王雪梅，魏琴，張春，姜濤，段明軍，楊毅寧

（新疆醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，烏魯木齊830011）

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重組腺病毒介導(dǎo)脂聯(lián)素基因?qū)poE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制

王雪梅，魏琴，張春，姜濤，段明軍，楊毅寧*

（新疆醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，烏魯木齊830011）

【摘要】目的 研究腺病毒介導(dǎo)的脂聯(lián)素（APN）過(guò)表達(dá)對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的抑制作用和對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。方法 將12周齡雄性ApoE-/-小鼠120只分為空載腺病毒對(duì)照組和脂聯(lián)素干預(yù)組，每組60只。在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（0天、4周、8周）處死小鼠收集組織。全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血脂指標(biāo)；ELISA法測(cè)定血清APN濃度；油紅O染色法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈血管組織的病理學(xué)變化；Masson染色法檢測(cè)進(jìn)展性斑塊區(qū)的膠原含量和纖維帽厚度變化；免疫熒光法測(cè)定小鼠主動(dòng)脈血管APN和NF-κB p65蛋白的表達(dá)；免疫印跡法檢測(cè)主動(dòng)脈血管APN、NF-κB p65核蛋白和炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果 APN過(guò)表達(dá)抑制了ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。與對(duì)照組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組的動(dòng)脈粥樣硬化病理?yè)p傷面積減少（P＜0.01），動(dòng)脈粥樣硬化損傷程度降低（P＜0.001），總體油紅O染色測(cè)定血管表面損傷百分比，4周時(shí)為（27.78±8.64）vs（33.02±5.18）%；8周時(shí)為（31.58 ±5.87）vs（52.16±5.79）%。脂聯(lián)素減緩了高脂飲食導(dǎo)致的小鼠血清中TC（P＜0.001）、TG（P＜0.001）、LDL-C（P ＜0.001）的濃度增加，使血脂水平趨向正?；?。隨著血清脂聯(lián)素濃度增加，可以阻遏NF-κB通路的激活，抑制NF-κB p65核蛋白和炎癥因子的表達(dá)。結(jié)論 脂聯(lián)素通過(guò)抑制NF-κB通路激活來(lái)減輕AS的炎癥反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】脂聯(lián)素；動(dòng)脈粥樣硬化；ApoE-/-小鼠；炎癥；NF-κB信號(hào)通路

目前普遍認(rèn)可的炎癥學(xué)說(shuō)，認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)慢性炎癥過(guò)程，而AS性疾病是一種全身系統(tǒng)性的血管病變，也是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)［1］。炎癥是AS發(fā)生的關(guān)鍵誘因，有多種炎性因子和黏附分子參與AS的病理過(guò)程，例如炎癥因子CRP、IL-6、IL-8、TNF-a、黏附分子ICAM-1、VCAM-1、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9［2］。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路廣泛存在于機(jī)體各種細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)自身的激活和核易位，由轉(zhuǎn)錄活性區(qū)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與凋亡及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞等，調(diào)控多種基因的表達(dá)和相互作用［3，4］。短暫而快速的NF-κB激活對(duì)機(jī)體的正常生理功能很重要，但當(dāng)各種病理因素持續(xù)刺激誘導(dǎo)NF-κB持久活化時(shí)則會(huì)導(dǎo)致內(nèi)環(huán)境的紊亂，其中發(fā)現(xiàn)NF-κB的異常激活與AS的發(fā)生關(guān)系密切［5］。AS是一種多種因素作用的慢性炎癥過(guò)程，而炎癥作為介導(dǎo)來(lái)研究NF-κB和AS之間關(guān)系的研究報(bào)道較少。

