于兆進，江茜，韓麗，關舒，顏媛媛，魏敏杰，何苗△

?

miR-100表達與乳腺癌患者淋巴結轉移及FZD-8表達的相關性研究

于兆進1，江茜1，韓麗1，關舒2，顏媛媛1，魏敏杰1，何苗1△

摘要：目的考察臨床乳腺癌病理組織中miR-100和Wnt通路關鍵因子卷曲蛋白（FZD）-8表達之間的關系，并分析miR-100表達與乳腺癌患者淋巴結轉移的關系。方法選取中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院乳腺外科術后的50例乳腺癌患者，通過原位雜交檢測乳腺癌患者病理組織及其配對的癌旁組織中miR-100的表達；免疫組化檢測2種組織中FZD-8的表達；比較有無淋巴結轉移患者癌組織中miR-100表達情況，分析乳腺癌組織miR-100與FZD-8表達的相關性。結果miR-100在乳腺癌組織中的表達明顯低于其配對的癌旁組織［2.00（1.00，3.00）vs.6.00（3.50，8.00）］；有淋巴結轉移者癌組織中miR-100低表達［1.50（1.00，2.75）vs.3.00（2.00，4.00）］；與癌旁組織相比，F(xiàn)ZD-8在乳腺癌組織中高表達［8.00（6.00，9.00）vs.6.00（3.75，9.00）］，且其表達水平與miR-100的表達呈負相關（rs=-0.592，P＜0.001）。結論miR-100作為抑癌miRNA參與乳腺癌轉移的調節(jié)，可能與其調控FZD-8的表達有關。

關鍵詞：乳腺腫瘤；淋巴轉移；Wnt蛋白質類；微RNAs；miR-100；Wnt通路；卷曲蛋白8

△通訊作者E-mail：hemiao_cmu@126.com

Wnt信號通路是一條高度保守的通路，參與細胞增殖、分化、生存、凋亡等細胞生物過程的調節(jié)［1］。卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)ZD）-8是Frizzled受體家族主要成員之一，在Wnt信號通路介導的腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。已有研究證實miR-100靶向抑制同源基因（HOX）A1，可進而抑制腫瘤的增殖、侵襲及轉移［3］。但是，關于miR-100與乳腺癌侵襲轉移的關系有待深入研究。本研究檢測了臨床乳腺癌患者病理組織中miR-100和FZD-8的表達，分析兩者的相關性，以及miR-100表達與乳腺癌患者淋巴結轉移的關系，旨在探討miR-100介導乳腺癌轉移的機制。

1　材料與方法

1.1實驗材料50例乳腺癌組織及其配對的癌旁組織，來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院乳腺外科病房2011年1月—2012年12月間實施手術的女性乳腺癌患者，年齡34～72歲，平均（47.6±11.8）歲；收集經病理診斷明確的淋巴結轉移情況，其中乳腺癌發(fā)生淋巴結轉移者32例，未發(fā)生淋巴結轉移者18例；患者術前均未接受放療或化療。抗體FZD-8購自美國Abcam公司；SP超敏濃縮試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；地高辛標記的miR-100寡核苷酸探針由上海生工生物工程股份有限公司合成；原位雜交檢測試劑盒（Enhanced Sensitive ISH Detection KitⅡ）購自武漢博士德公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色乳腺癌組織微陣列芯片經二甲苯脫蠟，降梯度乙醇脫苯、水化。將芯片浸入檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），高壓修復8～10 min。3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；正常山羊血清封閉；PBS稀釋的一抗FZD-8（1∶200）4℃孵育過夜。次日芯片經生物素標記的二抗（1∶200）37℃孵育30 min；鏈霉素抗生物素-辣根過氧化物酶（1∶200）37℃孵育30 min；滴加新鮮配制的DAB溶液顯色。蘇木素復染。脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后觀察。同步操作陰性對照，即癌旁組織，采用PBS液代替一抗。

