郝榮華，張曉元，劉飛,,3Δ，陳勉，王鳳山，朱希強,,3，凌沛學(xué),,3

(1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101；2.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250012；3.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司，山東 濟南 250101)

重組人纖維蛋白原基因在畢赤酵母中的高效表達

郝榮華1，張曉元1，劉飛1,2,3Δ，陳勉1，王鳳山2，朱希強1,2,3，凌沛學(xué)1,2,3

(1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101；2.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250012；3.山東福瑞達醫(yī)藥集團公司，山東 濟南 250101)

目的 構(gòu)建含有人纖維蛋白原基因的畢赤酵母表達系統(tǒng)，實現(xiàn)胞外高效分泌表達。方法 全基因合成人纖維蛋白原3個基因FGA、FGB、FGG，構(gòu)建表達載體 pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1，線性化后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母菌株SMD1168H，抗性篩選獲得陽性克隆。發(fā)酵液經(jīng)SDS-PAGE確定蛋白表達部位，ELISA檢測目的蛋白表達量。表達產(chǎn)物超濾濃縮后利用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行分離純化，Western blot檢測蛋白表達情況并對純化產(chǎn)物進行生物學(xué)活性測定。結(jié)果 基因工程菌株搖瓶培養(yǎng)上清液表達量約15 mg/L，生物學(xué)活性分析重組蛋白具有凝集活性。結(jié)論 成功獲得了高效分泌表達重組人纖維蛋白原的畢赤酵母菌株，且分離純化的蛋白具有生物凝集活性。

重組人纖維蛋白原；畢赤酵母；分泌表達；分離純化

目前世界衛(wèi)生組織確認的凝血因子共13個，大多由肝臟產(chǎn)生，正常情況下，所有凝血因子都處于無活性狀態(tài)，以無活性酶原形式存在，當(dāng)某一凝血因子被激活后，可使許多凝血因子按一定的次序先后被激活，逐級放大，直到纖維蛋白形成，血液發(fā)生凝固。纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)，即凝血因子Ι，是參與血液凝固的重要凝血因子，血漿中含量高達2 000～4 000 mg/L[1]，其分子量340 kDa，由完全相同的2個亞基組成共價二聚體，每個亞基含有 α(63.5 kDa)、 β(56 kDa)、 γ(47 kDa)3條肽鏈[2]，分別由4號染號體(4q28-30)上的3個獨立的基因FGA、FGB、FGG編碼形成，在肝臟中由獨立的核糖體合成其前體蛋白，再經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體完成蛋白的組裝，各肽鏈彼此通過二硫鍵相互連接形成Fg單體。2個單體通過3對鏈間二硫鍵連接形成對稱性二聚體，即Fg。

纖維蛋白原參與凝血過程的機理：當(dāng)血液中的凝血酶原被激活時，凝血酶作用于纖維蛋白原，切斷纖維蛋白原α鏈N末端區(qū)域和β鏈N末端區(qū)域，α鏈的解離有利于纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)呈線性增長，β鏈的解離有利于纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)呈側(cè)向增長，最終纖維蛋白單體以錯綜重疊狀態(tài)側(cè)向聚合締結(jié)為網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的血凝塊[3]。凝血初期非共價鍵結(jié)合可溶性的血凝塊，然后在體內(nèi)凝血因子ⅩⅢ(谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，又稱纖維蛋白穩(wěn)定因子)和Ca2+作用下，纖維蛋白單體通過 ε-氨基-γ-谷氨?；B接，形成不溶性的穩(wěn)定血凝塊[4]，從而發(fā)揮凝血和生理性止血功能。另外，纖維蛋白原還參與體內(nèi)血小板聚集、纖溶調(diào)節(jié)、動脈硬化的發(fā)生發(fā)展、組織損傷及修復(fù)等一系列病理和生理過程[5-8]。