脂聯(lián)素（adiponectin，APN）是脂肪組織分泌的一種有益細(xì)胞因子。脂聯(lián)素在人體內(nèi)的血清濃度是3～30 μg/mL。脂聯(lián)素在體內(nèi)是以三聚體、六聚體和多聚體的形式存在［6］。APN有改善胰島素抵抗、糖脂代謝，抗炎及抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用［7］。但是脂聯(lián)素發(fā)揮保護(hù)作用的途徑還不完全清楚。本研究應(yīng)用重組腺病毒載體使目的基因脂聯(lián)素在ApoE-/-小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)，建立 ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，研究脂聯(lián)素過(guò)表達(dá)，對(duì)小鼠AS病理發(fā)展的影響，以及對(duì)血脂調(diào)節(jié)、炎癥因子和NF-κB信號(hào)通路的影響。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選擇SPF級(jí)ApoE-/-小鼠，12周齡，雄性，體重20～22 g。由上海南方模式生物研究中心［SCXK（滬）2009-0023］贈(zèng)予10只，雌雄各5只，在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部保種繁殖［SYXK（新）2010-0003］，在SPF級(jí)飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。所有涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為IACUC-20130709010）。12 h∶12 h晝夜循環(huán)飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

小鼠的高脂飼料（飼料配方是35%的脂肪，45%的碳水化合物，1.25% 膽固醇。中國(guó)江蘇美迪森生物公司）；pDC316-mCMV-EGFP-mAdipoq和pDC316-mCMV-EGFP腺病毒載體（中國(guó)深圳百恩維生物科技有限公司）；血脂測(cè)定試劑（美國(guó)羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）；APN酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒（美國(guó)Biomerica公司）；油紅O染色液（美國(guó)Amresco公司）；蘇木素染色液（中國(guó)北京中杉金橋）；NF-κB p65，APN一抗（美國(guó)Thermo fisher公司）；熒光二抗DylightTM488和DylightTM594（美國(guó)Thermo Fisher公司）；GAPDH一抗（美國(guó)CST公司）；VCAM-1，IL-6，TNF-a，Lamin A（美國(guó)Abcam公司）；Western blot二抗試劑盒（Invitrogen公司）。

1.3 動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立

隨機(jī)將小鼠分為對(duì)照組60只和脂聯(lián)素干預(yù)組60只，小鼠自由采食，高脂飼料飼養(yǎng)加速ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型建立。實(shí)驗(yàn)期間分別在0周、2周、4周、6周，尾靜脈注射脂聯(lián)素腺病毒或空載腺病毒3×108pfu/100 μL。兩組ApoE-/-小鼠分別喂養(yǎng)0、4、8周后，處死收集標(biāo)本。

圖1　實(shí)驗(yàn)方案示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental protocol

1.4 小鼠主動(dòng)脈血管組織的病理學(xué)檢測(cè)

1.4.1 主動(dòng)脈血管總體油紅O染色檢測(cè)斑塊損傷

手術(shù)顯微鏡下小心分離小鼠主動(dòng)脈，從主動(dòng)脈弓根部開始向下分離直至髂動(dòng)脈分叉處，全部離段取出，將主動(dòng)脈用剪刀縱向剪開，將整根主動(dòng)脈浸于油紅O染色液中15 min，取出主動(dòng)脈放到70%乙醇中分化5 min，換一次乙醇，直到正常組織變?yōu)槿榘咨?，PBS清洗2遍后拍照。使用Image J軟件分析計(jì)算主動(dòng)脈斑塊面積和斑塊損傷區(qū)域占管腔的比率。

1.4.2 主動(dòng)脈弓根部血管Masson三色染色

4%多聚甲醛固定主動(dòng)脈；清水下沖洗；梯度酒精脫水、二甲苯透明；組織石蠟包埋；切片；切片脫蠟，水化；Masson三色染色（參見說(shuō)明書）。應(yīng)用Image J圖像分析軟件，測(cè)量血管動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展性斑塊中膠原纖維的比例和纖維帽的面積。

1.5 血脂指標(biāo)檢測(cè)

心臟采血靜置析出血清，4000 r/min離心10 min，收集血清在-80℃超低溫冰箱保存。全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。

