李星輝，喬燕，馬玉安，齊文華，李彩霞，李寶鵑

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β2腎上腺素能受體基因Arg16Gly和Gln27Glu多態(tài)性與高海拔地區(qū)藏族人群原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

李星輝，喬燕，馬玉安，齊文華，李彩霞，李寶鵑

摘要

目的: 檢測(cè)高海拔地區(qū)藏族人群β2腎上腺素能受體（β2-AR）基因Argl6Gly和Gln27Glu多態(tài)性，并研究其與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。

方法：選擇原發(fā)性高血壓患者（原發(fā)性高血壓組）385例及正常對(duì)照（對(duì)照組）297例為研究對(duì)象，通過SNaPshot微測(cè)序技術(shù)測(cè)定其基因型和等位基因，對(duì)在兩組人群中的頻率分布進(jìn)行對(duì)比。

結(jié)果: β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu多態(tài)性的基因型和等位基因頻率原發(fā)性高血壓組和對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），進(jìn)一步進(jìn)行不同性別人群間的對(duì)比分析，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

結(jié)論：未觀察到β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu多態(tài)性與高海拔地區(qū)藏族人群原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 受體, 腎上腺素能β2 ；基因；高血壓；藏族

Objective: To investigate β2 adrenergic receptor (β2-AR) gene polymorphism, Arg16Gly, Gln27Glu and essential hypertension (EH) occurrence in Tibetan population living at high altitude area.

Methods: Our research included in 2 groups: EH group, n=385 patients and Control group, n=297 normal healthy subjects. β2-AR polymorphisms of Arg16Gly and Gln27Glu were detected by Snapshot mini-sequencing technique and their frequencies were compared between 2 groups and male, female genders.

Results: The genotype and allele frequency distributions of Arg16Gly and Gln27G1u were similar between 2 groups, P＞0.05; there were no significant differences between male and female genders, P＞0.05.

Conclusion: No obvious relationship was found between β2-AR gene polymorphism (Arg16Gly, Gln27Glu) and EH occurrence in Tibetan population living at high altitude area.

Key words Receptors, adrenergic, beta-2; Gene; Hypertension; Tibetan

(Chinese Circulation Journal, 2016, 31:372.)

高血壓發(fā)病與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)，大約25%～40%的血壓升高程度與遺傳基因相關(guān)[1]。到目前為止，有200多個(gè)基因被列為原發(fā)性高血壓候選基因，近年來(lái)研究較多的原發(fā)性高血壓易感性有腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)（RAAS）、交感神經(jīng)系統(tǒng)、細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等基因[2]。但諸多文獻(xiàn)顯示，這些相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）與原發(fā)性高血壓的關(guān)系，不同種族、不同人群研究結(jié)果不盡相同，存在較多差異,爭(zhēng)議較多，因此值得進(jìn)一步深入分析探討。在原發(fā)性高血壓候選基因識(shí)別研究中，β2腎上腺素能受體（β2-AR）基因是較受重視的一個(gè)候選基因。近年來(lái)盡管國(guó)內(nèi)外已在這方面進(jìn)行了一些研究，但結(jié)果不一，提示不同種族和人群該基因SNPs的分布及其在原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制中所起的作用存在差異[3，4]。鑒于遺傳背景對(duì)遺傳性疾病發(fā)病的影響，我們選擇地處我國(guó)西北甘肅省高海拔少數(shù)民族地區(qū)藏族人群作為研究對(duì)象，采用病例—對(duì)照基礎(chǔ)上的關(guān)聯(lián)分析研究,即以確診的原發(fā)性高血壓患者作為病例,以不患有該病但具有可比性的個(gè)體作為對(duì)照,應(yīng)用SNaPshot技術(shù)比較原發(fā)性高血壓組與對(duì)照組中各基因型和等位基因的頻率和差異,以期探討此基因多態(tài)性與這一人群原發(fā)性高血壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

