張國祿，程世翔，徐忠偉，衣泰龍，廖吉連，涂悅，張賽

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細胞與分子生物學

SH-SY5Y細胞中過表達RIPK3對ZFP36基因轉(zhuǎn)錄的影響

張國祿1，程世翔1，徐忠偉2，衣泰龍1，廖吉連1，涂悅1，張賽1

摘要：目的探討SH-SY5Y細胞中受體相互作用蛋白激酶-3（RIPK3）下游信號通路及其中的關(guān)鍵信號分子的作用。方法通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式在實驗組SH-SY5Y細胞內(nèi)表達外源性RIPK3蛋白，將轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒載體SHSY5Y細胞作為對照組。通過觀察質(zhì)粒所攜帶的綠色熒光蛋白（GFP）在細胞中的表達情況以驗證轉(zhuǎn)染結(jié)果，Western blot對外源性RIPK3表達進行驗證。MTT法檢測細胞增殖活性，觀察過表達RIPK3對細胞活性的影響，以確認其在細胞內(nèi)是否具有生物活性。運用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNAseq）分別檢測2組細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄豐度并應(yīng)用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）數(shù)據(jù)庫進行分析，獲得RIPK3下游信號通路及關(guān)鍵分子。通過微滴式數(shù)字化PCR（ddPCR）對部分RNAseq結(jié)果進行驗證。結(jié)果外源性RIPK3在細胞內(nèi)具有生物活性，能夠抑制SH-SY5Y細胞的增殖。RNAseq數(shù)據(jù)經(jīng)IPA分析后得出鋅指蛋白36（ZFP36）為RIPK3下游效應(yīng)分子，其相關(guān)效應(yīng)分子包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、人脫帽酶2（DCP2）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、腫瘤壞死因子（TNF）的轉(zhuǎn)錄豐度也發(fā)生了相應(yīng)的變化。結(jié)論RIPK3能夠參與對ZFP36以及與其相關(guān)效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進而在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、炎癥和腫瘤發(fā)生等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)母細胞瘤；細胞系，腫瘤；鋅指；基因表達調(diào)控；血管內(nèi)皮生長因子類；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；腫瘤壞死因子類；受體相互作用蛋白激酶-3；鋅指蛋白36；人脫帽酶2

受體相互作用蛋白激酶-3（receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）是受體相互作用蛋白家族（receptor-interacting protein kinases，RIPs）的重要成員。作為同族蛋白受體相互作用蛋白激酶-1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）重要的下游效應(yīng)分子，激活狀態(tài)下的RIPK3能夠調(diào)控組織細胞的凋亡、程序性壞死及炎癥的發(fā)生［1］。RIPK3在丘腦、黑質(zhì)、胼胝體、殼核、脊髓和延髓中表達水平較高，提示RIPK3可能在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和疾病進程中發(fā)揮著特殊的作用。鋅指蛋白36（Znic finger protein 36，ZFP36）是一種RNA結(jié)合蛋白，能夠識別多種神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、功能、炎癥等各種生理、病理過程中發(fā)揮著重要的作用［2］。本實驗中發(fā)現(xiàn)了RIPK3下游信號分子ZFP36以及相關(guān)信號通路，為RIPK3的研究開拓了新方向。

1　材料與方法

1.1材料 （1）細胞。人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y購自ATCC。（2）主要儀器。倒置顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡（Leica公司），Thermo Scientific CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），電子天平（METTLER TOLEDO公司），蛋白垂直電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、QX200微滴式數(shù)字化PCR（droplet digital PCR，ddPCR）系統(tǒng)（Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（GE公司）。（3）主要試劑。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；pCMV6-ACGFP質(zhì)粒購自O(shè)riGene公司；質(zhì)粒提取試劑盒、cDNA合成試劑盒購自TIANGEN公司；Lipofectamine 3000購自Life公司；Western blot一抗兔抗GAPDH、小鼠抗RIPK3購自Abcam公司；羊抗兔、羊抗小鼠二抗購自KPL公司；G418、TRIzol購自Invitrogen公司；QX200 ddPCR EvaGreen Supermix購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)SH-SY5Y培養(yǎng)于含有10%FBS、100 U/mL氨芐青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM∶F12=1∶1培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2、飽和濕度，0.25%胰酶-EDTA消化傳代。當細胞處于對數(shù)生長期時用于實驗。