1.2.2原位雜交組織切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯、水化；3%過氧化氫處理10 min；蛋白酶K（20 mg/L）37℃孵育15 min；預雜交液中37℃預雜交2 h；雜交液中37℃雜交過夜。10%正常山羊血清37℃孵育30 min；生物素標記的鼠抗地高辛37℃孵育60 min；SABC-AP 37℃孵育30 min。蘇木素復染等步驟同上。

1.2.3結果判定miR-100及FZD-8表達均按著色細胞百分率與染色強度兩者記分乘積計分。著色細胞百分率：＜5%染色記為0，5%～25%染色記為1，26%～50%染色記為2，51%～75%染色記為3，＞75%染色記為4。染色強度：無染色記為0，弱陽性記為1，中等強度記為2，強陽性記為3。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包分析數據，因miR-100及FZD-8表達評分為非正態(tài)分布的連續(xù)變量，采用中位數和四分位數［M（P25，P75）］表示，兩組間miR-100及FZD-8表達水平比較采用Mann-Whitney U test分析；采用Spearman相關系數來描述miR-100及FZD-8表達的相關性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1miR-100在乳腺癌組織中的表達原位雜交結果顯示，miR-100在癌組織中染色程度與癌旁組織相比明顯減弱，見圖1。癌組織中miR-100表達水平顯著低于癌旁組織［2.00（1.00，3.00）vs.6.00 （3.50，8.00），Z=5.235，P＜0.001］。

Fig.1　Figures showingmiR-100 expression in breast cancer tissues and adjacent normal tissues measured by in situ hybridization（ISH，×200）圖1　乳腺癌患者癌組織及癌旁組織中miR-100的表達（原位雜交，×200）

2.2乳腺癌組織中miR-100表達與淋巴結轉移的關系有淋巴結轉移腫瘤組織中miR-100表達水平顯著低于無淋巴結轉移腫瘤組織［1.50（1.00，2.75）vs.3.00（2.00，4.00），Z=3.041，P=0.002］。

2.3乳腺癌組織中FZD-8與miR-100的相關性免疫組化結果顯示，F(xiàn)ZD-8在乳腺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織［8.00（6.00，9.00）vs.6.00（3.75，9.00），Z=3.201，P=0.001］，見圖2。相關分析顯示FZD-8與miR-100表達呈負相關（rs=-0.592，P＜0.001）。

Fig.2　Figures showingthe expression of FZD-8 in human breast cancer tissues and adjacent normal tissues analyzed by immunohistochemistry（IHC，×200）圖2　乳腺癌患者癌組織及癌旁組織中FZD-8的表達（免疫組化，×200）

3　討論

3.1miR-100與乳腺癌轉移的關系侵襲轉移是乳腺癌患者預后不良、引起死亡的最主要原因，因此尋找抑制乳腺癌轉移的新靶點勢在必行。miRNA是一類長度約為21～23個核苷酸的小分子非編碼RNA，在多種生物學過程中起著重要的調控作用。一些miRNAs已被發(fā)現(xiàn)作為抑癌基因在抑制腫瘤的轉移中發(fā)揮重要作用。Nishikawa等［4］報道m(xù)iR-29可直接靶向laminin信號在前列腺癌中抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移。有研究報道m(xù)iR-100在口腔癌、腎上腺皮質癌、肝細胞癌、卵巢癌和膀胱癌中低表達［5-7］。Gebeshuber等［8］報道m(xù)iR-100能靶向抑制胰島素樣生長因子2的表達，從而抑制乳腺癌的進展。最近，Chen等［9］也報道了miR-100通過轉錄后調節(jié)polo樣激酶1（PLK1）表達，進而抑制卵巢癌上皮細胞的生長。Petrelli等［10］也證實了miR-100通過抑制PLK1抑制了乳腺癌干細胞干性的維持。本研究通過原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)miR-100在乳腺癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，且在有淋巴結轉移患者中低表達，提示其可能作為抑癌miRNAs抑制乳腺癌的轉移。

