張艷麗　張紅衛(wèi)　杜　鵑　侯安繼,3

(1 上海市第七人民醫(yī)院腫瘤科，上海，200137； 2 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院中心實驗室，上海，200137；3 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科，上海，200137)

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扶正消癌Ⅰ號方對小鼠腸癌肝轉(zhuǎn)移血管內(nèi)皮生長因子的表達的影響

張艷麗1張紅衛(wèi)1杜鵑2侯安繼1,3

(1 上海市第七人民醫(yī)院腫瘤科，上海，200137； 2 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院中心實驗室，上海，200137；3 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院腫瘤科，上海，200137)

摘要目的：觀察自擬扶正消癌Ⅰ號方對balbc小鼠移植瘤血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的作用，探討該方對多種腫瘤的作用機制。方法：采用balbc小鼠，脾下注射法建立鼠大腸癌細(xì)胞株肝轉(zhuǎn)移的動物模型，隨機分為4組，每組12只：1)陰性對照生理鹽水組；2)氟尿嘧啶組；3)扶正消癌I號方中藥組；4)扶正消癌I號中藥+氟尿嘧啶組。觀察生活質(zhì)量，抑瘤率，免疫組化方法檢測VEGF蛋白表達的情況。結(jié)果：扶正消癌I號方+氟尿嘧啶組、消癌I方組小鼠的生活質(zhì)量較其他2組好，陰性對照組瘤體最大，瘤體中藥組其次，聯(lián)合用藥組體積最小，氟尿嘧啶組、中藥組及聯(lián)合用藥組均能下調(diào)VEGF蛋白的表達。結(jié)論：扶正消癌Ⅰ號方對鼠大腸癌細(xì)胞株肝轉(zhuǎn)移小鼠抑制新生血管的作用機制可能是通過下調(diào)VEGF的表達，抑制腫瘤微血管生成，可能是該方抗腫瘤的機制之一。

關(guān)鍵詞中醫(yī)藥；血管生成；血管內(nèi)皮生長因子

隨著人類飲食生活水平的提高和生活水平的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年增加，給社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。大腸癌其5年生存率仍不高，主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，近些年來腫瘤新生血管生成是研究熱點，實體腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移都依賴于腫瘤血管的生成。以益氣扶正[1]為根本大法是大腸癌防治中最常用的治療手段之一，氟尿嘧啶以抗代謝物而起作用，干擾DNA、RNA合成而組織腫瘤細(xì)胞的合成。本研究利用鼠大腸癌細(xì)胞株肝轉(zhuǎn)移的Bablc小鼠模型，探討扶正消癌I號聯(lián)合氟尿嘧啶對荷瘤小鼠血管生長的抑制作用與機制。

1材料

1.1實驗動物清潔級Balb/c小鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量(20+2)g，由第二軍醫(yī)大學(xué)，長海醫(yī)院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0003，實驗動物使用許可證號SYXK(滬)2007-0003。分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境3 d后開始實驗。

1.2實驗藥物扶正消癌I號方(由上海市第七人民醫(yī)院中藥房提供，每毫升含生藥2.8 g，相當(dāng)于人用量的5倍)，密封，4 ℃保存，臨用前配置。氟尿嘧啶(5-Fu)(上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：FA140418，規(guī)格：10 mL∶0.25 g)。小鼠大腸癌細(xì)胞株CT26.WT細(xì)胞，ATCC公司提供。RPMI1640，Sigma提供，小牛血清，杭州四季青公司提供。EnVision試劑(HRP/Rabbit and mouse)(貨號：K500711 kit，丹麥Dako)

