張愛清，胡　慶，陳小隨，秦四勇

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 催化材料科學(xué)湖北暨國家民委-教育部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

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含銀水凝膠的制備及其用于創(chuàng)傷敷料的研究

張愛清，胡慶，陳小隨，秦四勇

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 催化材料科學(xué)湖北暨國家民委-教育部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074)

摘要指出了水凝膠是一類性能優(yōu)良的新型創(chuàng)傷敷料，它具有高吸收、保濕、易更換等優(yōu)點(diǎn).為賦予水凝膠抗菌性能，制備和研究了含有納米銀的羧甲基殼聚糖/氧化海藻酸鈉復(fù)合水凝膠.用硝酸銀溶液以檸檬酸三鈉為還原劑和海藻酸鈉為穩(wěn)定分散劑制得了納米銀膠體溶液，將不同含量的納米銀膠體溶液加至羧甲基殼聚糖水溶液和氧化海藻酸鈉水溶液的混合液中，制備了含有納米銀的水凝膠.通過紫外-可見光譜法、透射電鏡、抗菌和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行了檢測.結(jié)果表明：硝酸銀被還原成納米銀，納米銀顆粒的粒徑約為20 nm.當(dāng)水凝膠中納米銀濃度為16.67 μg/mL時(shí)，水凝膠能有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長.水凝膠對細(xì)胞毒性很低.故所制備的抗菌水凝膠有望用于創(chuàng)傷敷料.

關(guān)鍵詞天然高分子；納米銀；復(fù)合水凝膠；抗菌性能

水凝膠是一種三維立體、以化學(xué)鍵或物理交聯(lián)作用形成的親水性聚合物網(wǎng)絡(luò)，它既有液體的運(yùn)動性和流動性，又有固體的形穩(wěn)性[1].水凝膠敷料能提供較佳的透氣、透濕、阻隔細(xì)菌侵入以及控制和吸收滲出液等特性，使傷口處于良好細(xì)胞生長愈合環(huán)境.此外，水凝膠敷料能緊密貼附于傷口處，在更換敷料時(shí)不會沾黏傷口造成二次傷害，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用領(lǐng)域[2-4].

羧甲基殼聚糖(CMC)是殼聚糖經(jīng)羧甲基化反應(yīng)后的水溶性衍生物，羧基的引入大大改善了殼聚糖的水溶性，還使其成為一種既含有氨基又含有羧基的兩性高分子電解質(zhì)；海藻酸鈉經(jīng)高碘酸鈉氧化制得的氧化海藻酸鈉(OSA)具有雙醛基結(jié)構(gòu)，可作為交聯(lián)劑[5]，兩者經(jīng)共混又可使氨基與醛基發(fā)生希夫堿反應(yīng)形成化學(xué)交聯(lián)[6].納米銀作為無機(jī)抗菌材料，由于其原子排列表現(xiàn)介于固體和分子之間的“介態(tài)”，表現(xiàn)出量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和極大的比表面積，具有其他載銀無機(jī)抗菌材料無法比擬的抗菌活性，能有效地殺滅細(xì)菌、真菌、支原體等致病微生物[7-9].

本文以羧甲基殼聚糖/氧化海藻酸鈉為基材，制備了含有納米銀的水凝膠，通過紫外可見光譜(UV-Vis)法和透射電鏡(TEM)研究了水凝膠中納米銀結(jié)構(gòu)，并研究了水凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用及對小鼠成纖維細(xì)胞(L929)的細(xì)胞毒性.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料和儀器

殼聚糖(CTS, 分析純, 上海市如吉生物科技有限公司)，海藻酸鈉(SAA, 分析純, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，硝酸銀(AgNO3, 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，一氯乙酸(MCA, 分析純, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，高碘酸鈉(NaIO4, 分析純, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3·2H2O, 分析純, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

紫外可見光譜儀(UV-Vis, UV-2550型, SHIMADZU公司)，透射電鏡(TEM, FEI Tecnai G2 20S-Twin型, 200 kV)，倒置顯微鏡系統(tǒng)(DMIL, Leica公司)，恒溫培養(yǎng)箱(3111型, Thermo公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(354型, Thermo公司)，傅立葉紅外光譜儀(NEXUS-470, Nicolet公司).

