謝靜靜，姚曉磊，宋瑞高，呂小康，張瑞鑫，王莉宏，石　磊

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

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綿羊精原干細(xì)胞的分離純化與鑒定

謝靜靜，姚曉磊，宋瑞高，呂小康，張瑞鑫，王莉宏，石磊

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：旨在探究一種簡便高效的綿羊精原干細(xì)胞(SSCs)分離純化方法，為后續(xù)研究SSCs奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用兩步酶消化法對4月齡的綿羊睪丸進(jìn)行消化處理，獲得單細(xì)胞懸液。將睪丸細(xì)胞接種于0.2%的明膠預(yù)處理培養(yǎng)皿中，根據(jù)各細(xì)胞貼壁能力和速度的不同將SSCs純化，并在純化后用SSCs特異標(biāo)記分子PLZF進(jìn)行免疫熒光鑒定。結(jié)果表明，經(jīng)免疫熒光染色得出存在PLZF陽性信號。這說明采用兩步酶消化和差異貼壁法可以得到純度較高的SSCs。

關(guān)鍵詞：綿羊；精原干細(xì)胞；分離；純化

精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是指位于曲細(xì)精管基膜上，不僅能維持自身數(shù)量恒定，又能定向分化產(chǎn)生精母細(xì)胞的成體干細(xì)胞，是雄性成體內(nèi)唯一能進(jìn)行有絲分裂將遺傳物質(zhì)傳遞到下一代的永生細(xì)胞[1]。一般將SSCs分為A、B兩型，A型又分為單個(gè)A型(A-single，As)、成對A型(A-paired，Apr)和鏈狀A(yù)型(A-aligned，Aal)。一般認(rèn)為As細(xì)胞是精子發(fā)生過程中的干細(xì)胞，可以自我更新成新的干細(xì)胞，也可以由細(xì)胞間橋連接定向分化形成Apr細(xì)胞，進(jìn)一步分裂形成4鏈、8鏈、16鏈細(xì)胞組成的Aal細(xì)胞，繼續(xù)分裂形成A1、A2、A3、A4、In和B型細(xì)胞，B型細(xì)胞經(jīng)數(shù)次分裂形成精子[2]。SSCs在體外也可誘導(dǎo)分化為精子，是恢復(fù)生育能力和保種的一種先進(jìn)手段[3]。鑒于其在細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域廣闊應(yīng)用前景，對SSCs生理生化特性、體外培養(yǎng)等實(shí)際應(yīng)用研究，急需建立一種能夠有效分離純化SSCs的方法，得到較高純度有活力的SSCs。目前，小鼠中己建立了較成熟的SSCs技術(shù)體系，而大動物的SSCs研究還處在探索階段?？兹悍糩4]等采用三步酶消化和差異貼壁法對山羊睪丸組織進(jìn)行了分離純化。張衛(wèi)藝[5]等采用兩步酶消化法并創(chuàng)新地將DMEM-高糖和DMEM-F12結(jié)合使用，有效地對犢牛睪丸組織進(jìn)行了分離純化。陳庭鋒[6]等采用兩步酶消化法成功分離了豬的SSCs。

綿羊具有繁殖率高、產(chǎn)毛量大、性情溫順、易管理等特點(diǎn)，然而目前關(guān)于綿羊SSCs的研究還處于初步分離和短期培養(yǎng)階段，分離純化體系尚未成熟。如果取得足夠且較高純度的SSCs將對于綿羊SSCs生理生化特性的研究是一個(gè)很大的突破，然而，目前國內(nèi)外關(guān)于綿羊SSCs分離純化的研究報(bào)道很少。本研究借鑒較為成熟的小鼠和山羊精原干細(xì)胞的分離純化鑒定，采用兩步酶消化法對綿羊睪丸進(jìn)行處理，制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于0.2%的明膠涂層培養(yǎng)皿中，經(jīng)差異貼壁法進(jìn)行純化，用SSCs特異標(biāo)記分子PLZF對分離純化的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，以探討一種綿羊SSCs分離純化的方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動物取自晉中市太谷縣屠宰場的綿羊睪丸。

1.1.2主要試劑胰蛋白酶，膠原酶Ⅰ，DMEM/F12，胎牛血清(FBS)，PBS緩沖液，4%多聚甲醇溶液，Mouse Anti-PLZF多克隆一抗，HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse二抗，濃縮型SABC-Cy3免疫熒光試劑盒均購于武漢博士德生物公司。