研究對(duì)象：2014-03至2014-10，采用隨機(jī)、分層、整群抽樣的方法,對(duì)甘肅省甘南藏族自治州2個(gè)城區(qū)、8個(gè)農(nóng)村定居地區(qū)的18歲以上人群進(jìn)行橫斷面流行病學(xué)調(diào)查。在10個(gè)抽樣地區(qū)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)單位共調(diào)查18歲以上藏族成人682例，其中原發(fā)性高血壓患者（原發(fā)性高血壓組）385例，正常對(duì)照（對(duì)照組）297例。所有研究對(duì)象為世居高原地區(qū)人群，兩組之間無(wú)親緣關(guān)系，無(wú)異族通婚史。本研究前期通過甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，調(diào)查獲得當(dāng)?shù)卣猓惺苷{(diào)查者均簽署了知情同意書。

血壓測(cè)量：采用經(jīng)核準(zhǔn)的水銀柱血壓計(jì)測(cè)量右臂坐位血壓共3次。測(cè)量前30 min, 要求調(diào)查對(duì)象不能飲酒、吸煙、飲咖啡或茶及進(jìn)行較為劇烈的活動(dòng),休息5 min 后測(cè)量血壓。原發(fā)性高血壓組患者排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、心臟瓣膜病、先天性心臟病、糖尿病、肝和腎功能疾患等，均符合2010年中國(guó)高血壓防治指南的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。對(duì)照組為從未接受過降壓治療并且靜息時(shí)收縮壓＜140 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）和舒張壓＜90 mmHg者,無(wú)高血壓家族史，同樣排除了上述疾患，性別、年齡均基本匹配。被調(diào)查者采血前8～14 h禁食，晨間采取坐位肘部靜脈血5 ml，標(biāo)本采取后存放至隨身攜帶的冷藏包內(nèi)，后用當(dāng)?shù)丶部刂行睦滏溰囘\(yùn)送至同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)行DNA提取及檢測(cè)。

基因型測(cè)定：本次實(shí)驗(yàn)采用SNaPshot技術(shù)也稱微測(cè)序技術(shù)對(duì)β2-AR Argl6Gly（rs1042713）和Gln27Glu（rs1042714）多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)。從GENBANK中獲取人類β2-AR編碼基因，并獲得位點(diǎn)信息。根據(jù)以上信息位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，上游引物：5’-ATGAGGCTTCCAGGCGTC-3’，下游引物：5’-GATGAGAGACATGACGATGCC-3’（上海生物工程有限公司合成）。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）體系20 μl，其中含有1.0 μl的基因組DNA、10×buffer 2.0 μl、50 mmol/L MgCI 20.8 μl、脫氧核苷三磷酸（dNTP） 0.5 μl、PCR引物1.0 μl、Platinum Taq聚合酶0.2 μl。PCR循環(huán)參數(shù)為：預(yù)變性95℃ 2 min后，繼之進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后72℃ 持續(xù)5 min延伸。后取2.0 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ExoI酶和蝦堿性磷酸酶（SAP）純化，主要是用ExoI去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用SAP去除反應(yīng)中剩余的dNTP。SNP分型利用1.0 μl上述純化延伸產(chǎn)物，與GenescanTM-120LIZ Size Standard 0.5 μl和去離子甲酰胺8.5 μl混合均勻后,95℃變性5 min，ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行分型。收集的原始數(shù)據(jù)用Gene Mapper4.0 （Applied Bio systems Co.Ltd.USA）分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，分類資料用構(gòu)成比和率描述，用直接計(jì)數(shù)法分別計(jì)算對(duì)照組和原發(fā)性高血壓組基因型頻率,由基因型頻率計(jì)算等位基因頻率；各組基因型、等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)樣本的群體代表性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

原發(fā)性高血壓組與對(duì)照組的基線資料比較（表1）： 原發(fā)性高血壓組體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓均高于對(duì)照組（P均＜0.05）。

表1 原發(fā)性高血壓組與對(duì)照組基線資料比較（±s）

基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)（表2）: 本人群原發(fā)性高血壓組、對(duì)照組的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞O.05），遺傳學(xué)上該樣本可代表藏族人群。