醫(yī)藥級纖維蛋白原提取于人體血液，生產(chǎn)成本高昂且難以避免血源性傳染病(如乙肝和艾滋病等)的傳播風(fēng)險，影響其市場應(yīng)用及推廣。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，采用基因工程方法高效表達安全、可靠的人纖維蛋白原成為研究熱點。2011年，黃星等[9]將人纖維蛋白原基因在大腸桿菌BL21菌株中進行誘導(dǎo)表達，發(fā)現(xiàn)人纖維蛋白原3個亞基不能共表達，即纖維蛋白原的β、γ鏈能用pET系列載體獲得表達，而α鏈卻未能獲得表達。大腸桿菌等原核生物表達系統(tǒng)還存在目的蛋白無法正確折疊修飾等空間結(jié)構(gòu)問題，影響纖維蛋白原生物活性。動物細胞表達系統(tǒng)中，雖然可以通過哺乳動物乳腺生物反應(yīng)器獲得特異性表達具活性的纖維蛋白原，但存在投入成本高、基因打靶的位置效應(yīng)導(dǎo)致基因整合具隨機性、重組蛋白與天然蛋白修飾加工仍存在差異等問題，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)[10-11]。酵母表達系統(tǒng)可以克服大腸桿菌和動物細胞表達系統(tǒng)的不足，通過高密度發(fā)酵實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，蛋白質(zhì)翻譯后的修飾加工功能更加完善，蛋白產(chǎn)物更接近天然蛋白質(zhì)功能。本研究擬通過構(gòu)建重組人纖維蛋白原酵母表達載體獲得高效分泌表達的畢赤酵母菌株，分離純化具生物活性蛋白，為進一步開發(fā)有效的藥用纖維蛋白原奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株：質(zhì)粒pGAPZαA(Invitrogen)，含有GAP啟動子和Zeocin抗性基因，作為表達載體；質(zhì)粒pPIC9K，僅用于AOX1基因的PCR擴增，并將該基因連接入pGAPZαA表達載體，利用AOX1作為線性化位點進行同源重組，以上質(zhì)粒均為本實驗室保藏。菌株以畢赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168H作為表達宿主，為本實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基：低鹽LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉5，pH 7.5；YPD培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂粉。

1.1.3 試劑：限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自NEB公司、Taq酶、DNA Marker、蛋白分子量Marker等購自Fermentas公司，抗生素Zeocin購自Invitrogen公司，質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司，超濾管購自Millipore公司，層析柱填料Sephacryl TM S-100 HR購自GE 公司，ELISA 試劑盒購自Bio-Swamp公司，鼠抗人單克隆抗體(α、β、γ)、辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠 IgG 均購自Santa Cruz公司，DAB顯色試劑盒購自Tiangen公司。其他試劑均為市售分析純。

1.1.4 儀器：搖床(伊孚森生物技術(shù)中國有限公司)、 PCR儀(Eppendorf)、離心機(Thermo)、電轉(zhuǎn)化儀(Biorad)、酶標(biāo)儀(Tecan)、蛋白電泳設(shè)備(Biorad)、AKTA蛋白分離純化儀(AKTA Explorer)、生物樣品均質(zhì)器(Bertin )。

1.1.5 引物序列:

FGA-F:GACTGCTGATAGTGGAGAGGGTGAC

FGA-R:GTGAAGGTTTACCCAAAGGGGATG

FGB-F:GTCCTTCCATAAATTGAAGACTATG

FGB-R:ATCTTTCTCATACTGTACCATGATC

FGG-F: TATCCTTTATTTTTACGCATTGTTG

FGG-R:ATGCTGTTGACCTTCTCCGATAGTC

1.2 方法

1.2.1 pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1重組質(zhì)粒的構(gòu)建:NCBI數(shù)據(jù)庫檢索人纖維蛋白原FGA、FGB、FGG基因序列(Gene ID分別為2 243、2 244、2 266)，根據(jù)宿主菌株畢赤酵母密碼子偏好性進行序列優(yōu)化，并設(shè)計合適的酶切位點，對含GAP啟動子和AOX1TT終止子表達框的全基因序列合成，重組質(zhì)粒載體如圖1所示，具體步驟如下：

圖1 重組人纖維蛋白原酵母表達載體的構(gòu)建圖Fig.1 Frame of the Pichia pastoris expression vector containing recombinant human fibrinogen gene