1.2方法

1.2.1綿羊睪丸組織的處理將綿羊睪丸用DPBS溶液反復(fù)洗滌數(shù)次，再用酒精棉球消毒。除去脂肪墊、附睪以及白膜等，剪切后去除睪丸網(wǎng)和血管，充分暴露出線團(tuán)狀生精小管，將生精小管組織用剪刀剪碎。

1.2.2綿羊睪丸組織單細(xì)胞懸液的制備取部分組織加入15 mL離心管，加入10倍組織體積的1%膠原酶Ⅰ，37℃消化45 min后離心，棄上清，再用DPBS清洗3次。加入0.25%胰蛋白酶消化，在37℃條件下作用5 min。吹打多次后，用含10% FBS的DMEM/F12終止消化，200目細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液。濾液于1 200 r/min離心5 min，棄上清，進(jìn)行活率測定。

1.2.3綿羊精原干細(xì)胞純化綿羊睪丸SSCs的純化選用差異貼壁純化法，將得到的細(xì)胞懸液接種在0.2%的明膠培養(yǎng)皿中，在32.5℃、5.5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，取未貼附的細(xì)胞做細(xì)胞涂片，用于SSCs檢測。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光染色對未貼附的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。用DPBS洗3次，4%的多聚甲醇固定15 min，DPBS洗3次，用綿羊血清白蛋白封閉30 min，加入稀釋的Mouse Anti-PLZF多克隆一抗(1∶100稀釋)，孵育過夜，DPBS洗3次，再加入稀釋的HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse二抗(1∶100稀釋)，孵育2 h，用DPBS洗滌4次終止反應(yīng)，加入SABC-Cy3(1∶100稀釋)，封片、觀察。同時(shí)設(shè)置對照組。

2結(jié)果與分析

2.1綿羊精原干細(xì)胞的分離和純化

經(jīng)組合酶的消化處理獲得了綿羊睪丸組織單細(xì)胞懸液(圖1A)，該細(xì)胞懸液中包含SSCs、其他生精細(xì)胞或體細(xì)胞以及紅細(xì)胞。經(jīng)明膠涂層的培養(yǎng)皿貼壁分離后，獲得了純度較高的SSCs(圖1B)，該法可有效得到一定數(shù)量和純度的SSCs。

A.單細(xì)胞懸浮液(400×)；B.純化后細(xì)胞(400×)。箭頭代表SSCs，三角形代表其它生精細(xì)胞或體細(xì)胞，菱形代表紅細(xì)胞。圖1　分離純化的綿羊精原干細(xì)胞(標(biāo)尺=20 μm)

2.2綿羊精原干細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記染色鑒定

對分離純化后的SSCs進(jìn)行免疫熒光染色，由圖2可看出存在PLZF陽性信號。因此，揭示采用此分離方法可得到一定濃度的綿羊SSCs。

A.PLZF鑒定結(jié)果(400×)；B.精原干細(xì)胞光鏡下形態(tài)(400×)。箭頭代表SSCs，三角形代表其它生精細(xì)胞或體細(xì)胞，菱形代表紅細(xì)胞。圖2　綿羊SSCs的免疫熒光標(biāo)記染色鑒定(標(biāo)尺=20 μm)

3討論

精子發(fā)生是SSCs嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞增殖和分化，產(chǎn)生大量精子的復(fù)雜過程，SSCs作為精子形成源頭，一方面其可通過不斷地增殖以維持其數(shù)量，另一方面可通過數(shù)次分裂和分化產(chǎn)生精子[7]。鑒于SSCs所具有的重要作用，探究一套穩(wěn)定的分離、純化以及原代培養(yǎng)的方法對于開展精原細(xì)胞相關(guān)功能的研究具有重要意義。SSCs的細(xì)胞學(xué)特性、分離純化方法、基因修飾以及探索SSCs的體外長期培養(yǎng)系統(tǒng)等都必需有足夠數(shù)量和較高純度的SSCs。

隨著出生后時(shí)間的增長，SSCs逐步分化形成各級生精細(xì)胞，其數(shù)量及所占比例都會越來越少，這樣使得SSCs的分離純化極為困難[8]，故動物的年齡是分離純化效果的關(guān)鍵。日齡較小的動物其生精上皮內(nèi)基本只有A型精原細(xì)胞和支持細(xì)胞，其他各級生精細(xì)胞尚未發(fā)育形成，理論上可獲得大量的SSCs?？兹悍嫉萚4]選用4月齡的山羊睪丸進(jìn)行分離純化SSCs。畢聰明等[9]選用5月齡的牛睪丸進(jìn)行分離純化SSCs。王永彬等[10]選用出生后7～8日齡的小鼠睪丸進(jìn)行分離純化，都得到了較高濃度的SSCs。本研究通過采集4月齡的綿羊睪丸，經(jīng)酶消化和差異貼壁對其進(jìn)行純化，也得到了一定濃度的SSCs。

