(nèi)切酶，隨機切割，長鏈分子降解快，因此粘度降低幅度間接反映內(nèi)切酶特性[7]. 為進一步考察菌株的降解能力，同時挑選殼聚糖內(nèi)切酶活力高的菌株，采用烏氏粘度法測定篩選. 各菌株酶解的相對粘度見表1. 從表中可以看出，相對粘度均在0.412～0.551之間，大大降低，初步判斷均具有較高的內(nèi)切酶活力. 其中，菌株012、282和141降解速度最快，相對粘度分別為0.412、0.432和0.434.

表1　菌株篩選結果

綜合平板分離、殼聚糖酶活力及粘度快速測定結果，菌株013、141、282產(chǎn)酶能力相對較強，以此3株菌作為進一步研究對象.

2.3酶解產(chǎn)物的TLC分析

為了進一步確定內(nèi)切酶活力的存在，采用TLC分析了菌株酶解產(chǎn)物(圖2).

(s)GlcN·HCl;(a)013;(b)141;(c)282;(d)2%膠體殼聚糖圖2　 酶解產(chǎn)物的薄層層析分析Fig.2　TLC analysis of enzymatic hydrolysates

由圖知，(d)對照樣品無斑點，說明底物中不存殼寡糖或含量極低，(a)、(b)、(c)酶解樣品中，在GlcN下方均有兩斑點，可見樣品中含二糖或以上的寡糖. 產(chǎn)物中并無單糖，只有寡糖，說明菌株013、141和282具內(nèi)切殼聚糖酶活性.

2.4菌株形態(tài)與生理生化特征

菌株的形態(tài)及生理生化特征鑒定方法參照文獻[9]. 菌株013、141、282均為G-、不產(chǎn)芽孢、桿狀(長1.2～1.8 μm，寬0.4～0.6 μm)；典型菌落在殼聚糖平板上呈圓形、隆起，表面濕潤、光滑、白色，邊緣平整，周圍有透明水解圈. 其形態(tài)特征和生理生化指標見表2.

表2　形態(tài)特征及生理生化指標鑒定結果

注：“+ ”表示positive ,“- ”表示negative

2.5菌株16S rDNA序列分析

比對16S rDNA序列發(fā)現(xiàn)，菌株013、141和282與Mitsuaria屬的多株細菌相似性都達到99%以上，與該屬的Mitsuariachitosanitabida(NR_040786.1)相似性為100%、100%和99%，同源性最高. 調(diào)取GenBank 數(shù)據(jù)庫中代表性菌株16S rDNA序列，與菌株013、141和282的序列分析，構建進化樹，結果如圖3所示，這3個菌株與Mitsuariachitosanitabida3001 的親緣關系最為接近.

圖3　菌株 013、141和282的 16S rDNA 序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3　The phylogenetic tree of the strain 013, 141 and 282 based on 16S rDNA sequences

Mitsuaria是2005年建立的一個新屬，科名未建，歸屬于變形菌門Proteobacteria；β-變形桿菌綱Betaproteobacteria；伯克霍爾德氏目Burkholderiales[10]. 2005年命名了該屬第一個成員，模式種為Mitsuariachitosanitabida(“Mitsuaria”日本松江市的一個地名，“chitosanitabida”溶解殼聚糖之意). 該菌株為G-，不產(chǎn)芽孢，桿狀，可分泌殼聚糖酶，該酶分子量為34 kDa. 結合文獻中對Mitsuariachitosanitabida的形態(tài)學及生理生化特征描述[10,11]，初步確定3株菌歸屬于Mitsraria.

3結語

從自然界混雜的環(huán)境中分離出具某種特性的微生物，有很大的隨機性，建立一種快速、高通量的篩選方法較為關鍵. 水生甲殼類動物、節(jié)肢動物和軟體動物等的外殼中均富含殼聚糖. 從池塘等自然環(huán)境中采集土壤樣品，唯一碳源和氮源為殼聚糖的富集培養(yǎng)，抑制其他微生物的生長，目標菌株在培養(yǎng)液占據(jù)絕對優(yōu)勢.為進一步增強結果的可靠性，分別以膠體殼聚糖和粉狀殼聚糖作為培養(yǎng)基主要成分，測定酶活力，同時通過粘度快速檢測殼聚糖的水解速度，并對酶解產(chǎn)物進行TLC初步分析，提高了篩選工作效率 . 但本方法并不適合厭氧菌，而自然界中甲殼類物質(zhì)是在厭氧環(huán)境中完成降解的. 因此盡管這一篩選方案完整可靠，今后需要進一步改進完善.

變形桿菌的分類系統(tǒng)正在快速發(fā)展，假單胞菌屬近年來被劃分成為10多個屬，其中至少有7個是新屬[11]. 本文分離出的菌株013、141、282，與伯克霍爾德氏目的假單胞菌屬比較，在形態(tài)和生理生化特征上都十分相似，進一步補充了該屬的研究成果.

參考文獻

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Isolation and Identification of Chitosanase-Producing Bacterium

HuYuanliang1,2,HongWen1,TanGuangxun3

(1 Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation and Utilization, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China;2 State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;3 Zhijiang Liquor Industry Co. Ltd., Zhijiang 443200, China)

AbstractBased on the enrichment culture, plate isolation, determination of the activity of chitosanase and viscosity, three strains of bacteria with high chitosanase activity were isolated from soil samples. TLC analysis results showed that the chitooligosaccharides existed in the hydrolyzates of chitosan. Combined with the morphology, physiological and biochemical characterization, and 16S rDNA sequence analysis, the strains were classified intoMitsuaria.

Keywordschitosan; chitosanase; strain screening; bacterial identification

收稿日期2015-12-06通訊作者洪文(1979-),男，實驗師，研究方向：微生物學與植物資源學，E-mail:whongnice@foxmail.com

作者簡介胡遠亮(1982-)，男，博士后、講師，研究方向：應用微生物學，E-mail：yuanlianghu@yeah.net

基金項目湖北省自然科學基金資助項目(2015CFC797)；食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室開放基金資助項目(EWPL201512)

中圖分類號Q935

文獻標識碼A

文章編號1672-4321(2016)02-0042-04