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C1236T、G2677T/A和C3435T基因多態(tài)性與乳腺癌分子分型的關系及意義

2016-07-14 08:18劉新蘭張海霞劉堯邦姜敏
天津醫(yī)藥 2016年4期
關鍵詞:分型多態(tài)性基因型

劉新蘭,張海霞,劉堯邦,姜敏

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C1236T、G2677T/A和C3435T基因多態(tài)性與乳腺癌分子分型的關系及意義

劉新蘭1,張海霞2,劉堯邦2,姜敏3

摘要:目的觀察多藥耐藥基因1(MDR1)第12、21及26外顯子C1236T、G2677T/A和C3435T基因多態(tài)性在乳腺癌患者外周血中的分布,分析其與分子分型的關系。方法應用高分辨熔解曲線(HRM)技術檢測400例乳腺癌患者C1236T、G2677T/A及C3435T基因多態(tài)性。采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗進行基因型分布遺傳平衡吻合度檢驗。參照2013年St.Gallen國際專家乳腺癌分子分型共識。分析乳腺癌患者中C1236T、G2677T/A和C3435T基因型分布特點,并探討其與分子分型的關系。結果 (1)400例乳腺癌患者中C1236T、G2677T/A和C3435T中分別有2例、3例和2例標本未得出基因分型結果,C1236T位點CC、CT和TT基因型分別占16.08%(64/398)、44.22% (176/398)和39.70%(158/398);G2677T/A位點GG、GT、GA、TT和AT基因型分別占16.62%(66/397)、44.33%(176/ 397)、7.05%(28/397)、27.46%(109/397)和4.54%(18/397);C3435T位點CC、CT和TT基因型分別占21.11%(84/ 398)、56.03%(223/398)和22.86%(91/398)。經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗,認為C1236T、G2677T/A和C3435T基因多態(tài)性具有群體代表性(P>0.05)。(2)分子分型顯示,11例人類表皮生長因子受體2(HER-2,2+)患者未行熒光原位雜交(FISH)檢測予以剔除,其中Luminal A型占41.90%(163/389),Luminal B型占32.65%(127/389),HER-2過表達型占13.62%(53/389),三陰型占11.83%(46/389)。(3)C3435T位點CT/TT基因型在Luminal A型患者中的頻率高于其在HER-2過表達型和三陰型患者中的頻率(Χ2=12.011,P=0.001;Χ2=13.976,P<0.001),C1236T和G2677T/A基因多態(tài)性在不同分子分型中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論MDR1基因C3435T位點多態(tài)性可以為乳腺癌異質(zhì)性提供更合理的補充,不同乳腺癌分子分型患者中CT/TT基因表型可能對藥物治療更敏感。

關鍵詞:乳腺腫瘤;多態(tài)性,單核苷酸;高分辨熔解曲線技術;分子分型;C1236T;G2677T/A;C3435T

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)由同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸堿基變異引起,是人類基因多態(tài)性最常見的形式。體外細胞學研究證實多藥耐藥基因1(Multidrug resistance gene-1,MDR1)相關位點的SNPs可以通過改變其編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)誘導其活性發(fā)生改變[1]。多項研究表明MDR1基因型與乳腺癌化療療效及毒性作用密切相關[2-3],但其與乳腺癌分子分型之間關系的報道國內(nèi)外尚少見。本研究用高分辨熔解曲線(High resolution melting,HRM)技術檢測乳腺癌患者外周血中MDR1基因C1236T、G2677T/A和C3435T位點基因型,并進行分子分型,分析乳腺癌患者MDR1基因3個位點基因型分布差異及其與分子分型之間的關系,初步探討MDR1基因多態(tài)性作為分子分型指導下乳腺癌患者藥物治療的有效生物學標志物的臨床價值。

1 資料與方法

1.1臨床資料收集2011年1月—2014年12月于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院就診并經(jīng)病理學確診、病歷資料和免疫組織化學(IHC)結果中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人類表皮生長因子受體2(HER-2)及腫瘤增殖指數(shù)(Ki-67)完整的原發(fā)性乳腺癌患者400例,年齡26~72歲,中位年齡44歲。臨床分期Ⅰ期91例、Ⅱ期84例、Ⅲ期79例、Ⅳ期146例。