① 限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BamHⅠ分別雙酶切FGB基因和 pGAPZαA 質(zhì)粒，經(jīng)純化連接轉(zhuǎn)化E.coliTop10 感受態(tài)細胞，于25 μg/mLZeocin低鹽 LB 固體培養(yǎng)基篩選陽性轉(zhuǎn)化子，獲得pGAPZαA-FGB重組質(zhì)粒。

② 限制性內(nèi)切酶BglⅡ分別單酶切FGG基因和 pGAPZαA-FGB質(zhì)粒，載體脫磷酸化并純化，連接轉(zhuǎn)化E.coliTop10 感受態(tài)細胞，抗性篩選獲得pGAPZαA-FGB-FGG重組質(zhì)粒。

③ 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ分別單酶切FGA基因和 pGAPZαA-FGB-FGG質(zhì)粒，載體脫磷酸化并純化，連接轉(zhuǎn)化E.coliTop10 感受態(tài)細胞，抗性篩選獲得pGAPZαA-FGB-FGG-FGA重組質(zhì)粒。

④以pPIC9K質(zhì)粒為模板PCR擴增AOX1基因，PstⅠ單酶切AOX1基因和pGAPZαA-FGB-FGG-FGA重組質(zhì)粒，載體脫磷酸化并純化，連接轉(zhuǎn)化E.coliTop10 感受態(tài)細胞，抗性篩選獲得pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1重組質(zhì)粒。

每一步重組質(zhì)粒構(gòu)建均經(jīng)生物公司測序正確后，再進行下一個目的片段的連接。

1.2.2 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及PCR擴增驗證：PmeⅠ單酶切線性化重組質(zhì)粒pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1，膠回收純化，按《畢赤酵母表達操作手冊》[12]方法電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母SMD1168H感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)化條件：1.5 kV，200 Ω， 25 μF。電轉(zhuǎn)化后酵母細胞涂布于含1 μg/mLZeocin抗性平板，28 ℃培養(yǎng)2 d，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，以破壁重組子為模板，PCR擴增檢測重組載體的FGA、FGB、FGG基因驗證。

1.2.3 重組人纖維蛋白原的表達：挑取單克隆于YPD培養(yǎng)基(含1 μg/mLZeocin)，28 ℃，220 r/min培養(yǎng)60 h。采用生物樣品均質(zhì)器對發(fā)酵液及菌體破碎，均質(zhì)速度6 500 r/min，3個循環(huán)，每個循環(huán)運行時間為30 s，循環(huán)間隔30 s。參考《精編分子生物學(xué)實驗指南》[13]對全細胞破碎液、菌體沉淀破碎液及發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE 電泳檢測，確定目的蛋白的表達部位，ELISA試劑盒檢測確定目的蛋白的表達量。

1.2.4 重組人纖維蛋白原的 Western blot檢測：發(fā)酵上清液經(jīng)30 kDa超濾管濃縮，AKTA純化系統(tǒng)分離，收集蛋白吸收峰值處洗脫液進行二次超濾濃縮獲得純化蛋白。純化條件：分子篩層析柱Column XK16，凝膠填料為SephacrylTMS-100 HR，流速0.5 mL/min，上樣量 5mL。

純化蛋白分別以小鼠單克隆一抗(α、β、γ)(稀釋比例1 :1000)，羊抗鼠 IgG-HRP作為二抗(稀釋比例 1:10 000)進行Western blot，抗體孵育結(jié)束后洗膜3次，DAB 顯色試劑盒顯色，具體操作方法參考《精編分子生物學(xué)實驗指南》[13]。

1.2.5 重組人纖維蛋白原的生物活性測定:AKTA純化蛋白洗脫液4 ℃透析過夜(20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM εACA,1mM CaCl2)，添加外源0.1 U/mL凝血酶、0.02 U/mL凝血因子ⅩⅢ，37 ℃條件下參照2015年版中國藥典方法[14]檢測纖維蛋白原凝集活性。