1.6 血清脂聯(lián)素水平檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫法，檢測(cè)血清APN濃度（按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作）。

1.7 免疫熒光法測(cè)定主動(dòng)脈血管APN、vWF、p65蛋白的表達(dá)

NF-κB p65（Thermo，USA）1∶50倍比稀釋，APN （Thermo，USA）1∶200倍比稀釋。二抗second antibody（Thermo，USA）1∶200倍比稀釋。石蠟切片烤片60℃，1 h；脫蠟，浸水，3%H2O2室溫下靜置10 min，微波修復(fù)10 min，滴加一抗，4℃過(guò)夜，滴加濃度為1∶50的二抗，DAPI核染色。在200倍光鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)不同視野分別采集圖像，應(yīng)用Image J圖像分析軟件測(cè)量熒光表達(dá)區(qū)域的面積，算出陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.8 WB法檢測(cè)血管組織中炎癥因子和抗炎因子蛋白的表達(dá)

總蛋白內(nèi)參GAPDH和核蛋白內(nèi)參LAMIN A的表達(dá)量用來(lái)校正上樣可能帶來(lái)的誤差。從組織中提取實(shí)驗(yàn)所需的總蛋白和核蛋白；BCA法蛋白定量；SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組均數(shù)的比較采用兩因素方差分析（general linear model-univariate）或單因素方差分析（One-Way ANOVA），選擇LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 脂聯(lián)素抑制了ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生

總體血管油紅O染色后，與對(duì)照組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組在4周和8周時(shí)的血管動(dòng)脈粥樣硬化表層的損傷比率降低，差異具有顯著性（P＜0.001），4周時(shí)為（27.78±8.64）%vs（33.02±5.18）%；8周時(shí)為（31.58±5.87）%vs（52.16±5.79）%，見圖2。

2.2 脂聯(lián)素減緩了ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)程

在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展性斑塊中，隨著斑塊的發(fā)展，彈力纖維占斑塊的比率是逐漸下降的，纖維帽趨向變薄，面積下降，由穩(wěn)定斑塊變成不穩(wěn)定斑塊，增加血栓形成的危險(xiǎn)。與對(duì)照組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組在4周和8周時(shí)的膠原纖維占不穩(wěn)定斑塊面積的比率增加，纖維帽面積增加，差異均具有顯著性。見表1，圖3。

2.3 血清脂聯(lián)素過(guò)表達(dá)降低血脂水平升高

和對(duì)照組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組的血清脂聯(lián)素水平升高，TC、TG和 LDL-C水平降低，差異均具有顯著性；HDL-C水平差異無(wú)顯著性。提示脂聯(lián)素過(guò)表達(dá)能夠減緩血脂異常的發(fā)展進(jìn)程，

脂聯(lián)素具有糾正異常血脂水平的生物學(xué)功能，減緩了脂質(zhì)代謝紊亂。（見表2）。

圖2　小鼠主動(dòng)脈總體斑塊損傷總體油紅O染色（n=6，±s）Fig.2 The gross appearance of the surface of whole aorta lesions.Oil red staining（n=6，±s）

表1　4周、8周對(duì)照組和脂聯(lián)素干預(yù)組血管損傷面積檢測(cè)結(jié)果（n=6，±s）Tab.1 Mean lesion area and mean lesion rate at 4 weeks and 8 weeks in the control and APN group（n=6，±s）

表1　4周、8周對(duì)照組和脂聯(lián)素干預(yù)組血管損傷面積檢測(cè)結(jié)果（n=6，±s）Tab.1 Mean lesion area and mean lesion rate at 4 weeks and 8 weeks in the control and APN group（n=6，±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.01；**P＜0.001。Note.Compared with the control group，*P＜0.01；**P＜0.001.

