荊喜中，賈歡歡，羅挺，凌雪熒，李韻峰，劉書華，馬俊峰，黃韌，張鈺*，王暉

（1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣省實驗動物重點實驗室，廣州 510663；2.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州 510006）

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小鼠膿毒癥模型的建立和評價

荊喜中2，1，賈歡歡1，羅挺1，凌雪熒1，李韻峰1，劉書華1，馬俊峰1，黃韌1，張鈺1*，王暉2*

（1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣省實驗動物重點實驗室，廣州 510663；2.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣州 510006）

【摘要】目的 建立小鼠膿毒癥模型并進行評價，為研究膿毒癥致病機制和開發(fā)抗炎藥物提供模型動物。方法 采用盲腸結(jié)扎穿孔法（cecal ligation and puncture，CLP）誘導(dǎo)小鼠膿毒癥，通過動物生存、術(shù)后小鼠載菌量、血常規(guī)和血生化指標(biāo)、細(xì)胞因子水平、組織病理變化等方面對模型進行評價。結(jié)果 小鼠的死亡率與盲腸結(jié)扎部位密切相關(guān)，盲腸結(jié)扎50%小鼠12 d存活率在40%左右，結(jié)扎75%小鼠4 d全部死亡（P＜0.01）。與假手術(shù)組相比，50%結(jié)扎CLP小鼠血液和腹腔中載菌量增加，白細(xì)胞下降，差異有顯著性（P＜0.001）。CLP小鼠肝轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST和血清尿素氮BUN水平升高，差異具有顯著性（P＜0.01），炎癥因子IL1a、IL6、IL10、MIP1a、MIP1β、TNFa水平升高。手術(shù)后48 h小鼠的肝和肺出現(xiàn)明顯組織病理損傷。結(jié)論 小鼠CLP模型具有典型的膿毒癥病理特征，為后期研究抗炎藥物的篩選提供了較好的動物模型。

【關(guān)鍵詞】膿毒癥；盲腸結(jié)扎穿孔；小鼠模型；炎癥反應(yīng)；感染

膿毒癥（sepsis）是由微生物入侵機體感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）。臨床常見于手術(shù)、創(chuàng)傷及免疫力低下等狀況，細(xì)菌進入血液循環(huán)并在其中生長繁殖、產(chǎn)生毒素而引起的全身性嚴(yán)重感染。如果感染得不到有效控制，可進一步發(fā)展為膿毒癥休克（septic shock）和多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）［1］，膿毒癥的死亡率高達30%～50%［2］，但其致病的病理生理機制還不完全清楚，至今沒有有效的藥物用于膿毒癥的治療，因此，建立膿毒癥動物模型，對膿毒癥致病機制研究和開展抗炎藥物篩選工作具有重要意義。

過去對膿毒癥做了大量研究，其病理機理研究進展得益于多種動物模型，目前已有不同種屬和誘導(dǎo)方法的膿毒癥動物模型［3-6］，其中小鼠CLP模型因動物價廉易得，操作簡單等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用，但目前該模型尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的操作規(guī)范及評價指標(biāo)，本研究將利用CLP建立小鼠膿毒癥模型，通過評價小鼠生存率、載菌量、血常規(guī)和血生化變化、肝腎損傷指標(biāo)、炎癥因子水平、組織病理損傷等指標(biāo)，對CLP誘導(dǎo)膿毒癥的致病機制進行研究，為后期開展抗炎藥物篩選提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠75只，8～10周齡，體重25～29 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供【SCXK（粵）2013-0002】，小鼠手術(shù)及組織取材在廣東省實驗動物監(jiān)測所屏障動物實驗設(shè)施內(nèi)進行【SYXK（粵）2012-0122】。

1.2 材料和儀器

異氟烷（深圳市瑞沃德生物科技有限公司），鹽酸曲馬多注射液（德國格蘭泰有限公司），胰蛋白酶血平板（廣州市迪景微生物科技有限公司），EDTAK2抗凝管（廣州健福醫(yī)藥科技有限公司），Luminex多因子檢測試劑盒（Merck），呼吸麻醉機（Matrx型，美國），生化培養(yǎng)箱（Blue Pard，中國），血細(xì)胞儀（XT2000iV型，日本），血生化儀（日立7020型，日本），Luminex儀（MAGPIX型，德國）