表2 β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu多態(tài)性基因型頻率的比較（%）

PCR擴(kuò)增結(jié)果及SNaPshot基因分型結(jié)果：圖1所示為β2-AR基因Argl6Gly、Gln27Glu PCR擴(kuò)增結(jié)果，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為230 bp。圖2所示為β2-AR基因Arg l6Gly、Gln27Glu SNaPshot基因分型結(jié)果，延伸產(chǎn)物堿基的對(duì)應(yīng)顏色A：綠色，G：藍(lán)色，C：黑色，Argl6Gly（rs1042713）基因型分別為AA、AG、GG，Gln27Glu（rs1042714） 基因型分別為GG、GC、CC。

圖1 β2-AR基因Argl6Gly、Gln27Glu PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 β2-AR基因Argl6Gly、Gln27Glu SNaPshot基因分型結(jié)果

β2-AR基因多態(tài)性同藏族原發(fā)性高血壓的相關(guān)性分析：SNaPshot分析Arg16Gly原發(fā)性高血壓組332例、對(duì)照組257例成功，Gln27Glu原發(fā)性高血壓組336例、對(duì)照組260例成功。結(jié)果提示Arg16Gly和Gln27Glu的基因型頻率在藏族原發(fā)性高血壓組和對(duì)照組中的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），等位基因頻率分布差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。按性別進(jìn)行分層分析發(fā)現(xiàn)，差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。

表3 兩組β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu基因型和等位基因頻率比較[例（%）]

表4 不同性別兩組β2-AR基因Argl6Gly和Gln27Glu基因型和等位基因頻率比較[例（%）]

3 討論

1987年, Kobilka等[6]首先發(fā)現(xiàn)并發(fā)表了β2-AR基因全序列，該基因定位于染色體5q31-5q32區(qū)域,無(wú)內(nèi)含子,編碼區(qū)包含1239個(gè)堿基對(duì),編碼413個(gè)氨基酸。近年來(lái)，隨著心血管疾病研究的深入，β2-AR基因多態(tài)性位點(diǎn)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn), 迄今研究最多的為+46位核苷酸由腺嘌呤（A）轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤（G），使其編碼的第16位的精氨酸（A）變?yōu)楦拾彼幔═），即A46G突變；+79位核苷酸由鳥嘌呤（G）為胞嘧啶（C）所取代，使編碼第27位的谷氨酰胺（G）變?yōu)楣劝彼幔∕），即G79C突變。關(guān)于β2-AR基因16、27位點(diǎn)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系國(guó)外報(bào)道不一。Kotanko等[3]對(duì)加勒比海地區(qū)非洲人后裔的研究中認(rèn)為β2-AR基因Glyl6等位基因可能為原發(fā)性高血壓的易感等位基因, Busjahn等[7]發(fā)現(xiàn)Argl6等位基因與原發(fā)性高血壓相關(guān)。但Candy等[8]以南非黑人為對(duì)象，未發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓與β2-AR基因Argl6Gly多態(tài)性有關(guān)。我國(guó)一項(xiàng)對(duì)北方漢族人群的研究中，Ge等[9]測(cè)定了503例2級(jí)高血壓患者及504名正常血壓者的β2-AR Arg16Gly基因型，結(jié)果顯示在此高血壓人群內(nèi)Gly16存在頻率很高。吳弘等[10]分別報(bào)道了β2-AR與中國(guó)大別山、安徽地區(qū)漢族人群原發(fā)性高血壓的關(guān)系，其中Argl6Gly SNP在正常血壓和原發(fā)性高血壓人群中的分布有顯著性差異，提示其可能與原發(fā)性高血壓相關(guān)聯(lián)。Bray等[11]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓組Glu27等位基因明顯高于對(duì)照組。而Yu等[12]和朱敏等[13]的研究未顯示Gln27/Glu多態(tài)性與原發(fā)性高血壓有相關(guān)性。本研究以甘肅甘南藏族自治州藏族人群為研究對(duì)象，結(jié)果顯示Argl6Gly、Gln27Glu基因型和等位基因在原發(fā)性高血壓組和對(duì)照組中的構(gòu)成比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩位點(diǎn)多態(tài)性與藏民族原發(fā)性高血壓無(wú)相關(guān)性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，藏族男女性人群Argl6Gly、Gln27Glu位點(diǎn)多態(tài)性與高血壓發(fā)病均無(wú)相關(guān)性。