1.2.2質(zhì)粒擴增與細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5-α感受態(tài)大腸桿菌進行篩選和擴增，按照試劑盒所提供的標準實驗步驟提取質(zhì)粒，SH-SY5Y細胞匯合度約50%時采用Lipofectamine 3000進行轉(zhuǎn)染，步驟參照所附說明書。轉(zhuǎn)染48 h后用G418濃度為1 000 mg/L的完全培養(yǎng)基進行篩選，獲得穩(wěn)定過表達RIPK3的細胞株，繼而使用G418濃度為800 mg/L的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察，確認綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達情況。實驗組細胞轉(zhuǎn)染攜帶有RIPK3過表達基因的質(zhì)粒，對照組細胞轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。

1.2.3Western blot取對數(shù)生長期的細胞，加入RIPA裂解后超聲裂解，離心收集上清，加入Loading buffer后變性。每泳道25 μg加入到10%的SDS-PAGE凝膠中電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育2 h，再次洗膜。滴加ECL發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.4MTT細胞增殖實驗細胞以5×104/mL的密度接種于96孔板，每個時間點設(shè)5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)。在檢測時間點向培養(yǎng)孔中加入MTT，細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，檢測光密度（OD）值，實驗重復(fù)5次。計算過表達RIPK3的實驗組相對細胞存活率=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.5轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNAseq）及數(shù)據(jù)分析提取細胞RNA，質(zhì)控檢測確認符合實驗要求。富集mRNA并合成cDNA，純化、修復(fù)與修飾后，富集所需cDNA文庫，定量并行RNAseq測序。計算出基因RPKM值（The value for reads per kilobase of coding sequence per million mapped reads）代表當前條件下基因轉(zhuǎn)錄豐度［3］。測序結(jié)果用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）對基因表達差異進行分析，獲得RIPK3下游信號通路及處于關(guān)鍵位置的效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄豐度。轉(zhuǎn)錄豐度=（目的基因RPKM/GAPDH基因RPKM）×100%。

1.2.6微滴式數(shù)字化PCR（ddPCR） 將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照實驗要求構(gòu)建反應(yīng)體系，微滴化后擴增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，50℃退火1 min，72℃延伸40 s，40個擴增循環(huán)；最后90℃維持5 min以穩(wěn)定微滴。QX200微滴讀取儀中對陰性/陽性微滴進行計數(shù)，用QuantaSoft（1.3.2.0）軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到目的基因的絕對濃度（copies/μL），以GAPDH為內(nèi)參進行校正后計算實驗組相對轉(zhuǎn)錄豐度=（實驗組轉(zhuǎn)錄豐度/對照組轉(zhuǎn)錄豐度）×100%。引物序列參照表1。

Tab.1　The droplet digital PCR oligonucleotide sequences表1　ddPCR引物序列

1.3統(tǒng)計學方法采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1外源性RIPK3在實驗組細胞內(nèi)穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)染后細胞在激光共聚焦顯微鏡下觀察，2組細胞在激發(fā)光照射下發(fā)射綠色熒光，說明質(zhì)粒序列成功插入到細胞基因組中，見圖1。Western blot結(jié)果顯示，實驗組在RIPK3抗體的標記下出現(xiàn)2個條帶，細胞內(nèi)源性RIPK3分子質(zhì)量為56 ku，實驗組外源性RIPK3與GFP融合，分子質(zhì)量為85 ku。質(zhì)粒攜帶的外源性RIPK3蛋白在SH-SY5Y細胞中穩(wěn)定表達，見圖2。

Fig.1　The morphology of two groups of cells under confocal laser scanningmicroscope（×200）圖1　激光共聚焦顯微鏡下觀察2組細胞（×200）

Fig.2　The expression of RIPK3 in cells圖2　RIPK3在細胞中表達情況

2.2外源性 RIPK3對SH-SY5Y細胞活性的影響MTT結(jié)果顯示：12、20、28、36、44 h時點實驗組細胞活性明顯低于對照組（n=5，t分別為6.717、5.094、14.900、11.914、23.903，均P＜0.01），見圖3。