分組Groups膠原含量/% Collagen content纖維帽面積/μm2Fibrous cap areas對(duì)照組4周/CON 4 weeks　27.30±2.28　65.63±20.19干預(yù)組4周/APN 4 weeks　28.97±2.54*　89.59±4.78**對(duì)照組8周/CON 8 weeks　23.15±1.28　45.83±5.64干預(yù)組8周/APN 8 weeks　26.65±1.81*　84.18±9.17**

表2　血清脂聯(lián)素和血脂水平比較（n=12，±s）Tab.2 Comparison of the serum APN and TC，TG，LDL-C，HDL-C levels（n=12，±s）

表2　血清脂聯(lián)素和血脂水平比較（n=12，±s）Tab.2 Comparison of the serum APN and TC，TG，LDL-C，HDL-C levels（n=12，±s）

注：與對(duì)照組相比，#P＜0.05；*P＜0.01；**P＜0.001。Note.Compared with the control group，#P＜0.05；*P＜0.01；**P＜0.001.

高密度脂蛋白/HDL-C /mmol/L對(duì)照組0天/CON 0day　23.64±9.17　7.27±3.51　0.61±0.34　0.79±0.46　0.95±0.41干預(yù)組0天/APN 0day　23.60±9.66　8.01±3.07　0.49±0.24　0.96±0.52　1.38±1.18對(duì)照組4周/CON 4 weeks　21.44±6.91　32.43±10.77　1.18±0.31　10.14±1.48　1.29±0.55干預(yù)組4周/APN 4 weeks　71.13±21.63**　28.66±8.11*　1.03±0.39**　8.06±1.74**　0.91±0.33對(duì)照組8周/CON 8 weeks　19.30±6.25　38.12±6.36　2.01±0.77　10.95±3.23　1.86±1.60干預(yù)組8周/APN 8 weeks　80.03±36.86**　24.54±8.29*　1.00±0.30**　7.57±1.46**　1.07±0.26分組Groups脂聯(lián)素APN/μg/mL總膽固醇TC/mmol/L甘油三酯TG/mmol/L低密度脂蛋白/LDL-C /mmol/L

2.4 主動(dòng)脈血管APN過(guò)表達(dá)抑制NF-κB p65和炎癥因子的蛋白表達(dá)

2.4.1 免疫熒光檢測(cè)APN和NF-κB p65在主動(dòng)脈血管的表達(dá)

和對(duì)照組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組APN蛋白表達(dá)區(qū)域占血管內(nèi)膜和中膜面積的百分比表達(dá)增加，NF-κB p65核蛋白表達(dá)占內(nèi)膜和中膜的面積百分比減少，差異均具有顯著性。提示隨著脂聯(lián)素在血管內(nèi)膜和中膜中的表達(dá)增加，NF-κB p65核蛋白表達(dá)降低，脂聯(lián)素抑制了NF-κB的激活。見表3，圖4，5。2.4.2 APN降低了NF-κB p65蛋白和炎癥因子的表達(dá)

和對(duì)照組相比，脂聯(lián)素干預(yù)組的APN蛋白表達(dá)增加，NF-κB p65核蛋白表達(dá)降低，差異均具有顯著性。提示隨著脂聯(lián)素在血管中的表達(dá)增加，NF-κB p65核蛋白表達(dá)降低，脂聯(lián)素抑制了NF-κB的激活（表4、5及圖6）。

圖3　小鼠主動(dòng)脈弓根部的Masson染色（苯胺藍(lán)、酸性品紅和麗春紅三色，×200，n=6，±s）Fig.3 Histology of the aortic arch root.（Masson staining，×200，n=6，±s）

表3　脂聯(lián)素和NF-κB p65在血管中的表達(dá)（n=6，±s）Tab.3 Expression of adiponectin and NF-κB p65 in the aortas（n=6，±s）

表3　脂聯(lián)素和NF-κB p65在血管中的表達(dá)（n=6，±s）Tab.3 Expression of adiponectin and NF-κB p65 in the aortas（n=6，±s）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.01；**P＜0.001。Note.Compared with the control group，*P＜0.01；**P＜0.001.