3.2miR-100與FZD-8表達的關系腫瘤細胞所處微環(huán)境中復雜的信號通路，如Wnt、轉化生長因子（TGF）-β、Notch等信號通路的相互作用介導了腫瘤侵襲轉移的過程［11］。當Wnt在細胞膜表面與FZD和低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）5/6結合后，激活經典或非經典的Wnt通路，抑制β-連環(huán)蛋白（β-catenin）-軸蛋白（AXIN）-腺瘤狀結腸息肉蛋白（APC）-糖原合成酶激酶（GSK）3β復合物的形成，增加β-catenin的穩(wěn)定性與入核，促進下游靶基因的轉錄，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12］，可見Wnt信號通路的激活在腫瘤的發(fā)展轉移中發(fā)揮重要作用。一些miRNAs被證實能夠靶向調節(jié)Wnt通路的關鍵因子，從而參與腫瘤細胞生物學功能的調控。研究發(fā)現(xiàn)miR-612可通過抑制Wnt信號通路來抑制肝癌細胞的干性、侵襲和遷移［13］。Subramanian等［14］研究顯示miR-29通過下調β-catenin的共激活子的表達，抑制腸癌細胞Wnt信號通路的功能。FZD-8為Wnt信號通路受體卷曲蛋白家族中的一員，在Wnt通路活性調控中發(fā)揮重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)FZD-8在三陰性乳腺癌細胞中高表達，抑制FZD-8的表達能夠抑制Wnt通路的活性，并明顯增加三陰性乳腺癌細胞的藥物敏感性［15］。而本研究是在乳腺癌病理組織中進行FZD-8表達水平檢測，且未考慮乳腺癌三陰性分子表型，亦發(fā)現(xiàn)FZD-8在乳腺癌中高表達，這提示乳腺癌中FZD-8并非三陰性表型者獨有的標志分子，這可在更大樣本的組織標本中進行FZD-8檢測予以進一步確認。本研究通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)FZD-8在臨床乳腺癌患者病理組織中的表達明顯高于癌旁組織，且其表達與miR-100的表達呈負相關，提示miR-100和FZD-8有望成為評價乳腺癌患者預后的重要指標，靶向FZD-8可能為臨床乳腺癌的治療提供重要線索。

參考文獻

［1］Clevers H.Wnt/beta-catenin signaling in development and disease ［J］.Cell，2006，127（3）：469-480.

［2］Wang HQ，Xu ML，Ma J，et al.Frizzled-8 as a putative therapeutic target in human lung cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，417（1）：62-66.doi：10.1016/j.bbrc.2011.11.055.

［3］Chen D，Sun Y，Yuan Y，et al.miR-100 induces epithelial-mesenchymal transition but suppresses tumorigenesis，migration and invasion［J］.PLoS Genet，2014，10（2）：e1004177.doi：10.1371/journal. pgen.1004177.

［4］Nishikawa R，Goto Y，Kojima S，et al.Tumor-suppressive microRNA-29s inhibit cancer cell migration and invasion via targeting LAMC1 in prostate cancer［J］.Int J Oncol，2014，45（1）：401-410. doi：10.3892/ijo.2014.2437.

［5］Christodoulou F，Raible F，Tomer R，et al.Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity［J］.Nature，2010，463 （7284）：1084-1088.doi：10.1038/nature08744.

［6］Zheng YS，Zhang H，Zhang XJ，et al.MiR-100 regulates cell differentiation and survival by targeting RBSP3，a phosphatase-like tumor suppressor in acute myeloid leukemia［J］.Oncogene，2012，31 （1）：80-92.doi：10.1038/onc.2011.208.

［7］Li Z，Li X，Yu C，et al.MicroRNA-100 regulates pancreatic cancer cells growth and sensitivity to chemotherapy through targeting FGFR3［J］.Tumour Biol，2014，35（12）：11751-11759.doi：10.1007/ s13277-014-2271-8.

［8］Gebeshuber CA，Martinez J.miR-100 suppresses IGF2 and inhibits breast tumorigenesis by interfering with proliferation and survival signaling［J］.Oncogene，2013，32（27）：3306-3310.doi：10.1038/onc.2012.372.

［9］Chen P，Zhao X，Ma L.Downregulation of microRNA-100 correlates with tumor progression and poor prognosis in hepatocellular carcinoma［J］.Mol Cell Biochem，2013，383（1/2）：49-58.doi：10.1007/s11010-013-1753-0.