2 結(jié)果

2.1 畢赤酵母基因工程菌株的PCR擴增檢測 以電轉(zhuǎn)化篩選到陽性轉(zhuǎn)化子破壁后的菌液為模板，PCR擴增FGA、FGB和FGG基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2，目的片段大小與理論值(1.9 kb、1.5 kb、1.3 kb)相一致，說明重組質(zhì)粒成功在畢赤酵母基因組中同源重組。

圖2 陽性酵母轉(zhuǎn)化子的PCR驗證1：1Kb DNA Marker；2：FGG基因；3：FGB基因；4：FGA基因Fig.2 PCR amplification of human fibrinogen DNA fragments in Pichia pastorisLane 1: 1Kb DNA Marker ;Lane 2:FGG gene ;Lane 3: FGB gene; Lane 4:FGA gene

2.2 重組人纖維蛋白原的表達 SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況見圖3，與含pGAPZαA空載體畢赤酵母對照相比，在相對分子質(zhì)量40～70 kDa之間，上清液(泳道2)及全細胞破碎液(泳道3)均有3條特異性條帶，而菌體沉淀和對照沒有條帶，這表明目的蛋白表達部位主要在胞外上清液中，屬于分泌型表達。ELISA試劑盒檢測結(jié)果顯示畢赤酵母上清液中目的蛋白表達量約為15 mg/L。

圖3 畢赤酵母表達人纖維蛋白原的SDS-PAGE檢測1：蛋白Marker；2：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母的上清液；3：重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化畢赤酵母的全細胞破碎液；4：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母的菌體沉淀 破碎重懸液；5：pGAPZαA空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母的表達Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant human fibrinogen in Pichia pastorisLane 1: Protein molecular weight Marker; Lane 2: Expression of recombinant proteinin culture supernatant; Lane 3: Expression of recombinant protein in whole- cell; Lane 4: Expression of recombinant protein in precipitate;Lane 5: Proteins expressed by pGAPZαA in Pichia pastoris as a control

為進一步確定蛋白的表達情況，利用小鼠單克隆一抗(α、β、γ)和羊抗鼠IgG-HRP二抗進行Western blot檢測，結(jié)果見圖4，與pGAPZαA空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母的對照相比，樣品的FGA、FGB、FGG蛋白(泳道2)均有明顯的特異性條帶，蛋白分子量大小與理論值α(63.5 kDa)、 β (56 kDa)、 γ(47 kDa)相一致，表明雜交條帶確為目的蛋白，重組人纖維蛋白原FGA、FGB、FGG蛋白在畢赤酵母中均有較強的表達。

圖4 人纖維蛋白原 Western blot印跡分析 A.重組人纖維蛋白原FGA蛋白；B.重組人纖維蛋白原 FGB蛋白；C.重組人纖維蛋白原FGG蛋白1：蛋白Marker；2：重組人纖維蛋白原蛋白表達樣品；3：空載體對照Fig.4 Western blot of human fibrinogen A.FGA protein; B.FGB protein; C.FGG proteinLane 1: Protein molecular weight Marker;Lane 2: Proteins expressed by pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1 in Pichia pastoris;Lane 3: Proteins expressed by pGAPZαA in Pichia pastoris as a control

2.3 重組人纖維蛋白原的生物活性檢測 分離純化后的重組人纖維蛋白原在添加外源Ca2+、凝血酶和凝血因子ⅩⅢ條件下，按照2015年版中國藥典方法檢測凝固活力[14]，結(jié)果顯示待測樣品與對照相比變渾濁并有沉淀產(chǎn)生，這表明純化獲得的人纖維蛋白原具有生物凝集活性。