1.2納米銀的合成

磁力攪拌下，在180 mLAgNO3溶液(0.0157 g AgNO3溶于180 mL去離子水, 即0.01 g Ag)中加入1 g海藻酸鈉，形成穩(wěn)定膠體溶液后，逐滴加入20 mL檸檬酸三鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%)，得到濃度為50 μg /mL淺黃色納米銀膠體溶液.

1.3制備含納米銀的水凝膠

將殼聚糖均勻分散在異丙醇中，經(jīng)NaOH堿化后，用一氯乙酸對殼聚糖進(jìn)行羧甲基化改性，得到水溶性良好的羧甲基殼聚糖；海藻酸鈉溶脹于水后，加入高碘酸鈉，避光反應(yīng)后得到具有雙醛基結(jié)構(gòu)的氧化海藻酸鈉.將羧甲基殼聚糖的水溶液10 mL和氧化海藻酸鈉的水溶液10 mL混合后常溫自交聯(lián)形成水凝膠，將不同體積的納米銀膠體溶液分別加入到水凝膠中，共混后制得含納米銀的水凝膠(見表1).

表1　水凝膠的配比

1.4FT-IR分析

羧甲基殼聚糖(CMC)，氧化海藻酸鈉(OSA)和交聯(lián)后的產(chǎn)物(CMC/OSA復(fù)合水凝膠)用傅立葉紅外光譜儀進(jìn)行FT-IR分析.

1.5UV-Vis分析

納米銀膠體溶液(50 μg/mL)用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行UV-Vis分析，在350～700 nm范圍內(nèi)掃描.

1.6TEM分析

樣品超聲分散后，用透射電鏡分析納米銀的形貌，觀察納米銀的尺寸.

1.7水凝膠的抗菌性能測試

參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行水凝膠的抗菌性能測試：稱取牛肉膏(0.5 g)、蛋白胨(1g)、NaCl(0.5g)、瓊脂(2 g)溶于100 mL蒸餾水，加熱融化，待溶液冷至室溫時(shí)，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.2，高壓滅菌約30 min.待溶液冷卻形成固體培養(yǎng)基，分別將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌涂布在固體培養(yǎng)基上制得平板.將水凝膠樣品用移液槍注入濾紙紙片上，于37℃恒溫培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈尺寸.

1.8水凝膠的細(xì)胞毒性測試

用MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞毒性測試[11]：收集對數(shù)期L929細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，接種于96孔板，每孔加入100 μL，鋪板使7901細(xì)胞調(diào)密度 1000 ～10000 /孔(孔板邊緣用PBS填充).5% CO2，37℃孵育，至L929細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物， L929細(xì)胞貼壁后即可加藥.5個(gè)梯度(4.63, 3.70, 2.78, 1.85,0.93 μM)，每孔200 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，5%CO2，37 ℃孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察，加入含MTT的培養(yǎng)液，每孔加入100 mL MTT溶液(5 mg/mL,用培養(yǎng)基稀釋)，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩30 s，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀處測量各孔的吸光值OD492.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，各組細(xì)胞相對生長率RGR(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD492/對照孔OD492)×100%.

2結(jié)果與討論

2.1納米銀的合成

在合成納米銀的合成過程中，加入了生物相容性較好的海藻酸鈉作為分散保護(hù)劑，并采用劇烈攪拌.海藻酸鈉在還原硝酸銀并制備納米銀過程中起重要作用[12]：海藻酸鈉附著在納米銀顆粒表面，阻止了納米銀發(fā)生團(tuán)聚，起到了分散穩(wěn)定的作用.

圖1為合成納米銀反應(yīng)溶液的UV-Vis譜圖，在波長為422 nm處出現(xiàn)了一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，歸屬于納米銀的等離子共振吸收峰[13]，說明在檸檬酸三鈉的還原作用和海藻酸鈉的分散穩(wěn)定作用下，硝酸銀被還原成納米銀.