2實驗方法

2.1造模方法本研究參考國內(nèi)外文獻，用脾臟注射法建立小鼠大腸癌細(xì)胞株(CT26)肝轉(zhuǎn)移模型[2]。常規(guī)培養(yǎng)小鼠大腸癌細(xì)胞株CT26，接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、50 mL/L CO2恒溫箱中培養(yǎng)。于對數(shù)生長期細(xì)胞，用生理鹽水，制成5×107細(xì)胞/mL濃度的細(xì)胞懸液，取50 L接種于4～6周齡雌性Balb/c小鼠脾被膜下。在注射部位可見脾被膜發(fā)白、腫脹，拔出針頭，立即止血按壓，約3 min，觀察無出血后，把脾臟送回腹腔內(nèi)，關(guān)腹。嚴(yán)格無菌操作。術(shù)后繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)。

2.2分組與給藥方案

2.2.1分組當(dāng)小鼠肝臟部位出現(xiàn)約0.5 cm直徑大小瘤體時編號，采用數(shù)字表法隨機分為4組，即扶正消癌I號中藥方(簡稱消癌I方)+氟尿嘧啶組、消癌I方組、氟尿嘧啶及陰性對照生理鹽水組，每組12只均置于SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。

2.2.2給藥方案1)陰性對照生理鹽水組：生理鹽水，1.5 mL/只，1次/d，灌胃，連續(xù)給藥2周；2)氟尿嘧啶組(20 mg/kg)，1.5 mL/只，每隔2 d給藥1次，腹腔注射，連續(xù)給藥2周；3)扶正消癌I號方中藥組，中藥方(36 g/kg)，1.5 mL/d，1次/d，灌胃，連續(xù)給藥2周；4)扶正消癌I號中藥+氟尿嘧啶組：中藥方(36 g/kg)，1.5 mL/d，1次/d，灌胃；氟尿嘧啶(20 mg/kg)，每隔2 d給藥1次，腹腔注射，連續(xù)給藥2周。上述治療組均于隨機分組當(dāng)日起給藥；飼料、飲水自由。

2.3標(biāo)本提取第15天處死。嚴(yán)格無菌操作取瘤重W，清除部分壞死和纖維結(jié)締組織，取一小塊組織管，-80 ℃液氮冷凍保存，10%中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋的殘留組織，連續(xù)4 mm切片，免疫組化檢測。每組2例。免疫組化法檢測血管內(nèi)皮生長因子的表達。瀕死小鼠及時處死解剖，瘤組織切取和保存方法同前。

2.4檢測指標(biāo)

2.4.1觀察小鼠每天的飲食、水，體重，活動度，毛發(fā)光澤度及精神狀況。

2.4.2瘤重、抑瘤率建模治療后，觀察抗腫瘤效果，每隔3 d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大直徑和橫向尺寸的估計量，平均各組，繪制生長曲線：1/2(直徑×寬度)。第15天稱重，脫頸處死小鼠，并在無菌操作下取出腫瘤組織，并迅速稱重W。每組2例肝腫瘤。計算實體腫瘤生長抑制率(IR)：IR(%)=(1一治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

2.4.3免疫組化法檢測VEGF蛋白表達采用Envision免疫組化染色法。在普通顯微鏡下觀察并攝片。操作步驟參照說明書：每個腫瘤組織切片常規(guī)脫蠟，在高溫檸檬酸抗原修復(fù)后，加3%過氧化氫，用PBS洗滌，滴VEGF抗體1∶100(50 μL/組織塊)，4 ℃過夜，用PBS洗滌，二抗37 ℃孵育，DAB顯色，復(fù)染，脫水，封片。陽性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。參考劉曼曼等檢測方法[3]，先在低倍鏡下(100)，陽性染色最密集的區(qū)域，然后在400次從5個隨機選擇的視覺范圍，輸入的顯微圖像分析系統(tǒng)(leica QV3系統(tǒng))，染色強度的變化的陽性細(xì)胞作為定量指標(biāo)，計算平均灰度值的陽性表達水平，灰度值越小，陽性表達水平愈高，反之亦然。