1.3 實驗動物分組及模型的建立

小鼠隨機分3組，假手術(shù)組10只，50%和75%盲腸結(jié)扎組各20只，用于建模并統(tǒng)計生存率；假手術(shù)組10只，50%盲腸結(jié)扎組15只用于模型評價。

手術(shù)采用異氟烷呼吸麻醉，待小鼠麻醉后，剃去小鼠腹部被毛，75%酒精消毒小鼠腹部皮膚，沿腹中線位置剪開1～2 cm開口，分離表皮和肌層，找到盲腸，小心分離盲腸，避免傷害腸系膜血管。在盲腸長度1/2或3/4的位置用3號線結(jié)扎，結(jié)扎后使用8號針頭在盲腸盲端以上約0.5 cm處橫穿扎孔，用針頭來回貫穿兩次，從針孔擠出少量腸內(nèi)容物，將盲腸放回腹腔，盡量避免腸內(nèi)容物粘附在手術(shù)切口。逐層縫合肌肉層和皮膚。術(shù)后給予每只小鼠皮下注射1 mL 37℃預(yù)熱的生理鹽水補充液體，按體重10 mg/ kg皮下注射鹽酸曲馬多作為止痛劑，在手術(shù)后48 h內(nèi)每12 h注射一次。假手術(shù)組除不進行盲腸結(jié)扎和穿孔外，其余操作同手術(shù)組。為避免小鼠時間節(jié)律對手術(shù)的影響，每次手術(shù)均選擇在下午2點進行，每只小鼠手術(shù)時間盡量維持在10 min之內(nèi)。

1.4 載菌量檢測

在術(shù)后16 h和48 h，眼球放血，EDTA抗凝管收集血液。用3.5 mL無菌生理鹽水灌洗小鼠腹腔，采集腹腔灌洗液，將采集的血液和腹腔液倍比稀釋，均勻涂布在胰蛋白酶血平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，24 h后計數(shù)平板上菌落數(shù)。

1.5 血常規(guī)和生化指標(biāo)測定

采集術(shù)后16 h和48 h小鼠血液，血細(xì)胞儀進行血常規(guī)檢測，考察白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)目變化。血液離心，取血漿，血生化儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清尿素氮（BUN）水平。剩余血漿放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞因子檢測

收集CLP造模后16 h和48 h血漿，利用Luminex液相芯片技術(shù)檢測細(xì)胞因子表達，所用試劑和方法按照說明書操作。檢測GM-CSF、INF-γ、IL-1a、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、MIP-1a、MIP-1β、MIP-2表達水平。

1.7 組織病理檢測

CLP造模48 h后，頸椎脫臼處死小鼠，采集小鼠肝和肺，4%中性甲醛溶液固定，經(jīng)組織脫水、石蠟包埋處理制作石蠟標(biāo)本切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病變情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用spss19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，生存統(tǒng)計使用Log-rank（Mantel-Cox）檢驗，組間數(shù)值差異比較使用t檢驗，作圖使用GraphPad Prism 6.0軟件。P ＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 CLP術(shù)后小鼠一般觀察

CLP術(shù)后小鼠精神萎靡，活動減少，行動遲緩，背部毛發(fā)豎立，眼瞼部出現(xiàn)粘稠分泌物，小鼠肛門處有糞便粘連，尿液渾濁。對死亡小鼠解剖可見腹腔充滿渾濁的滲出液，腸道黏連。5 d后存活小鼠狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)。假手術(shù)組小鼠術(shù)后蘇醒即恢復(fù)正常狀態(tài)。