畢聰明等[9]在牛的SSCs分離試驗(yàn)中首先采用兩步酶消化法，結(jié)果顯示每克睪丸組織可獲得3.18×106個(gè)細(xì)胞。張衛(wèi)藝等[5]在犢牛SSCs分離試驗(yàn)中也采用兩步酶消化法，都取得了較好的分離效果。本試驗(yàn)先采用膠原酶對組織小塊進(jìn)行消化，離心去除大部分游離的間質(zhì)細(xì)胞和管周肌樣細(xì)胞，再用胰蛋白酶將曲細(xì)精管的基底膜消化解離，最后制得睪丸細(xì)胞懸液。

一般情況下，對SSCs的純化方法可選用的有差異貼壁法、免疫磁珠分離技術(shù)、不連續(xù)Percoll密度梯度離心法、流式細(xì)胞分選術(shù)和形態(tài)篩選法中的一種或多種[11～17]。本研究根據(jù)睪丸不同細(xì)胞之間在形態(tài)學(xué)、貼壁能力等方面存在的差異，采用差異貼壁法對其進(jìn)行純化。根據(jù)SSCs直徑的大小，初步得到一定濃度的SSCs?？兹悍嫉萚4]在明膠涂層培養(yǎng)皿中，運(yùn)用體細(xì)胞貼壁速度遠(yuǎn)大于SSCs，培養(yǎng)后的體細(xì)胞大多數(shù)已經(jīng)貼壁，而精原細(xì)胞貼壁不牢，吹打即脫落的原理，對山羊SSCs進(jìn)行純化，結(jié)果顯示高于前人通過Percoll密度梯度離心法富集水牛SSCs(71.86%±2.34%)[18]和綿羊SSCs(65.3%±3.2%)[19]的純化效率。

PLZF是SSCs特異性抗原的分子標(biāo)記，PLZF僅在早期未分化的精原細(xì)胞中表達(dá)，M.Bahadorani等[20]對綿羊睪丸組織的PLZF抗體免疫組化顯示PLZF在未分化的精原細(xì)胞中均有表達(dá)。本研究對分離純化的細(xì)胞進(jìn)一步采用免疫熒光染色對其進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示存在PLZF陽性信號，說明采用兩步酶和差異貼壁法可得到一定純度的SSCs?？兹悍嫉萚4]同樣也采用與本研究類似的方法，也得到較高濃度的山羊SSCs。但是值得注意的是，前人在山羊[4]上采用此方法得到的純度較本研究高，這可能是由于物種之間的差異所造成的。因此，要得到更高純度的綿羊SSCs，還需要進(jìn)一步研究。

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Enrichment and Identification of Spermatogonial Stem Cells from Sheep Testis

XIE Jing-jing，YAO Xiao-lei，SONG Rui-gao，LV Xiao-kang，ZHANG Rui-xin，WANG Li-hong，SHI-Lei*

(Shanxi agricultural university，college of animal science and veterinary medicine，Taigu 030801，China)

Abstract：The study was aimed to explore a method that can efficiently isolate and purify spermatogonial stem cells(SSCs)from sheep testis，and lay the foundation of the follow-up study of SSCs.Single cell suspension was prepared from testis of 4-month old sheep by two-step enzymatic digestion.The SSCs were purified from the suspended cells via differential attachment in 0.2% gelatin coated dishes，according to the differential adherence capability in different kinds of cells.Immunofluorescence staining by using SSCs molecular marker PLZF was performed after cells were purified.The result shows that the positive signal of PLZF was obtained in the cells after purification.It is indicated that adopting two-step enzymatic digestion and differential attachment can get high purity of SSCs.

Key words：sheep；spermatogonial stem cells；isolation；purification

收稿日期：2016-04-27

作者簡介：謝靜靜(1994-)，女，陜西寶雞人，本科。E-mail：1440674628@qq.com 通信作者：石磊(1980-)，男，博士，副教授。主要從事動物生殖生理和繁殖營養(yǎng)調(diào)控等方面的研究。E-mail：sxausl@gmail.com

中圖分類號：S826.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-2739(2016)04-0012-04

資助項(xiàng)目：由“山西農(nóng)業(yè)大學(xué)第十三批大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(13-005)”資助。