p65陽(yáng)性表達(dá)占血管內(nèi)膜和中膜的比率p65+（intimal+medial）area/%對(duì)照組0天/CON 0day　9.84±1.97　4.73±1.20干預(yù)組0天/APN 0day　10.81±2.12　4.44±1.58對(duì)照組4周/CON 4 weeks　18.10±5.17　7.95±1.46干預(yù)組4周/APN 4 weeks　41.51±12.67**　6.05±1.23*對(duì)照組8周/CON 8 weeks　23.46±3.05　11.92±2.18干預(yù)組8周/APN 8 weeks　64.79±7.21**　7.94±1.53*分組Groups脂聯(lián)素陽(yáng)性表達(dá)占血管內(nèi)膜的比率APN/intimal area/%

表4　血管APN蛋白和NF-κB p65核蛋白的表達(dá)（n=3，±s）Tab.4 Expression of APN andNF-κB p65 proteins in the aortic wall（n=3，±s）

表4　血管APN蛋白和NF-κB p65核蛋白的表達(dá)（n=3，±s）Tab.4 Expression of APN andNF-κB p65 proteins in the aortic wall（n=3，±s）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.001。Note.Compared with the control group，**P＜0.001.

分組Groups　APN灰度值/Gray value　GAPDH灰度值/Gray value　NF-κBp65灰度值/Gray value　LAMIN A灰度值/Gray value對(duì)照組0天/CON 0day　6.43±0.16　12.89±0.47　5.69±0.49　11.26±1.05干預(yù)組0天/APN 0day　5.94±0.13　11.43±0.75　6.50±0.25　12.97±0.54對(duì)照組4周/CON 4 weeks　7.38±0.06　13.21±0.75　18.32±1.32　13.10±0.70干預(yù)組4周/APN 4 weeks　16.37±1.86**　11.63±0.92　10.08±1.99**　12.12±0.79對(duì)照組8周/CON 8 weeks　7.12±0.12　11.89±0.54　19.81±0.97　12.42±0.76干預(yù)組8周/APN 8 weeks　18.90±0.94**　12.37±1.41　11.87±2.05**　13.19±0.22

圖4　APN和vWF在主動(dòng)脈血管的表達(dá)Fig.4 Expression of APN and vWF in the aortic wall

圖5　NF-κB p65核蛋白在主動(dòng)脈血管的表達(dá)Fig.5 Nuclear NF-κB p65 expression in the aortic wall

表5　動(dòng)脈血管VCAM-1、TNF-a、IL-6蛋白表達(dá)（n=3，±s）Tab.5 Expression of the VCAM-1，TNF-a and IL-6 proteins in the aortic wall（n=3，±s）

表5　動(dòng)脈血管VCAM-1、TNF-a、IL-6蛋白表達(dá)（n=3，±s）Tab.5 Expression of the VCAM-1，TNF-a and IL-6 proteins in the aortic wall（n=3，±s）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.001。Note.Compared with the control group，**P＜0.001.

IL-6灰度值Gray value對(duì)照組0天/CON 0 day　1.94±0.63　3.28±0.53　4.12±0.14干預(yù)組0天/APN 0 day　2.48±0.72　3.91±0.54　4.13±0.79對(duì)照組4周/CON 4 weeks　4.48±1.18　7.02±1.72　8.10±1.69干預(yù)組4周/APN 4 weeks　3.27±0.26　3.41±0.49*　4.79±0.92*對(duì)照組8周/CON 8 weeks　6.79±0.42　7.88±2.18　10.85±1.54干預(yù)組8周/APN 8 weeks　5.64±1.15　4.74±0.76*　6.27±0.99*分組Groups VCAM-1灰度值Gray value TNF-a灰度值Gray value

圖6　血管APN、核NF-κB p65蛋白和炎癥因子的表達(dá)Fig.6 Expression of APN and NF-κB p65 proteins and inflammatory factors in the aortic wall