Fig.3　The effect of RIPK3 on cell viability圖3　RIPK3對細胞活性的影響

2.3ZFP36是RIPK3的下游效應(yīng)分子IPA對RNAseq測序數(shù)據(jù)分析得到RIPK3下游信號通路，以及其中的關(guān)鍵效應(yīng)分子ZFP36。相對于對照組，實驗組 ZFP36轉(zhuǎn)錄豐度發(fā)生上調(diào)（4.36%vs. 7.89%）。ddPCR檢測cDNA樣本中GAPDH與ZFP36基因絕對濃度，見圖4，以GAPDH作為內(nèi)參進行校正后計算得到實驗組相對于對照組ZFP36轉(zhuǎn)錄豐度為（177.29±9.81）%（n=3，t=13.644，P＜0.01）。ZFP36相對轉(zhuǎn)錄豐度差異與RNAseq結(jié)果基本一致。

Fig.4　Concentrations of GAPDH and ZFP36 in cDNA samples圖4　cDNA樣本中GAPDH與ZFP36濃度

2.4RIPK3對ZFP36下游效應(yīng)分子的影響從IPA對RNAseq數(shù)據(jù)分析結(jié)果中遴選出ZFP36下游的效應(yīng)分子，以GAPDH為內(nèi)參進行校正，結(jié)果提示RIPK3對這些ZFP36下游效應(yīng)分子血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、人脫帽酶2（mRNA-decapping enzyme 2，DCP2）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的轉(zhuǎn)錄豐度產(chǎn)生了明顯的影響，見圖5。

Fig.5　ZFP36 downstream signalingmolecule transcription levels圖5　ZFP36下游效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄豐度

3　討論

近年來，RIPK3越來越受到科研人員的重視，但研究方向主要局限于凋亡、壞死性凋亡及炎癥發(fā)生等相關(guān)信號通路，RIPK3在神經(jīng)系統(tǒng)中所發(fā)揮的作用及信號通路尚待探索。本實驗以SH-SY5Y為基礎(chǔ)建立RIPK3過表達神經(jīng)元模型［4-5］，MTT結(jié)果證明外源性的RIPK3在細胞內(nèi)具有生物學活性，表現(xiàn)為抑制細胞活性，后續(xù)實驗充分利用了RNAseq實驗與IPA高通量、高敏感度的特點，對細胞基因的整個轉(zhuǎn)錄組mRNA進行檢測及分析，實驗過程中經(jīng)過多重質(zhì)控檢測以確保數(shù)據(jù)準確可靠。本研究采用Bio-Rad公司最新的第3代PCR技術(shù)進行精確的絕對定量［6］，實驗結(jié)果與RNAseq結(jié)果保持高度一致，保證了實驗具有較強的可重復(fù)性［7］。本研究經(jīng)分析得出SH-SY5Y細胞內(nèi)RIPK3下游存在以ZFP36為核心的信號通路。

ZFP36是一種RNA結(jié)合蛋白，能夠促進3′端非編碼區(qū)富含AU堿基（AU-rich elements，AREs）的mRNAs快速降解［8］。其自身未被發(fā)現(xiàn)具有mRNA酶活性，但是其與幾種細胞mRNA降解機制中部分酶的活性相關(guān)，包括脫腺苷酶、脫帽因子及核酸外切酶，從而激活目標mRNA的降解［9］。mRNA的降解能夠抑制蛋白質(zhì)的過量表達、促進核苷酸的降解，在細胞代謝中發(fā)揮著核心作用。對含有ARE的mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是一個非常復(fù)雜的過程。預(yù)計哺乳動物體內(nèi)超過8%的mRNA含有ARE，其中很大一部分編碼的是具有高度調(diào)控作用的細胞因子，包括細胞因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子以及早期反應(yīng)基因［10］。

