郭秀秀

【摘 要】 目的：建立復(fù)方甲苯咪唑乳膏的微生物限度檢查方法。方法：按《中國藥典》2015年版第三部通則非無菌微生物限度檢查法規(guī)定的常規(guī)法進行驗證。結(jié)果：銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以常規(guī)法驗證回收率均大于70%，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌液對照組和試驗組生長良好。結(jié)論：需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)采用常規(guī)的平皿傾注法，控制菌的檢查采用常規(guī)法。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)方甲苯咪唑乳膏；微生物限度檢驗法；藥品檢驗

【中圖分類號】R286.0 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）11-0012-02

復(fù)方甲苯咪唑乳膏用于驅(qū)除蛔蟲、蟯蟲，其主要成分為鹽酸左旋咪唑和甲苯咪唑。為了保證所采用的檢驗方法適合于該藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)以及控制菌的檢查，確認供試液制備、測定方法及檢測系統(tǒng)適用于該藥品的檢驗。研究參照《中國藥典》[1]2015年版第三部通則“1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”以及“1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法”、《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》[2]，建立復(fù)方甲苯咪唑乳膏微生物限度檢驗方法，并進行方法適用性試驗，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 試驗環(huán)境 根據(jù)2015年版《中國藥典》第三部“9203藥品微生物質(zhì)量管理原則”[3]規(guī)定，試驗在環(huán)境潔凈度B級、局部潔凈度A級的單向流空氣的無菌室進行，陽性菌操作在符合國家Ⅱ級生物安全標準的生物安全柜內(nèi)進行。

1.2 儀器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）；GHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海金慧科電子有限公司）；MJX-160B-Z型微電腦霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海市博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TZQ-Ⅱ型勻質(zhì)器型號（天津市津德實驗儀器技術(shù)開發(fā)中心）。

1.3 材料 復(fù)方甲苯咪唑乳膏（批號：160101、160102、160103，宿州億帆藥業(yè)有限公司），0.1%無菌吐溫溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（自配），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號：20151210-00）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號：20160111-00）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號：20151110-00）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：20150716-00）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號：20151026-00）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，批號：20151112-00）等均由杭州微生物試劑有限公司提供。

1.4 試驗菌種 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B） 10 104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B） 63 501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26 003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003]等由中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心和中國藥品生物制品檢定所提供，試驗用菌株的傳代次數(shù)為3代。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌懸液的制備及菌懸液菌落數(shù)的檢查

2.1.1 菌懸液的制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的銅綠假單胞菌的TSB培養(yǎng)物1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-6備用，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌用同樣方法分別稀釋至10-5和10-8備用，取經(jīng)25℃培養(yǎng)2～3天的白色念珠菌的SDB培養(yǎng)物1ml，用上述方法稀釋至10-5，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加4mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-6，備用。

2.1.2 菌懸液中菌落數(shù)的檢查 取“2.1.1”銅綠假單胞菌10-6級菌懸液、枯草芽孢桿菌10-5級菌懸液、金黃色葡萄球菌10-8級菌懸液各0.1ml，分別用已滅菌的45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測定兩皿；取2.1.3白色念珠菌10-5級菌懸液、黑曲霉10-6孢子菌懸液各0.1ml，分別用已滅菌的45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和已滅菌的45℃沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測定兩皿，按《中國藥典》2015年版規(guī)定溫度培養(yǎng)一定時間，計數(shù)，均應(yīng)不大于100cfu/ml；實測結(jié)果見表1，符合要求。

2.2 供試液制備 取本品最小包裝兩支（10g/支），按微生物限度檢查法規(guī)定稱取10g，加40℃無菌0.1%吐溫溶液至100ml，勻漿儀2000轉(zhuǎn)/min，3min混勻，即為1∶[KG-*2]10的供試品溶液。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的適用性試驗