3　討論

脂聯(lián)素（APN）是脂肪組織分泌的一種起正向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子［8］。研究表明APN增加脂質(zhì)分解作用，使得游離脂肪酸（FFA）釋放量顯著下降，誘導(dǎo)血液中的FFA進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞中氧化分解，進(jìn)而降低血脂水平［9］。這和本研究中APN顯著降低TC、TG、LDL使血脂趨于正?；淖饔檬且恢碌?。APN加強(qiáng)脂肪代謝過(guò)程中各種轉(zhuǎn)運(yùn)體及酶的基因表達(dá)，增加轉(zhuǎn)運(yùn)體和酶的活性，最終調(diào)節(jié)血脂趨向正?；?0］。脂聯(lián)素沒有顯著增加HDL-C的水平，可能原因是本研究選用的是ApoE-/-小鼠，而載脂蛋白E主要調(diào)節(jié)的是LDL，對(duì)于HDL沒有顯著的作用。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路是一個(gè)和炎癥密切相關(guān)的信號(hào)通路。在細(xì)胞中，NF-κB以二聚體的形式存在，主要有經(jīng)典途徑的異源二聚體p65/ p50和同源二聚體p50/p50，以及非經(jīng)典途徑中的RelB/p50或RelB/p52［11］。NF-κB與IκB結(jié)合的三聚體復(fù)合物在靜息狀況下存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激、細(xì)胞因子等的作用時(shí)，IκB激酶（IKK）的構(gòu)象發(fā)生改變，被相關(guān)信號(hào)通路控件識(shí)別并降解，NF-κB游離，隨后移入核內(nèi)，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，也就是NF-κB信號(hào)通路的激活［12］。本研究中，隨著APN在血管中的過(guò)表達(dá)，NF-κB p65的核蛋白表達(dá)降低，也就是脂聯(lián)素能夠抑制NF-κB的激活，阻滯炎癥反應(yīng)對(duì)AS的促進(jìn)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射腺病毒載脂聯(lián)素，造成脂聯(lián)素的過(guò)表達(dá)，脂聯(lián)素的血漿濃度達(dá)到對(duì)照組的48倍，14 d后病理切片顯示動(dòng)脈斑塊被抑制了30%，實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)表明血管細(xì)胞粘附分子被抑制了29%，A類清道夫受體（class A scavenger receptor，SR-A）的蛋白表達(dá)減少了34%，顯著降低了TNF-a的水平，而主動(dòng)脈組織巨噬細(xì)胞表面的B類清道夫受體CD36不受影響，說(shuō)明 APN緩解改善了 AS的炎性狀態(tài)［13］。有研究證實(shí)，APN能顯著抑制由脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞里TNF-a mRNA的表達(dá)，TLR（toll-like receptor，TLR）介導(dǎo)的NF-κB的激活；這種抑制TLR介導(dǎo)的NF-κB的激活作用由補(bǔ)體Clq受體介導(dǎo)達(dá)成［14］。APN促進(jìn)NF-κB抑制蛋白（IκB）在巨噬細(xì)胞中的磷酸化，使得NF-κB處于阻遏狀態(tài)，降低炎性反應(yīng)水平［15］。這與本研究結(jié)果是一致的，脂聯(lián)素干預(yù)組 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈血管中的炎癥因子TNF-a、IL-6、黏附分子VCAM-1的蛋白表達(dá)顯著降低。綜上所述，APN通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減緩AS的發(fā)展。開展進(jìn)一步的研究，就APN對(duì)NF-κB上游激酶IKKβ、NIK的作用研究，或者可能的旁路激酶PKA、PKC的作用研究，能夠更加全面的認(rèn)識(shí)APN對(duì)于炎癥和AS的作用機(jī)制。

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Mechanism of the effect of rAd-APN gene on atherosclerosis in ApoE-/-mice