本研究不僅證實處于RIPK3下游潛在的重要信號分子ZFP36，更通過分析得出了部分轉(zhuǎn)錄豐度發(fā)生明顯改變的信號分子。ZFP36在體內(nèi)特別是神經(jīng)系統(tǒng)中具有十分廣泛的作用。在對惡性膠質(zhì)瘤細胞的研究中，ZFP36誘導(dǎo)的mRNA降解能夠?qū)е旅黠@的具有劑量依賴性的VEGF mRNA的改變，同時證實ZFP36的異位表達能夠通過干擾VEGF從而發(fā)揮生長抑制作用［11］。ZFP36能夠直接在mRNA水平調(diào)節(jié)BDNF，進而起到調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能、神經(jīng)炎癥、肌源性分化以及修復(fù)［12］；同時，ZFP36能夠直接動員并激活DCP2，并在其協(xié)助下完成對含有ARE結(jié)構(gòu)的mRNA發(fā)揮脫帽作用，以促進其降解［13］。ZFP36的靶基因包括編碼RNA結(jié)合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）的mRNA，包括Hu/Elavl和Nova家族，而這些蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能中具有重要的作用，同時也是重要的神經(jīng)標志物［14］。在神經(jīng)分化過程中減少ZFP36的表達有助于神經(jīng)系統(tǒng)中3′端延長的mRNA多聚腺苷化亞型的產(chǎn)生［15］。綜上，可以認為RIPK3能夠通過對ZFP36的調(diào)節(jié)在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、炎癥、修復(fù)以及發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。

由于受到各種條件的約束，本研究僅驗證了RIPK3過表達對ZFP36及其下游效應(yīng)分子基因轉(zhuǎn)錄豐度的影響，并根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果對其可能造成的下游效應(yīng)進行合理的推測，并未對具體的相互作用關(guān)系進行進一步探究及闡述，需要在后續(xù)的實驗中對其進行進一步完善。

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（2015-09-10收稿2015-10-28修回）

（本文編輯李國琪）

The effects of RIPK3 overexpression on the transcription of ZFP36 gene in SH-SY5Y cells

ZHANG Guolu1，CHENG Shixiang1，XU Zhongwei2，YI Tailong1，LIAO Jilian1，TU Yue1，ZHANG Sai1
1 Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair，Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience of Chinese Armed Police Forces（CAPF），Neurology&Neurosurgery Hospital of CAFP，Tianjin 300162，China；2 Center Laboratory of Logistics University of CAPF Corresponding AuthorE-mail：ytumail@vip.126.com；zhangsai718@vip.126.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the signalingpathway and the key signal molecules of protein kinase（RIPK）3 in SHSY5Y cells.MethodsSH-SY5Y cells were transfected with RIPK3 expression plasmid vector to upregulate intracellular RIPK3，while the SH-SY5Y cells were transfected with empty vector plasmid，which was considered as control group.Western blot assay was used to check the expression of exogenous RIPK3 in cells.The proliferation rate of SH-SY5Y cells was determined by MTT assay at designated time to detect exogenous RIPK3 activity.Whole transcriptome sequencing（RNAseq）was used to detect the transcription of genes.Whole-transcriptomic gene transcription was measured by following Ingenuity Pathway Analysis（IPA）to obtain downstream signaling pathways and the key molecule，which were partly confirmed by following droplet digital PCR （ddPCR）.ResultsExogenous RIPK3 showed biological activity in SH-SY5Y，which inhibited the proliferation of cells.IPA showed that znic finger protein 36（ZFP36）was significantly up-regulated as compared with that of the control group.The transcription levels of ZFP36 downstream genes such as tumor necrosis factor（TNF），brain derived neurotrophic factor（BDNF），vascular endothelial growth factor（VEGF）and mRNA-decappingenzyme 2（DCP2）were affected at the same time.ConclusionWithin the limitations of this study，it seems that RIPK3 is notable for the development，inflammation and tumorigenesis of the nervous system as an independent regulator of ZFP36 gene and downstream effectors.

Key words：neuroblastoma；cell line，tumor；zinc fingers；gene expression regulation；vascular endothelial growth factors；brain-derived neurotrophic factor；tumor necrosis factors；receptor-interacting protein kinase 3；znic finger protein 36；mRNA-decappingenzyme 2

中圖分類號：R34

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150166

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31200809）；武警部隊后勤科研項目（WJHQ2012-20）；武警后勤學院科研創(chuàng)新團隊（WHTD201306）

作者單位：1天津市神經(jīng)創(chuàng)傷與修復(fù)重點實驗室，武警部隊腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，武警后勤學院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院（郵編300162）；2武警后勤學院中心實驗室

作者簡介：張國祿（1990），男，碩士在讀，主要從事神經(jīng)外科學研究

通訊作者E-mail:ytumail@vip.126.com；zhangsai718@vip.126.com