3 討論

人纖維蛋白原在凝血系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在凝血酶的作用下，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，并與其他血細胞成分聚集從而達到止血目的。纖維蛋白原缺乏常見疾病有：先天性纖維蛋白原減少或缺乏癥，彌散性血管內(nèi)凝血、外傷、手術(shù)等導(dǎo)致的獲得性纖維蛋白原缺少癥，這些纖維蛋白原功能異常均可引發(fā)不可控制的出血癥狀[15]。目前纖維蛋白原缺乏癥只能靠補充人纖維蛋白原制劑治療，因此臨床應(yīng)用需求較大，同時人纖維蛋白原還是一種軍事戰(zhàn)略儲備藥品，每年必須有一定的儲備量。目前我國僅有9家血液制品單位生產(chǎn)人纖維蛋白原注射劑，2008～2010年全國總產(chǎn)量不足10萬瓶(0.5 g/瓶)，臨床長期供不應(yīng)求，且原料來源于人體，提取資源短缺、工藝復(fù)雜，因此利用基因工程手段開發(fā)重組人纖維蛋白原具有良好的市場前景，有助于為科研和臨床治療提供新思路，為其大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供重要的實驗依據(jù)和技術(shù)支持。

本課題將人纖維蛋白原的3個基因串聯(lián)插入到真核表達載體 pGAPZαA中，成功獲得了重組人纖維蛋白原的畢赤酵母菌株，SDS-PAGE和Western blot檢測證實目的蛋白在發(fā)酵上清液中得到高效分泌表達，且分離純化的蛋白具有生物凝集活性。目前僅有2008年Tojo等[16]報道利用酵母作為宿主細胞表達人纖維蛋白原的研究，表達量僅為8 mg/L，且需甲醇誘導(dǎo)表達，而本研究獲得的人纖維蛋白原發(fā)酵產(chǎn)量約為15 mg/L，較其產(chǎn)量提高了87.5%，畢赤酵母表達為組成型表達，不需要誘導(dǎo)，更適合工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)。本課題后續(xù)將進行發(fā)酵罐擴培和發(fā)酵條件優(yōu)化，以提高蛋白表達量，并將從氧化還原角度和蛋白翻譯后修飾角度探索二硫鍵形成和穩(wěn)定條件，對纖維蛋白原在凝血酶作用下的凝集條件進行大量的研究和探索。

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(編校：吳茜)

High level expression of recombinant human fibrinogen inPichiapastoris

HAO Rong-hua1, ZHANG Xiao-yuan1, LIU Fei1,2,3Δ, CHEN Mian1, WANG Feng-shan2,ZHU Xi-qiang1,2,3, LING Pei-xue1,2,3

(1.Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Key Laboratory of Biopharmaceuticals, Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs,National-Local Joint Engineering Laboratory of Polysaccharide Drugs, Ji’nan 250101, China; 2.School of Pharmaceutical Sciences,Shandong University, Ji’nan 250012, China; 3.Shandong Freda Pharmaceutical Group Company, Ji’nan 250101, China)

ObjectiveTo construct a eukaryotic expression vector inPichiapastoriscontaining human fibrinogen gene, in order to achieve high level secretory expression in extracellular.MethodsExpression plasmid，pGAPZαA-FGB-FGG-FGA-AOX1，was constructed by inserting the synthesized sequence encoding human fibrinogen(FGA,FGB,FGG) and then introduced intoPichiapastorisSMD1168H by electroporation.Transformants were availably screened byZeocinresistance,the expression of recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blot analysis, the protein yield was tested by ELISA assay.After ultrafiltration and purification, the biological activity of protein was detected.ResultsThe crude yield of human fibrinogen inPichiapastorissupernatant reached 15 mg/L in flask and the biological aggregation activity was determined.ConclusionThe human fibrinogen gene was obtained and successfully expressed inPichiapastorisand the active products were secreted into the medium.

recombinant human fibrinogen;Pichiapastoris; secretory expression; purification

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.001

山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項(2014CGZH1306)；濟南市自主創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)化重大專項(201403009)；山東省重點研發(fā)計劃(2015GSF121003)；山東省科技重大專項(重大關(guān)鍵技術(shù))(2015ZDJS04002)；山東省自然科學(xué)基金企業(yè)先導(dǎo)技術(shù)聯(lián)合基金(ZR2015QL007)

郝榮華，女，博士，助理研究員，研究方向：基因工程藥物，E-mail：ronghua34@163.com；劉飛，通信作者，男，碩士，助理研究員，研究方向：生物技術(shù)，E-mail：lfshwu@163.com。

Q786

A