2.2 CLP小鼠生存率

觀察不同盲腸結(jié)扎部位小鼠生存狀況并記錄死亡時間。如圖1所示，大部分小鼠死亡發(fā)生在手術(shù)后5 d內(nèi)。小鼠生存率與盲腸結(jié)扎長度密切相關(guān)，75%盲腸結(jié)扎小鼠4 d全部死亡，50%盲腸結(jié)扎小鼠12 d存活率約40%，假手術(shù)小鼠全部存活。因75%盲腸結(jié)扎小鼠病情發(fā)展過快，不利于進行模型評價，在后續(xù)實驗中選擇50%盲腸結(jié)扎作為手術(shù)模型。

2.3 CLP術(shù)后小鼠腹腔和血液載菌量

如圖2所示，CLP術(shù)后16 h和48 h CLP模型組小鼠腹腔和血液中均檢測到細(xì)菌，隨時間變化，腹腔中菌量逐漸增加，血液中菌量逐漸減少，表明腸菌從穿孔部位持續(xù)釋放到腹腔中，菌叢由腹膜進入血液循環(huán)，免疫系統(tǒng)被激活并隨時間延長免疫清除速率增加。假手術(shù)組小鼠腹腔和血液中未檢測到細(xì)菌。

2.4 CLP術(shù)后小鼠血常規(guī)和血生化指標(biāo)檢測

對CLP術(shù)后16 h和48 h小鼠進行血常規(guī)檢測，CLP組小鼠與假手術(shù)組相比，白細(xì)胞明顯減少（P＜0.001），中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞也有不同程度下降（圖3），表示小鼠機體免疫系統(tǒng)受到抑制。術(shù)后48 h，白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞仍維持較低水平。

對CLP術(shù)后16 h和48 h小鼠進行血生化檢測，相比假手術(shù)組，ALT、AST和BUN均有顯著性升高（P＜0.01），手術(shù)組48 h各項指標(biāo)仍維持較高水平（圖4）。

2.5 CLP術(shù)后小鼠細(xì)胞因子水平

對CLP術(shù)后16 h和48 h小鼠進行細(xì)胞因子GM-CSF、INF-γ、IL-1a、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、MIP-1a、MIP-1β、MIP-2檢測。在術(shù)后16 h、48 h與假手術(shù)組相比，促炎因子IL-1a、IL-6、TNFa出現(xiàn)明顯升高，其他促炎因子GMCSF、INF-γ、IL-1β、IL-2、IL-12、IL-17未見明顯升高（未列出）；抑炎因子IL-10出現(xiàn)明顯升高，其他抑炎因子IL-4、IL-15未見明顯變化（未列出）；趨化因子MIP1a、MIP1β和MIP-2出現(xiàn)明顯升高（圖5）。術(shù)后48 h，細(xì)胞因子仍然維持較高水平。

圖1　小鼠不同盲腸結(jié)扎位置生存曲線Note.Sham：sham operated group（n=10）；50%CLP：Ligation of 50%of the cecum group（n=20）；75%CLP：Ligation of 75%of the cecum group（n=20）.**：P＜0.01；***：P＜0.001.Fig.1 Survival curves of the mice with cecal ligation at different sites.

圖2　小鼠CLP術(shù)后16 h和48 h血液和腹腔載菌量變化Note.Post CLP 16 h group compared with the 48 h group，*P＜0.05；**P＜0.01.Fig.2 Bacterial load in the mouse peritoneal fluid and blood at 16 and 48 h post CLP

2.6 CLP小鼠病理變化

如圖6所示，對照假手術(shù)組小鼠，組織病理可見小鼠CLP術(shù)后48 h肝有大量空泡脂肪樣變性，肝細(xì)胞腫脹并有炎性細(xì)胞浸潤。肺組織毛細(xì)血管充血，肺間隔增厚，部分肺泡組織結(jié)構(gòu)被破壞，炎細(xì)胞浸潤。

圖3　小鼠CLP術(shù)后16 h和48 h各類白細(xì)胞水平Note.Post CLP 16 h and 48 h groups compare with the sham group，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001.Fig.3 Leukocyte counts in the mice at 16 and 48 h post CLP

圖4　小鼠CLP術(shù)后16 h和48 h血生化水平Note.Post CLP 16 h and 48 h group compared with the sham group，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001.Fig.4 Blood biochemical parameters of the mice at 16 and 48 h post CLP