β2-AR通過激活環(huán)磷酸腺苷（cAMP）依賴性的蛋白激酶A和其他信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)許多生理性和代謝性的過程，包括心率、血壓、腎臟的水、鈉排泄和潴留等[11]。β2-AR多態(tài)性是血管應(yīng)激反應(yīng)的主要決定因素，但關(guān)于其多態(tài)性與高血壓相關(guān)性未得出統(tǒng)一結(jié)論，研究結(jié)果之間的分歧提示原發(fā)性高血壓在不同種族可能具有不同的發(fā)病機(jī)理。目前該基因位點(diǎn)在低海拔地區(qū)漢族人群中多有相關(guān)報(bào)道。流行病學(xué)研究表明原發(fā)性高血壓的患病率在我國(guó)各地區(qū)、民族之間差別很大，生活在北方或高原地區(qū)的藏族、蒙古族和朝鮮族等患病率較高，而生活在南方或非高原地區(qū)的壯族、苗族和彝族等患病率則較低[5]。本研究人群為居住在海拔高度3000米左右的甘肅省甘南藏族自治州，地理位置偏遠(yuǎn)，人口遷徙較小，遺傳背景較單一，樣本同質(zhì)性較好，分析效能可信度高，可為研究這些人群原發(fā)性高血壓發(fā)病方面提供理論依據(jù)。

SNaPshot技術(shù)也稱微測(cè)序技術(shù)，可同時(shí)進(jìn)行多達(dá)幾十個(gè)SNPs的檢測(cè)，準(zhǔn)確性高，檢測(cè)速度快，成本低廉，目前，已經(jīng)廣泛地用于人類疾病相關(guān)性分析。本研究通過此技術(shù)初步分析了甘肅高海拔地區(qū)藏族β2-AR基因Argl6 Gly、Gln27Glu位點(diǎn)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。研究結(jié)果提示：此基因上述兩位點(diǎn)多態(tài)性可能不是此地區(qū)藏族原發(fā)性高血壓的遺傳標(biāo)志。當(dāng)然原發(fā)性高血壓的遺傳規(guī)律復(fù)雜，受多種因素影響，研究結(jié)果差異分析原因可能不僅是由于種族、地域等環(huán)境因素的不同，而且位點(diǎn)之間存在連鎖不平衡，病例對(duì)照的嚴(yán)格選擇以及樣本量的大小也會(huì)影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究人群具有自己獨(dú)特的宗教風(fēng)俗和民族習(xí)慣等，在收集資料及采集血樣時(shí)部分人群不能良好配合，農(nóng)牧地區(qū)尤其明顯，因此樣本量相對(duì)偏少。今后研究中如能擴(kuò)大樣本量，通過大規(guī)模、高質(zhì)量、多位點(diǎn)、多基因間的聯(lián)合研究，相信結(jié)果會(huì)更有說服力。

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（編輯：漆利萍）

Relationship Between β2-Adrenergic Receptor Gln27Glu Gene Polymorphism and Essential Hypertension Occurrence in Tibetan Population Living at High Altitude Area

LI Xing-hui, QIAO Yan, MA Yu-an, QI Wen-hua, LI Cai-xia, LI Bao-juan.
Department of Cardiology, Gansu Provincial Hospital, Lanzhou (730000), Gansu, China
Corresponding Author: QIAO Yan, Email: 13669336252@163.com

Abstract

作者單位：730000 甘肅省蘭州市，甘肅省人民醫(yī)院 心內(nèi)科

作者簡(jiǎn)介：李星輝 副主任醫(yī)師 博士 主要從事心血管內(nèi)科基礎(chǔ)與臨床研究 Email：xinghui415@163.com 通訊作者：?jiǎn)萄郋mail：13669336252@163.com

中圖分類號(hào)：R54

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3614（2016）04-0372-04

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.04.014

(收稿日期：2015-09-18)