λ/nm圖1　納米銀膠體溶液的UV-Vis圖Fig.1　UV-Vis spectrum of the silver nanoparticle’s dispersion

2.2含納米銀水凝膠的制備

羧甲基殼聚糖(CMC)是殼聚糖經(jīng)羧甲基化反應(yīng)后的水溶性衍生物，羧基的引入一方面大大改善了殼聚糖的水溶性，另一方面使其成為一種既含有氨基又含有羧基的兩性高分子電解質(zhì)；海藻酸鈉經(jīng)高碘酸鈉氧化制得的氧化海藻酸鈉(OSA)具有雙醛基結(jié)構(gòu)，可作為交聯(lián)劑，兩者經(jīng)共混能使氨基與醛基發(fā)生希夫堿反應(yīng)形成化學(xué)交聯(lián)[6].由于殼聚糖和海藻酸鈉鏈上有很多羥基，羥基是親水基，以上兩方面作用使交聯(lián)結(jié)構(gòu)伸展，在常溫下自交聯(lián)形成水凝膠.

制備所得的水凝膠具有與常見水凝膠類似的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該水凝膠的溶脹性能取決于羧甲基殼聚糖和氧化海藻酸鈉的交聯(lián)結(jié)構(gòu)的伸展程度，越容易伸展水凝膠的溶脹率越高，室溫下在蒸餾水中約40 min后，水凝膠的溶脹率基本達(dá)到恒定值，溶脹率約為500%.該水凝膠的機(jī)械性能較差，用力擠壓可將水凝膠壓碎，故用作創(chuàng)傷敷料時(shí)需用醫(yī)用膠帶固定.以羧甲基殼聚糖/氧化海藻酸鈉為基材所制備得一系列含納米銀的水凝膠見如圖2(圖2a為水凝膠照片，圖2b為納米銀溶液照片).

圖2　水凝膠及納米銀溶液照片F(xiàn)ig.2　The photos of hydrogels and sliver nanoparticles

2.3水凝膠基材的紅外分析

CMC的FT-IR結(jié)果(見圖3)中，3420 cm-1處強(qiáng)而寬的吸收峰歸屬于-OH與-NH的伸縮振動吸收，2940 cm-1與2880 cm-1處歸屬于-CH2中-C-H的不對稱與對稱伸縮振動；1600 cm-1與1420 cm-1處分別屬于COO-不對稱與對稱伸縮振動；1075 cm-1處歸屬于-C-O-C的伸縮振動.OSA的FT-IR圖中，1735 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，歸屬于-C=O的伸縮振動峰，證明醛基的生成；水凝膠的FT-IR圖中，1650 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，歸屬于-C=N的伸縮振動，表明羧甲基殼聚糖與含雙醛基的氧化海藻酸鈉之間產(chǎn)生了交聯(lián)，有希夫堿生成.同時(shí)，3420 cm-1處-OH與-NH的伸縮振動吸收峰分裂為兩個(gè)峰3450 cm-1與3410 cm-1，進(jìn)一步說明一部分氨基與雙醛基發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng).

圖3 羧甲基殼聚糖、氧化海藻酸鈉及水凝膠的紅外譜圖分析Fig.3　FT-IR pattern of CMC、OSA and hydrogel

2.4水凝膠中納米銀的形貌分析

通過TEM方法對溶膠狀態(tài)下的納米銀膠體溶液的形貌進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4所示，納米銀顆粒因穩(wěn)定劑海藻酸鈉的保護(hù)下分散良好，無團(tuán)聚現(xiàn)象.納米銀顆粒為實(shí)心球體，納米銀的粒徑約為20 nm.

圖4　納米銀膠體溶液的TEM圖Fig.4　TEM pattern of the n-Ag colloidal solution

2.5水凝膠的抗菌性能測試

對水凝膠的抗菌性能進(jìn)行了測試，結(jié)果如圖5所示，抑菌圈尺寸列于表2.由圖5可見，抑菌圈直徑隨水凝膠中納米銀含量的增加而增大，抑菌圈直徑的大小決定了水凝膠抗菌性能的強(qiáng)弱，隨著水凝膠中納米銀含量的增大，對大腸桿菌(Escherichiacoli)的抑制作用和對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑制作用均越來越強(qiáng)，在納米銀濃度為16.67 μg/mL時(shí)，抑制作用均達(dá)到最大值，水凝膠對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用高于大腸桿菌[14].故該抗菌水凝膠在皮膚抗菌治療方面具有較好的應(yīng)用前景.