3　討論

膿毒癥及其引起的膿毒癥休克和多器官衰竭病情兇險，死亡率高，是因感染住院病人死亡的主要原因之一［7］，也是科學(xué)家和臨床醫(yī)生共同的挑戰(zhàn)。機體任何部位的感染均可引起膿毒癥，膿毒癥涉及到全身多系統(tǒng)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，包括炎癥反應(yīng)、免疫功能紊亂、凝血功能障礙、內(nèi)皮損傷、多器官損傷和休克等［8］，其發(fā)病機理目前尚不明了，建立穩(wěn)定性高、重復(fù)好的動物模型是研究膿毒癥發(fā)病機制和篩選評價治療藥物的重要環(huán)節(jié)。

目前建立膿毒癥動物模型的方法主要有：腹腔或靜脈注射外源性內(nèi)毒素或脂多糖；靜脈注射單一活菌或混合菌叢；破壞宿主內(nèi)源性屏障造成內(nèi)源菌叢移位引發(fā)感染［9］。內(nèi)毒素血癥或菌血癥模型可以人為精確控制感染劑量，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，然而從膿毒癥臨床發(fā)病的角度看，患者一般體內(nèi)存在感染病灶，感染灶持續(xù)性地釋放病菌和內(nèi)毒素，從而引起全身炎癥反應(yīng)和循環(huán)、代謝狀態(tài)的改變。短暫一過性的輸入內(nèi)毒素或菌叢可引起動物快速耐受或死亡，不能很好地模擬臨床特征。小鼠CLP膿毒癥模型通過破壞腸道屏障，引起腸內(nèi)菌叢持續(xù)性彌漫釋放，模擬臨床闌尾炎或憩室炎穿孔導(dǎo)致腹膜感染而引起的膿毒癥，病情非一過性，較注射LPS或活菌的誘導(dǎo)方法具有更好的臨床相關(guān)性。

圖5　小鼠CLP術(shù)后16 h和48 h細(xì)胞因子水平Note.Post CLP 16 h and 48 h groups compared with the sham group，*P＜0.05.Fig.5 Cytokine levels of the mice at 16 and 48 h post CLP

圖6　小鼠CLP術(shù)后48 h肝、肺組織病理學(xué)變化Note.A.The normal liver of a sham-operated mouse.B.The hepatic damages of a CLP mouse. C.The normal lung of a sham-operated mouse.D.The lung damages of a CLP mouse.Fig.6 Pathologial changes in the mouse liver and lung at 48 h post CLP

若僅以感染加上SIRS反應(yīng)作為膿毒癥診斷指標(biāo)過于敏感，臨床上患者需要有明確感染或可疑感染加上以下兩者或兩者以上的癥狀作為膿毒癥指標(biāo)［10］：①體溫高于38.5℃或低于35℃；②心率大于90次/分鐘；③呼吸頻率大于20次/分鐘或CO2分壓小于32 mmHg；④白細(xì)胞增多（大于12×109/L）或白細(xì)胞減少（少于4×109/L）或白細(xì)胞正常但不成熟白細(xì)胞大于10%。除此之外，韋志煒［11］報道動脈乳酸水平是重癥膿毒癥嚴(yán)重程度的一個良好指標(biāo)。許娜娜等［12］報道C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）、細(xì)胞因子和凝血系統(tǒng)標(biāo)志物等指標(biāo)可作為膿毒癥的生物標(biāo)志物。小鼠CLP模型能較好地模擬膿毒癥的病理過程，模型動物術(shù)后出現(xiàn)寒顫、軟弱無力，肝腎損傷因子升高，多種炎癥因子水平升高。血中內(nèi)毒素檢出率及細(xì)菌培養(yǎng)陽性率高，動物體溫下降，白細(xì)胞降低以及血流動力學(xué)早期高排低阻，晚期低排高阻的特征也與臨床相仿［13］。小鼠從手術(shù)到死亡經(jīng)歷數(shù)天時間，可以進行實驗研究。