1.2乳腺癌分子分型判定

1.2.12013年St.Gallen國際專家乳腺癌分子分型共識 (1)Luminal A型:ER與PR均陽性、HER-2陰性、Ki-67<14%。(2)Luminal B型分2種亞型:①Luminal B型(HER-2陽性)。ER陽性,HER-2陽性,Ki-67及PR表達水平不限;②Luminal B型(HER-2陰性)。ER陽性,HER-2陰性,并同時滿足下列其中一條:Ki-67≥14%、PR陰性或小于20%。(3)HER-2過表達型:HER-2陽性,ER與PR陰性。(4)三陰型:ER、PR及HER-2均陰性。

1.2.2ER、PR、HER-2及Ki-67陽性定義根據(jù)IHC測定結果,ER和PR以癌細胞核陽性染色>1%判定為陽性。Ki-67的高低判定采用臨界值14%,Ki-67≥14%為高表達,<14%為低表達。HER-2陰性定義為IHC檢測(-~+),或熒光原位雜交(FISH)檢測陰性;HER-2陽性定義為IHC(3+),或FISH檢測陽性,IHC(2+)的患者需要行FISH檢測HER-2基因是否擴增。

1.3主要試劑DNA Blood Kit D3392-02試劑盒購自美國OMEGA公司;50 bp DNA Ladder CW2195購自康為世紀生物科技有限公司;PCR Master Mix(2Tap含染料)購自北京百泰克生物技術有限公司;Eva熒光素、96孔板封膜購自美國Biotium公司;引物合成及基因測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。所有試劑均嚴格按要求保存并在有效期內(nèi)使用。

1.4實驗方法

1.4.1標本采集與DNA提取所有患者化療前24 h采集外周靜脈血5 mL,乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,抽提全血基因組DNA,并統(tǒng)一標定DNA樣本濃度為50~100 mg/L,分裝置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Tab.1 Primer sequences and annealing conditions for PCR-HRM of C1236T,G2677T/A and C3435T表1 C1236T、G2677T/A和C3435T引物序列及退火條件

1.4.2PCR-HRM檢測MDR1基因型采用Primer Premier 5根據(jù)GenBank已知基因序列設計引物,序列見表1。HRM總反應體系為10 μL,含0.1 μmol/L上、下游引物各0.25 μL,熒光素0.5 μL,ddH2O 3 μL,TaqPCR MasterMix 5 μL,DNA模板 1 μL。采用 Roche LightCycler480檢測 MDR1exon12 (C1236T)、exon21(G2677T/A)和exon26(C3435T)基因分型,HRM擴增階段循環(huán)參數(shù):95℃預變性2 min,95℃變性10 s,退火條件見表1,共計30個循環(huán);72℃延伸5 min。根據(jù)PCR-HRM基因分型結果,隨機抽取10%的C1236T、C3435T各基因型樣本及所有G2677T/A突變基因型樣本測序驗證,利用Chromas軟件進行終點分析。

1.5統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,檢驗水準α=0.05,基因型分布遺傳平衡采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗,MDR1各位點不同基因型頻率差異及其在不同分子分型中的分布差異采用Χ2檢驗,多個樣本率的兩兩比較采用Χ2分割法(校正檢驗水準α′=α/k=0.008 3,k為比較次數(shù),k=6)。

2 結果

2.1乳腺癌MDR1基因型分布及Hardy-Weinberg檢驗MDR1基因C1236T和C3435T位點分別有CC、CT和TT基因型3種曲線。G2677T/A位點,由于GT與GA,TT、AA與AT之間Tm值差異微小,初步僅得出GG基因型、GT/GA基因型和TT/AA/AT基因型3種曲線,見圖1。G2677T/A位點GT與GA基因型,TT、AA與AT基因型通過基因測序區(qū)別,得出GT、GA、TT和AT 4種基因型,無AA基因型。隨機抽取的樣本(C3435T)測序結果與PCR-HRM結果相符,見圖2。400例乳腺癌患者,C1236T基因檢測中2例標本未得出分型結果,CC基因型占16.08%(64/398)、CT基因型占44.22%(176/398)、TT基因型占39.70%(158/398);G2677T/A基因檢測時有3例標本未得到分型結果,GG基因型占16.62% (66/397)、GT基因型占44.33%(176/397)、GA基因型占 7.05%(28/397)、TT基因型占 27.46%(109/ 397)、AT基因型占4.54%(18/397);C3435T基因檢測時有2例標本未得到分型結果,CC基因型占21.11%(84/398)、CT基因型占56.03%(223/398)、TT基因型占22.86%(91/398)。經(jīng)Hardy-Weinberg檢驗,C1236T、G2677T/A和C3435T基因型分布符合遺傳平衡定律(Χ2C1236T=1.041,P=0.594;Χ2G2677T/A= 1.099,P=0.579;Χ2C3435T=4.545,P=0.103),提示本研究入組病例具有群體代表性。