3結(jié)果

3.1一般情況各組小鼠用藥期間活動性表現(xiàn)差異明顯。在整個過程中，氟尿嘧啶組有小鼠因一般情況較差，有2只未完成實驗。其中生理鹽水組小鼠瘤體增長最大，進食量明顯減少，小鼠精神狀態(tài)較差，活動度減少，隨時間延長，其明顯消瘦，消癌I方組小鼠雖然瘤體大，但是攝食、飲水量、精神狀態(tài)較其他組明顯好。消癌I方組、氟尿嘧啶組、聯(lián)合用藥組體重較生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而各用藥組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2瘤重、抑瘤率初期各組小鼠腫瘤體積均隨著時間推移呈現(xiàn)增長趨勢，陰性對照組>消癌I方組>氟尿嘧啶組>聯(lián)合用藥組(見表1)。用藥組中，聯(lián)合用藥組小鼠的瘤體生長速度較其他組慢，單純中藥組、中藥和氟尿嘧啶聯(lián)合用藥組其瘤體生長速度最快，但小鼠生活精神狀態(tài)較其他用藥組改善，隨著時間延長，氟尿嘧啶組和聯(lián)合用藥組均出現(xiàn)縮小趨勢，但均未出現(xiàn)腫瘤消失情況。抑瘤率分別為中藥組59.83%，氟尿嘧啶組73.68%，聯(lián)合用藥組84.48%(見表2)。各用藥組與對照組瘤體治療差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1　各組小鼠種植瘤的生長情況

表2　各組藥物對小鼠移植瘤的抑制作用

注：與陰性對照組比較：**P<0.01。

表3　各組對腸癌CT26細(xì)胞小鼠移植瘤VEGF的蛋白表達水平的影響±s)

注：與陰性對照組比較：**P<0.01，*P<0.05。

圖1　免疫組化檢測荷瘤組織中VEGF表達

注：A:生理鹽水陰性對照組，光學(xué)顯微鏡(×40)；B：消癌I方組，光學(xué)顯微鏡(×40)；C：氟尿嘧啶組，光學(xué)顯微鏡(×40)；D：中藥+氟尿嘧啶組，光學(xué)顯微鏡(×40)。

3.3對VEGF蛋白表達的影響陽性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒。本實驗的結(jié)果表明，與生理鹽水陰性組比較，聯(lián)合用藥組、消癌I方組、氟尿嘧啶組治療均可降低VEGF蛋白的表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與氟尿嘧啶組比較，雖然中藥組VEGF表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但有減少的趨勢。統(tǒng)計分析表明，消癌I方組單獨或聯(lián)合氟尿嘧啶，均可顯著抑制荷瘤瘤體VEGF的表達。(見表3，圖1)