膿毒癥發(fā)病早期過強的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致患者病情惡化和不良預(yù)后的關(guān)鍵因素［14］。TNF-a、IL-1和IL-6是三種主要的促炎因子，過強的炎癥反應(yīng)如果得不到控制會造成“細(xì)胞因子風(fēng)暴”并引起促炎和抗炎失衡［15］，免疫細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，抑炎因子IL-10表達增加，誘發(fā)代償性抗炎反應(yīng)綜合征（CARS）［16］，CARS限制了急性炎癥損傷，但造成“免疫麻痹”狀態(tài)，使病原不能被徹底清除，并容易引起二次感染［17］。單純針對炎癥因子的抗炎治療未能有效提高CLP模型動物和臨床患者的生存率［18］，提示膿毒癥免疫紊亂機制十分復(fù)雜。從本研究可以看出，CLP誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型從結(jié)扎的盲腸持續(xù)地釋放病原，引起多菌叢的混合感染，促炎因子IL1a、IL6、TNFa和抑炎因子IL-10明顯升高，模型很好地模擬了人膿毒血癥SIRS與CARS反應(yīng)癥狀。

綜上所述，CLP小鼠膿毒癥模型操作簡單，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，較好地模擬了臨床膿毒癥的病理過程，方便推廣應(yīng)用。模型制作中，盲腸結(jié)扎長度和穿孔大小被認(rèn)為是影響CLP模型小鼠生存率的關(guān)鍵因素［19］，盲腸結(jié)扎長度代表感染菌量的多少，盲腸穿孔大小代表菌叢流出的快慢。本研究提供了盲腸結(jié)扎50%小鼠的模型指標(biāo)特征，與對照相比，模型指標(biāo)具有明顯的差異變化，是進行膿毒癥致病機制研究和抗炎藥物篩選較好的動物模型。

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Establishment and evaluation of a mouse model of sepsis

JING Xi-zhong2，1，JIA Huan-huan1，LUO Ting1，LING Xue-ying1，LI Yun-feng1，LIU Shu-hua1，MA Jun-feng1，HUANG Ren1，ZHANG Yu1*，WANG Hui2*
（1.Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute，Guangdong Key Laboratory of Experimental Animals Guangzhou，510663，China；2.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006）

【Abstract】Objective The purpose of this study was to establish and evaluate a mouse model of sepsis for studying the mechanism of sepsis and development of anti-inflammatory drugs.Methods The sepsis in mice was induced by cecal ligation and puncture（CLP）.The survival rates，microbial load，liver and kidney damages，cytokines and pathological changes were detected to evaluate the mouse models.Results The death of mice was closely related with the ligated sites. The mice with 50%cecal ligation displayed about 40%of 12-day survival rate，however，all the mice with 75%cecum ligation died within 4 days（P＜0.01）.Compared with the sham surgery group，the mice with 50%cecal ligation had a high microbial load in the blood and abdominal cavity.Leukopenia was also emerged（P＜0.001）.CLP mice demonstrated elevated levels of serum ALT，AST and BUN（P＜0.01）.The levels of IL1a，IL6，IL10，MIP1a，MIP1β，and TNFa were increased a lot.The liver and lung showed obvious pathological injury at 48 h post CLP.Conclusions The established mouse model of CLP shows typical characteristics of sepsis and is an ideal tool for further study of anti-inflammatory drugs.

【Key words】Sepsis；CLP；Mouse model；Inflammatory response；Infection

【中圖分類號】Q95-33

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）02-0158-06

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.009

［基金項目］廣東省科技計劃項目（2015A030302034）。

［作者簡介］荊喜中（1989年-），男，碩士，研究方向：中藥藥理學(xué)。E-mail：jingxzh@foxmail.com

［通訊作者］張鈺（1970年-），女，研究員，E-mail：Zhangyugzh@hotmail.com；王暉（1964年-），男，教授，E-mail：gdwanghui2006@126.com

Corresponding author：ZHANG Yu，Email：Zhangyugzh@hotmail.com；WANG Hui：gdwanghui2006@126.com

［收稿日期］2015-11-02