Fig.2 Gene sequencingresults of MDR1 C3435T圖2 MDR1 C3435T基因測序結果

2.2不同乳腺癌分子分型中MDR1基因多態(tài)性分布

2.2.1乳腺癌分子分型400例乳腺癌患者,HER-2 IHC(2+)46例,其中11例未行FISH檢測予以剔除,其余35例患者中,21例HER-2基因有擴增,14例無擴增。參照2013年St.Gallen國際專家乳腺癌分子分型共識,Luminal A型占41.90%(163/389),Luminal B型占32.65%(127/389),HER-2過表達型占13.62%(53/389),三陰型占11.83%(46/389)。

2.2.2C1236T、G2677T/A及C3435T基因多態(tài)性與乳腺癌分子分型間的關系C3435T基因多態(tài)性在不同分子分型乳腺癌患者中的分布差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),CT/TT基因型在Luminal A型患者中的頻率高于其在HER-2過表達型和三陰型(Χ2= 12.011,P=0.001;Χ2=13.976,P<0.001),CT/TT基因型在Luminal A型與Luminal B型患者(Χ2=3.027,P= 0.082)、Luminal B型與HER-2過表達型患者(Χ2= 3.684,P=0.055)、Luminal B型與三陰型患者(Χ2= 4.913,P=0.027)、HER-2過表達型和三陰型患者(Χ2= 0.097,P=0.756)中的分布差異均無統(tǒng)計學意義。C1236T和G2677T/A基因多態(tài)性在不同分子分型中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

3 討論

3.1分子分型在乳腺癌臨床治療中的應用及意義乳腺癌是由多種因素協(xié)同作用的一組分子水平上高度異質(zhì)性的惡性腫瘤,經(jīng)常在生物學行為、分子免疫表型、對治療的反應以及預后轉歸方面均存在明顯的個體差異。近年來,隨著乳腺癌個體化治療觀念在臨床中的不斷深入,以基因表達譜為基礎構建乳腺癌分子水平分型的研究逐漸開展。Perou等[4]在2000年首次提出了以分子生物學為特征的乳腺癌分子分型概念。2011年St.Gallen國際乳腺癌會議上正式確立了分子分型在乳腺癌臨床應用中的實際價值[5]。乳腺癌分子分型能更確切有效地反映其特殊的生物學行為和高度的腫瘤異質(zhì)性,在指導乳腺癌個體化治療方案的實施和判斷預后方面發(fā)揮了不可估量的臨床價值。

Tab.2 Distribution of gene polymorphisms of C1236T,2677T/A and C3435T in different molecular subtypes in breast cancer表2 C1236T、G2677T/A和C3435T基因型在乳腺癌不同分子分型中的分布 例(%)