［10］Petrelli A，Carollo R，Cargnelutti M，et al.By promoting cell differentiation，miR-100 sensitizes basal-like breast cancer stem cells to hormonal therapy［J］.Oncotarget，2015，6（4）：2315-2330.

［11］Klemm F，Bleckmann A，Siam L，et al.β-catenin-independent WNT signaling in basal-like breast cancer and brain metastasis［J］.Carcinogenesis，2011，32（3）：434-442.doi：10.1093/carcin/bgq269.

［12］MacDonald BT，Tamai K，He X.Wnt/beta-catenin signaling：components，mechanisms，and diseases［J］.Dev Cell，2009，17（1）：9-26.

［13］TangJ，Tao ZH，Wen D，et al.MiR-612 suppresses the stemness of liver cancer viaWnt/β-catenin signaling［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，447（1）：210-215.doi：10.1016/j.bbrc.2014.03.135.

［14］Subramanian M，Rao SR，Thacker P，et al.MiR-29b downregulates canonical Wnt signaling by suppressing coactivators of β-catenin in human colorectal cancer cells［J］.J Cell Biochem，2014，115 （11）：1974-1984.doi：10.1002/jcb.24869.

［15］Yin S，Xu L，Bonfil RD，et al.Tumor-initiating cells and FZD8 play a major role in drug resistance in triple-negative breast cancer［J］. Mol Cancer Ther，2013，12（4）：491-498.doi：10.1158/1535-7163.MCT-12-1090.

（2015-11-25收稿2016-03-02修回）

（本文編輯李鵬）

The correlation of miR-100 expression with lymph node metastasis and FZD-8 protein expression in patients with breast cancer

YU Zhaojin1，JIANG Qian1，HAN Li1，GUAN Shu2，YAN Yuanyuan1，WEI Minjie1，HE Miao1
1 Department of Pharmacology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China；2 Department of Breast Surgery，The First Affiliated Hospital of China Medical University Corresponding AuthorE-mail：hemiao_cmu@126.com

Abstract：ObjectiveTo evaluate the expression and relationship of miR-100 and FZD-8，one of the major components of Wnt signaling pathway，and the correlation of their expressions with lymph node metastasis in patients with breast cancer.MethodsThe expression of miR-100 was determined in 50 samples of human breast cancer tissues and adjacent normal tissues by in situ hybridization.The correlation of miR-100 expression with lymph node metastasis was analyzed by Mann-Whitney U test.The expression of FZD-8 was measured in 50 samples of human breast cancer tissues and adjacent normal tissues by immunohistochemistry.The correlation of the miR-100 expression with the protein expression of FZD-8 was evaluated by Pearson rank analysis.ResultsThe expression of miR-100 was significantly lower in human breast cancer tissues than that in adjacent normal breast tissues［2.00（1.00，3.00）vs.6.00（3.50，8.00）］.The miR-100 expression was lower in patients with lymph node metastasis than that in patients without lymph node metastasis［1.50（1.00，2.75）vs.3.00 （2.00，4.00）］.The expression of FZD-8 was significantly higher in human breast cancer tissues than that in adjacent normal breast tissues［8.00（6.00，9.00）vs.6.00（3.75，9.00）］.The miR-100 expression was negatively correlated with the FZD-8 protein expression in human breast cancer tissues（rs=-0.592，P＜0.001）.ConclusionThe miR-100，as an anti-metastasismiRNA，may involve in the metastasis of breast cancer，which may be related with the regulation of the expression of FZD-8.

Key words：breast neoplasms；lymphatic metastasis；Wnt proteins；microRNAs；miR-100；Wnt pathway；FZD-8

中圖分類號：R737.9

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150333

基金項目：遼寧省高校創(chuàng)新團隊支持計劃資助項目（LT2014016）；沈陽市科技計劃項目（F14-232-6-05）

作者單位：1中國醫(yī)科大學藥學院藥理教研室（郵編110122）；2中國醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)院乳腺外科

作者簡介：于兆進（1983），男，講師，碩士，主要從事分子腫瘤藥理學研究