圖5　水凝膠抑菌照片F(xiàn)ig.5　The antibacterial photos of hydrogels

水凝膠抑菌圈尺寸/cm大腸桿菌金黃色葡萄球菌①0.720.93②0.791.02③0.851.11④0.881.17⑤0.911.20

注： 表2中①～⑤與表1中相對應(yīng)

2.6水凝膠的細(xì)胞毒性分析

對含納米銀的水凝膠的細(xì)胞毒性進(jìn)行測試，結(jié)果如圖6所示，由于重金屬Ag的存在，納米銀膠體溶液對L929細(xì)胞傷害極大，細(xì)胞的相對生長率(RGR)較低，在30%以下，最低只有7%[15]；而以羧甲基殼聚糖/氧化海藻酸鈉為基材的水凝膠包裹納米銀膠體溶液后形成的三元復(fù)合水凝膠的細(xì)胞毒性很低，細(xì)胞的相對生長率(RGR)達(dá)85%以上.由表3可知，與表2相對應(yīng)的5種含銀水凝膠的細(xì)胞毒性評級在0級和1級.故該抗菌水凝膠對動物細(xì)胞無毒副作用，可作為創(chuàng)傷敷料直接與皮膚接觸.

圖6　納米銀膠體溶液及含銀水凝膠的細(xì)胞毒性曲線Fig.6　The cytotoxicity curves of n-Ag colloidal solution and silver-doped hydrogel

水凝膠細(xì)胞毒性分析RGR/%細(xì)胞毒性評級①104.190②102.320③98.781④93.151⑤86.711

注： 表3中①～⑤與表1中相對應(yīng)

3結(jié)語

以羧甲基殼聚糖與氧化海藻酸鈉的希夫堿交聯(lián)產(chǎn)物為基材，制備出了一系列含有納米銀的抗菌水凝膠.UV-Vis分析結(jié)果表明：在檸檬酸三鈉的還原作用和海藻酸鈉的分散穩(wěn)定作用下，硝酸銀被還原成納米銀.透射電鏡測試結(jié)果證實(shí)了納米銀粒子的存在，并能直觀看到它以實(shí)心球體的形式分散，尺寸約為20 nm.水凝膠能有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，對動物正常細(xì)胞(L929)無毒性作用，故該抗菌水凝膠在皮膚外用治療方面具有良好的應(yīng)用前景.

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Preparation of Silver-Doped Hydrogel and Its Potential Application for Wound Dressing

ZhangAiqing,HuQing,ChenXiaosui,QinSiyong

(Key Laboratory of Catalysis and Materials Science of the State Ethnic Affair Commission & Ministry of Education,College of Chemistry and Material Science,South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China)

AbstractHydrogel as a new type of wound dressing has many merits such as high absorption, moisture retention and ease of replacement. In this work, nano-silver doped carboxymethyl chitosan/oxidized alginate composite hydrogel with antibacterial property was prepared. The silver nanoparticles were synthesized by reacting silver nitrate with sodium citrate and using sodium alginate as a dispersion aid. The composite hydrogel was then prepared in the carboxymethyl chitosan and oxidized alginate mixture solution by adding the dispersion of silver nanoparticles. UV-vis and TEM analysis indicated that the silver nanoparticles were successfully synthesized, with a particle size of about 20 nm. The hydrogels exhibited excellent antibacterial properties toEscherichiacoliandStaphylococcusaureuswith the content of silver nanoparticles of 16.67 μg/ml. Furthermore, the cytotoxicity of the hydrogels was low, suggesting that this hydrogels may be used for the treatment of wounded skin and skin disease.

Keywordsnatural polymer ; nano-silver ; composite hydrogel ; antibacterial properties

收稿日期2015-09-14

作者簡介張愛清(1963-)，男，教授，博士，研究方向：功能高分子材料，E-mail：aiqingzhang_2000@sina.com

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(GZY13012)；中央高校科研基本業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(CZW15096)

中圖分類號TQ317

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號1672-4321(2016)02-0006-04