分子分型被越來越多的臨床醫(yī)生作為指導乳腺癌藥物治療的參考標準。Luminal A型是臨床中最常見的內(nèi)分泌治療敏感亞型,該亞型部分高危(組織學分級3級、淋巴結轉移>4枚、有脈管癌栓及年齡<35歲)患者,需考慮行術后輔助化療并且行規(guī)范內(nèi)分泌治療[6]。Luminal B型也屬于內(nèi)分泌治療敏感亞型,但因Ki-67比例高,部分患者HER-2陽性,對于原發(fā)腫瘤>0.6 cm、淋巴結陽性、組織學分級≥2級且存在復發(fā)風險的患者,美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(NCCN)指南推薦術后輔助化療并且行規(guī)范內(nèi)分泌治療,HER-2陽性患者還需行靶向治療。HER-2過表達型因ER、PR低表達或無表達,對內(nèi)分泌治療不敏感,但其對化療及抗HER-2靶向治療均反應良好。三陰型乳腺癌因ER、PR及HER-2均為陰性,無法從內(nèi)分泌治療與曲妥珠單抗靶向治療中獲益,化療是其目前唯一的藥物治療途徑?;熢诓煌肿臃中腿橄侔┲芯l(fā)揮著重要作用。關于不同分子分型乳腺癌化療敏感性的研究,Carey等[7]對4種亞型乳腺癌進行新輔助化療后比較發(fā)現(xiàn),HER-2過表達型和三陰型患者化療敏感性優(yōu)于Luminal型。呂民豪等[8]對國內(nèi)乳腺癌患者進行了相同的研究,結果顯示HER-2過表達型及三陰型乳腺癌的病理完全緩解(pCR)率明顯高于Luminal A型和Luminal B型患者。本研究中乳腺癌4種分子分型頻率與文獻報道一致[9]。

3.2MDR1基因多態(tài)性及其與乳腺癌藥物治療的關系MDR1基因位于人類cDNA第7號染色體q21.12,編碼分子質(zhì)量為170 ku的P-gp膜蛋白。P-gp屬于ATP依賴性的膜轉運體,可直接通過增加藥物外排效應介導腫瘤細胞耐藥。遺傳藥理學研究顯示,MDR1具有高度的遺傳多態(tài)性,迄今為止,發(fā)現(xiàn)其存在50多個SNPs和3種插入/缺失多態(tài)[10]。相關研究顯示,C1236T、G2677T/A及C3435T位點基因多態(tài)性會影響不同組織中P-gp的表達及其活性,從而影響抗腫瘤藥物、心血管藥物等多種P-gp底物在人體內(nèi)的代謝[11-12]。本研究C1236T、G2677T/ A及C3435T基因型分布頻率與王健等[13]研究結果相似,但與在歐美人群中的研究報道[14]相比,本研究MDR1基因3個位點中突變基因型頻率較高,表明該基因3個位點遺傳多態(tài)性受種族、地域及環(huán)境因素差異的影響。

Kafka等[15]在晚期乳腺癌患者接受蒽環(huán)聯(lián)合紫杉醇化療的研究中發(fā)現(xiàn),C3435位點TT基因型患者的化療反應率更高。Ji等[16]通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術探討MDR1基因多態(tài)性與乳腺癌患者接受蒽環(huán)聯(lián)合紫杉類藥物化療應答的關系發(fā)現(xiàn),C3435T位點TT基因型與CC 和CT基因型相比化療療效更差(P=0.003),C1236T 和G2677T/A基因多態(tài)性與化療療效無明顯關聯(lián)性。Zhou等[3]通過Meta分析探討C1236T基因多態(tài)性與惡性腫瘤化療反應率的關系,結果顯示亞洲人群中TT基因型乳腺癌患者對化療更敏感。

3.3乳腺癌患者MDR1基因多態(tài)性與分子分型之間的關系本課題組前期研究谷胱甘肽轉硫酶T1 (GSTT1)基因分型與乳腺癌分子分型間的關系顯示,在非三陰型乳腺癌(Luminal A型+Luminal B 型+HER-2過表達型)組GSTT1缺失率高于三陰型乳腺癌組[17]。推測或許MDR1基因多態(tài)性與分子分型間也存在一定關聯(lián)性,本研究結果顯示C3435T基因多態(tài)性在不同分子分型患者中的分布差異有統(tǒng)計學意義,認為Luminal A型患者C3435T基因更容易發(fā)生由堿基C→T的同義突變,引起P-gp表達水平下降或活性降低,導致癌細胞內(nèi)藥物外排能力下降,最終增加癌細胞內(nèi)血藥濃度,削弱乳腺癌耐藥的程度。HER-2過表達型和三陰型患者C3435T位點CT/TT基因型分布頻率低。Siegsmund等[18]報道C3435位點CC基因型個體編碼P-gp量是TT基因型個體的1.5倍,提示HER-2過表達型和三陰型乳腺癌患者可能更容易發(fā)生耐藥。