4討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，在1971年，F(xiàn)olkman等[4]人首次發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長依賴于腫瘤組織的血管生成。如果沒有營養(yǎng)支持，腫瘤不能超過1～2 mm3。新生血管是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必備條件，血管內(nèi)皮細(xì)胞具有低突變性、穩(wěn)定遺傳性，抗血管生成、抑制血管內(nèi)皮生長因子直接針對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。許多惡性腫瘤細(xì)胞VEGF的自分泌作用，促進局部血管的形成。血管內(nèi)皮生長因子是最重要的促血管生成因子，直接促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進新生血管的形成[4-5]。結(jié)直腸癌患者血清中，VEGF、MVD與預(yù)后相關(guān)，可作為檢測大腸癌預(yù)后的參考指標(biāo)[6]。近年來，血管內(nèi)皮生長因子是抗血管生成治療的重要靶點，已成為一個熱門話題，從而引起科學(xué)家們的關(guān)注[7]。貝伐單抗(BEV)通過直接阻斷VEGF抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤血管的生長[9-10]。但目前大多數(shù)文獻通過臨床組織標(biāo)本和體外實驗細(xì)胞的檢測，探討與腫瘤血管生成的關(guān)系，中藥復(fù)方[11-14]以健脾補氣行氣、活血化瘀法見多。針對目前很多不能耐受化療的患者，中醫(yī)學(xué)在這方便發(fā)揮了極大的優(yōu)勢。我們從臨床觀察中腫瘤晚期患者服用補氣活血化瘀中藥后[15-17]能明顯提高其近期療效和改善生活質(zhì)量。扶正抗癌I號方是上海市第七人民醫(yī)院腫瘤科治療腸癌的長期經(jīng)驗總結(jié)，全方組成黃芪15 g，太子參15 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，山藥10 g，白花蛇舌草30 g，藤梨根15 g，山慈菇15 g，蜈蚣2條等組成，處方中以扶正益氣之黃芪、太子參、茯苓、白術(shù)等為君，攻伐抗癌之白花蛇舌草、山慈菇等為臣，佐以藤梨根、蜈蚣等，使以甘草，全方共奏扶正抗癌之效。前期臨床觀察中能明顯改善晚期腫瘤患者的生活質(zhì)量[18-19]，我們的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，消癌I方組、氟尿嘧啶組、聯(lián)合瘤體均有減小，各用藥組中，中藥組瘤體質(zhì)量最大，但生活質(zhì)量較氟尿嘧啶組一般情況好，說明扶正益氣為主的重要能對改善生活質(zhì)量起到一定作用。聯(lián)合用藥組、消癌I方組、氟尿嘧啶組治療均可降低VEGF蛋白的表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與氟尿嘧啶組比較，雖然單純消癌I方中藥組VEGF表達無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但有減少的趨勢。扶正消癌I號方、氟尿嘧啶及聯(lián)合用藥均可明顯抑制大腸癌細(xì)胞株CT26移植瘤的生長，因此，我們認(rèn)為，消癌I號聯(lián)合氟尿嘧啶在荷瘤鼠體內(nèi)均具有抗血管生成作用。消癌I號方抗血管生成可能是通過下調(diào)VEGF的表達間接抑制腫瘤血管形成，直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制腫瘤組織生長。

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(2015-07-12收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Effect of Fuzheng Xiaoai I Decoction on the Expression of VEGF in the Liver Metastasis of Colon Cancer Mice

Zhang Yanli1, Zhang Hongwei1, Du Juan2, Hou Anji1,3

(1OncologyDepartmentoftheSeventhPeople'sHospitalofShanghai,Shanghai200137,China; 2CenterLaboratoryofChanghaiHospitalaffiliatedtoSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200137,China;3OncologyDepartmentofCenterHospitalofXuhuiDistrict,Shanghai200137,China)

AbstractObjective:To investigate the effect of Fuzheng Xiaoai I decoction on VEGF expression of mice with liver metastasis of colon cancer, and discuss its possible mechanism.Methods:The tumor models were established by injecting human carcinoma of CT26 cells under the balbc mice. Balbc mice with liver cancer cells are randomized divided into 4 groups (12 in each group): 1)Control group; 2)5-Fu group; 3)Fuzheng Xiaoai I group; 4)Fuzheng xiaoai I+5-Fu group. The life quality of mice, tumor inhibiting rates, and the expression of VEGF in tumor tissue were measured.Results:The life quality of group 4 and 3 are better than that of the other groups. Besides, the tumor size of group 4 was the smallest, and that of the control group was the biggest. The levels of VEGF in all groups were decreased.Conclusion:Fuzheng Xiaoai I could inhibit the angiogenesis of tumor possibly by down regulating VEGF and obstructing the formation of tumor vessels.

Key WordsTraditional Chinese medicine; Angiogenesis; VEGF

基金項目：上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金項目(編號：2012QJ006B)，上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點學(xué)科群建設(shè)項目(編號：PWZxq2014-12)，上海市第七人民醫(yī)院“七院新星”培養(yǎng)計劃(編號：qyxx-2012-26)

作者簡介：張艷麗(1983.04—)，女，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腫瘤防治，Tel：(021)58670561-6340，E-mail：yanly_zhang@163.com 通信作者：侯安繼(1964.12—)，男，博士研究生，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合消化道腫瘤臨床和實驗研究，Tel：(021)58670561-6337，E-mail：anjihou@163.com

中圖分類號：R289.5

文獻標(biāo)識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.035