WANG Xue-mei，WEI Qin，ZHANG Chun，JIANG Tao，DUAN Ming-jun，YANG Yi-ning*
（Xinjiang Key Laboratory of Medical animal Model Research，Clinical Medical Research Institute of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

【Abstract】Objective Atherosclerosis（AS）is a common pathological basis of cardiovascular diseases.Adiponectin（APN）has been shown to have an anti-AS effect，and the underlying mechanisms，however，are largely unknown.Nuclear transcription factor κB（NF-κB）has also been regarded as a proatherogenic factor，mainly because of its regulation of a variety of the proinflammatory genes linked to AS.It is hypothesized that the inhibitory effects of APN on AS is through the inhibition of NF-κB signaling pathway.The aim of this study was to test the hypothesis via investigation and validation of the inhibitory effect of APN on AS in ApoE-/-mice，and to delineate the roles of NF-κB signaling pathway in modulating the APN effect on AS in vivo.Methods APN overexpression in ApoE-/-mice were mediated by transfecting adenovirus bearing a vector encoding for APN and enhanced green fluorescent protein（Ad-APN-eGFP）.The AS in ApoE-/-mice was induced by feeding a high-fat diet.To validate the inhibitory effect of the adenovirus mediated APN overexpression on AS inthe ApoE-/-mice.120 male ApoE-/-mice aged 12 weeks were randomly and evenly assigned into two groups（60 mice per group），and were fed with a high-fat diet to induce AS.At 0 day，2，4，and 6 weeks of high-fat diet feeding.The 2 groups of mice were injected intravenously in the tail with either 100 μL（3.0×108p.f.u）of Ad-eGFP virus（control group）or the same amount of Ad-APN-eGFP virus（APN group）.Blood samples and aortic tissues were taken at 0 day，4，and 8 weeks of high-fat diet feeding.For the blood samples，F(xiàn)ABA was used to analyze the concentrations of blood lipids and ELIZA was used to test the concentrations of serum APN.For the aortic tissues，oil red O staining was used to detect the surface lesion percentage.Masson staining was used to evaluate the collagen content and fibrous cap thickness of the plaque area.Immunofluorescence method was used to detect APN and NF-κB p65 expression.Western blot was used to detect the expressions of APN，nuclear NF-κB p65 and the downstream factors of NF-κB pathway.Results APN inhibited the formation of atherosclerotic plaque in ApoE-/-mice.The lesion formation in aortic sinus was significantly inhibited（P ＜0.01）.Compared with the control group，the oil red O staining showed that the surface area ratio of atherosclerotic lesions was decreased significantly in the Ad-APN group（P＜0.001）：the percentage of surface lesions in the 4 weeks groups was 27.78±8.64 vs.33.02±5.18（%）；the 8 weeks groups was 31.58±5.87 vs.52.16±5.79（%）.As the serum APN was increased，the concentration of TC，TG and LDL-C were significantly decreased（P＜0.001 for all），and the growth of body weight was slowed down（P＜0.05）.APN effectively inhibited the expression of NF-κB nuclear protein p65 and inflammatory factors.Conclusions Adiponectin reduces the inflammatory reactions in atherosclerosis through inhibiting the NF-κB pathway.

【Key words】Adiponectin；Atherosclerosis；ApoE-/-mice；Inflammation；NF-κB signaling pathways

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0175-08

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.012

［基金項(xiàng)目］新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（2015211C095）；新疆重大疾病醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地（2010DS890294）開放課題（SKLIB-XJMDR-2014-16）。

［作者簡(jiǎn)介］王雪梅（1983-），女，助理研究員，研究方向：心血管病學(xué)動(dòng)物疾病模型制作和發(fā)病機(jī)制。E-mail：wxuemei1983@sina.com

［通訊作者］楊毅寧（1973-），教授，主任醫(yī)師，研究方向：心血管病學(xué)診療。E-mail：65242155@qq.com

Corresponding author：YANG Yi-ning，Email：65242155@qq.com

［收稿日期］2015-11-23