綜上所述,本研究認為MDR1基因C3435T位點多態(tài)性可以為乳腺癌異質(zhì)性提供更有效的補充,不同乳腺癌分子分型患者中CT/TT基因表型可能對藥物治療更敏感。本研究的不足之處是單用HRM一種技術檢測乳腺癌患者MDR1 C1236T、G2677T/A 及C3435T基因多態(tài)性,樣本量偏少,檢測位點較少,未來需開展多項平行實驗檢測大樣本中MDR1基因多個位點基因多態(tài)性,以提高基因多態(tài)性檢測水平的穩(wěn)定性,為MDR1基因多態(tài)性更準確地解釋乳腺癌分子分型內(nèi)部之間的異質(zhì)性提供更可靠的理論依據(jù)。

(圖1見插頁)

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(2015-10-23收稿2016-03-18修回)

(本文編輯李鵬)

The correlation and significance of gene polymorphisms of C1236T,G2677T/A and C3435T with molecular subtypes of breast cancer

LIU Xinlan1,ZHANG Haixia2,LIU Yaobang2,JIANG Min3
1 General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2 School of Clinical Medicine,Ningxia Medical University;3 Department of Biochip Center,General Hospital of Ningxia Medical University

Abstract:ObjectiveTo investigate the distribution of the MDR1 exon12(C1236T),exon21(G2677T/A)and exon 26 (C3435T)gene polymorphisms in breast cancer patients,and to analyse their relationship with molecular subtypes of breast cancer.MethodsThe genotyping of C1236T,G2677T/A and C3435T were detected by polymerase chain reaction(PCR)-high resolution melting(HRM)method in 400 cases of breast cancer.The Hardy-Weinberg equilibrium test was used for genetic equilibrium distribution of genotype.The molecular subtypes of breast cancer were classified based on St.Gallen Consensus 2013.The genotype distributions of C1236T,G2677T/A and C3435T in breast cancer were analyzed.Their relationship with molecular subtypes in breast cancer was analyzed as well.Results①In 400 cases of breast cancer,there were 2,3 and 2 specimens did not get genotyping results in C1236T,G2677T/A and C3435T genotype detection.The CC,CT and TT genotypes of C1236T accounted for 16.08%(64/398),44.22%(176/398)and 39.70%(176/398).GG,GT,GA,TT and AT genotypes of G2677T/A accounted for 16.62%(66/397),44.33%(176/397),7.05%(28/397),27.46%(109/397)and 4.54% (18/397).CC,CT and TT genotypes of C3435T accounted for 21.11%(84/398),56.03%(223/398)and 22.86%(91/398)respectively.Hardy-Weinberg genetic equilibrium testing showed that polymorphisms of C1236T,G2677T/A and C3435T had group representation(P<0.05).②Eleven cases of HER-2(2+)were excluded because they were not verified by FISH de-tection when performed molecular subtype of breast cancer.Luminal A subtype accounted for 41.90%(163/389),Luminal B subtype accounted for 32.65%(127/389),HER-2 over-expression subtype accounted for 13.62%(53/389)and triple negative subtype accounted for 11.83%(46/389).③CT/TT genotype frequency of C3435T was significantly higher in breast cancer patients with Luminal A subtype than that in breast cancer patients with HER-2 over-expression subtype and triple negative subtype(Χ2=12.011,P=0.001;Χ2=13.976,P<0.001),while there was no statistical difference in C1236T and G2677T/ A gene polymorphism between different molecular subtypes of breast cancer(P>0.05).ConclusionC3435T gene polymorphism can explain more accurately heterogeneity of breast cancer.CT/TT genotype in different molecular subtypes of breast cancer may be more sensitive to drugtreatment.

Key words:breast neoplasms;polymorphism,single nucleotide;high resolution melting;molecular subtype;C1236T;G2677T/A;C3435T

中圖分類號:R737.9

文獻標志碼:A

DOI:10.11958/20150238

基金項目:寧夏回族自治區(qū)高等學校科學研究項目(NJ201050)

作者單位:1寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(郵編750004);2寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院;3寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院生物芯片中心

作者簡介:劉新蘭(1964),女,碩士研究生,主任醫(yī)師,教授,主要從事腫瘤化療相關研究

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