2.3.1 采用常規(guī)法（即平皿傾注法） 進行3次獨立的平行試驗。

2.3.1.1 試驗組 取5支裝有1∶[KG-*2]10供試液的試管，分別加“2.1.1”試驗菌液0.1ml，使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu，分別取上述試驗液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，立即注入20ml溫度不超過45℃熔化的無菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或無菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

2.3.1.2 菌液對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，按試驗組操作。

2.3.1.3 供試品對照組 取“2.2”制備好的供試液，以無菌0.1%吐溫溶液代替菌液同試驗組操作。

2.3.1.4 陰性對照 取無菌0.1%吐溫溶液1ml置90mm的無菌平皿中，立即注入20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

從表2、表3可知，3次平行試驗，試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值與菌液對照組平均菌落數(shù)的比值均在0.5～2范圍內(nèi)。

2.4 控制菌檢查方法的適用性試驗 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查方法的適用性試驗：按常規(guī)法進行三次平行試驗。

2.4.1 試驗組 分別取“2.2”中1∶[KG-*2]10供試液10ml及上述不大于100cfu/ml的銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌1ml，分別接種置90ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置35℃培養(yǎng)18～24h，按相應(yīng)的控制菌的檢查法檢查。

2.4.2 菌液對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，同試驗組操作。

2.4.3 供試品對照組 取1∶[KG-*2]10供試液10ml，以0.1%無菌吐溫溶液代替菌液同試驗組操作。

2.4.4 陰性對照組 取無菌0.1%吐溫溶液11ml，接種置90ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置35℃培養(yǎng)18～24h，按相應(yīng)的控制菌的檢查法檢查。

由表4方法驗證結(jié)果可以看出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌液對照組、試驗組生長良好，說明復(fù)方甲苯咪唑乳膏對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌無抑菌作用或抑菌作用較弱。

3 討論

3.1 由上述驗證結(jié)果可知，三批復(fù)方甲苯咪唑乳膏在需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查的方法適用性試驗中，平皿法對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌的回收試驗均符合要求；從表4可知，控制菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查可采用常規(guī)法檢查。

3.2 培養(yǎng)基影響 本次驗證所用培養(yǎng)基均由杭州微生物試劑有限公司提供，在驗證前每批培養(yǎng)基均應(yīng)進行無菌及性能檢查，符合2015版《中國藥典》要求方可用于微生物方法驗證。

3.3 菌種及菌液影響因素 《中國藥典》2015年版要求選用標準菌株，實驗所用黑曲霉菌株由中國藥品生物制品檢定所提供，其他菌株由中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供，均選用第3代為試驗菌，符合《中國藥典》2015版實驗菌株不得超過5代的標準。菌懸液制備完成后立即使用，未超過《中國藥典》2015年版規(guī)定的“菌液制備后室溫下放置，應(yīng)在2h內(nèi)使用”的要求。

3.4 培養(yǎng)條件影響因素 《中國藥典》2015年版規(guī)定需氧菌用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃～35℃，培養(yǎng)時間不得超過3d，實驗取33℃，培養(yǎng)3d，符合要求。霉菌和酵母菌采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20℃～25℃培養(yǎng)時間不超過5d，本實驗采用25℃培養(yǎng)5d，符合要求。

3.5 稀釋劑的影響 因乳膏供試品不易混和均勻，故實驗過程中采用0.1%無菌吐溫溶液溶解供試品，再用勻漿儀進行攪拌混合。然后用pH7.0無菌氯化鈉未檢出蛋白胨緩沖液（自配）稀釋到合適稀釋級，符合《中國藥典》2015年版油脂類供試品處理要求。

3.6 菌落計數(shù)是方法驗證實驗過程中極為重要的一步，實驗采用含菌量不大于100cfu/ml菌懸液，計數(shù)時應(yīng)仔觀察，必要時可借助放大鏡、兩人復(fù)核等方法，減少操作誤差。

參考文獻

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：80-90.

[2]中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351-369.

[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：220-221.

（收稿日期：2016.04.11）