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(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100094；2.北京市畜牧總站，北京 100101)

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基于表達(dá)譜芯片技術(shù)分析老齡化對小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

常卓1，2，傅祥偉1，朱士恩1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100094；2.北京市畜牧總站，北京 100101)

摘要：探討了生殖老化對小鼠卵母細(xì)胞后期發(fā)育及基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，與青年小鼠相比，老齡小鼠MII期卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后早期胚胎原核形成的時(shí)間發(fā)生延遲(1 h)，囊胚發(fā)育率有顯著差異(61.98% vs.70.95%，P<0.05)。提取老齡和青年CD1小鼠MII期卵母細(xì)胞總RNA，使用基因表達(dá)譜芯片對其進(jìn)行分析。結(jié)果表明，生殖老化導(dǎo)致1 737個(gè)基因表達(dá)表現(xiàn)出顯著差異，其中64.9%的基因表達(dá)上調(diào)，35.1%的基因表達(dá)下調(diào)，生殖老化導(dǎo)致Hdac10等基因產(chǎn)生極顯著的表達(dá)差異，小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，最終影響其后期發(fā)育能力。

關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞；生殖老化；減數(shù)分裂；基因表達(dá)；小鼠

生物體在機(jī)體其它器官老化前生殖機(jī)能就已開始退化，即發(fā)生生殖老化現(xiàn)象。與雄性哺乳動(dòng)物不同的是，雌性哺乳動(dòng)物在渡過其壽命的1/3時(shí)已發(fā)生生殖老化，生殖機(jī)能表現(xiàn)出顯著下降，表現(xiàn)在卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量上，如卵巢早衰、減數(shù)分裂中染色體分離異常以及線粒體功能障礙等[1]。而人們對于生殖老化影響卵母細(xì)胞后期發(fā)育的情況知之甚少。

Hamatani和Pan等人曾通過表達(dá)譜芯片技術(shù)分析青老年小鼠卵母細(xì)胞全基因組表達(dá)，但在雜交前使用RNA線性擴(kuò)增的方法得到cRNA[2，3]。而本實(shí)驗(yàn)不進(jìn)行RNA線性擴(kuò)增，免去繁瑣的擴(kuò)增過程和擴(kuò)增中可能會導(dǎo)致的核酸污染，更重要的是避免擴(kuò)增不均一而放大或減小基因表達(dá)差異，最終得出不準(zhǔn)確的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)主要研究生殖老化對小鼠卵母細(xì)胞后期發(fā)育潛力是否造成影響，并進(jìn)一步以老齡和青年CD1小鼠MII期卵母細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，探索生殖老化影響卵母細(xì)胞后期發(fā)育的分子機(jī)理。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取同時(shí)購入的青年(6～8周)和老齡(40～44周)CD1小鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)作為青年組和老齡組，飼養(yǎng)環(huán)境為控溫20～25℃；控光14 h光照(6：00～20：00)和10 h黑暗(20：00～6：00)，自由采食、飲水，經(jīng)1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利等相關(guān)法規(guī)。

1.2GV期卵母細(xì)胞收集及體外成熟培養(yǎng)

將小鼠采用脫頸法處死，無菌采集其卵巢置于含有4 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)、37℃的操作液(M2)中。在實(shí)體顯微鏡下剝離卵巢附帶的結(jié)締組織等并清洗2～3次。將清洗后的卵巢置于M2操作液中，使用1 mL注射器的針頭(直徑0.45 mm)將其撕碎，在實(shí)體顯微鏡下回收卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。將COCs移入300 IU/mL的透明質(zhì)酸酶溶液中，在37℃恒溫臺上消化2 min，用M2操作液充分洗凈卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，挑選形態(tài)正常的GV期卵母細(xì)胞計(jì)數(shù)、備用。

將以上采集的青年組和老齡組GV期卵母細(xì)胞在37℃的體外成熟液(M16)滴中洗滌3次以后，移入覆蓋石蠟油的M16液(30 μL/滴)中，平均每滴15～20枚。然后將其置于37℃、5%CO2和100%濕度的條件下進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)至MII期。挑選形態(tài)正常的MII期卵母細(xì)胞計(jì)數(shù)、備用。

1.3MII期卵母細(xì)胞體外受精

選取健康的8～10 w CD1雄性小鼠，采用脫頸法處死，分別取出兩側(cè)附睪尾置于37℃恒溫臺上的無菌濾紙上，用濾紙吸附表面的脂肪和血跡。將附睪尾于提前平衡過夜的HTF受精液滴中剪開后使精子上浮，然后置于37℃、5%CO2和100%濕度的條件下孵育1～1.5 h，精子得以充分獲能。

將青年組和老齡組MII期卵母細(xì)胞在37℃的HTF受精液中洗滌3次以后，移入HTF受精液滴(75 μL/滴)中，平均每滴25～30枚。使用移液器吸取10 μL精子懸浮液加入含有卵母細(xì)胞的液滴中，使精子密度為5×106個(gè)/mL。受精4 h后，將卵母細(xì)胞從受精液滴中移出，在37℃的HTF培養(yǎng)液中充分洗凈，并移入覆蓋石蠟油的新鮮HTF培養(yǎng)液滴(75 μL/滴)中，于37℃、5%CO2和100%濕度的條件下培養(yǎng)，觀察其發(fā)育能力，統(tǒng)計(jì)胚胎原核形成的比例、胚胎卵裂率和囊胚發(fā)育率。

1.4表達(dá)譜芯片測定

各收集600枚青年組和老齡組形態(tài)正常的MII期卵母細(xì)胞，用口吸管吸取至1.5 mL PCR管中，瞬時(shí)離心使卵母細(xì)胞沉降至管底，棄除管內(nèi)多余操作液，于-80℃冰箱中作為芯片樣品保存。根據(jù)QIAGEN RNeasy Mini Kit試劑盒說明進(jìn)行芯片樣品總RNA提取和純化、cDNA制備、熒光標(biāo)記cRNA合成、cRNA純化等操作操作。使用分光光度計(jì)對已純化的cRNA濃度進(jìn)行測定，A260/A280比值在1.9～2.2即為符合標(biāo)準(zhǔn)的cRNA。對cRNA樣品片段化和芯片雜交，經(jīng)洗滌后進(jìn)行掃描。采用Feature Extraction 10.7.1.1軟件處理得到的原始圖像，并提取原始數(shù)據(jù)，使用Genespring12.5軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理原始數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)化為log以2為底的對數(shù)，最后在二維直角坐標(biāo)系平面中繪制散點(diǎn)圖，進(jìn)行分析。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS12.0軟件中的獨(dú)立樣本t-test進(jìn)行分析。P<0.05表示有顯著差異。

2結(jié)果

2.1生殖老化對小鼠MII期卵母細(xì)胞后期發(fā)育的影響

對116枚老齡組和113枚青年組MII期卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精后，選取不同時(shí)間在實(shí)體顯微鏡下觀察原核形成的情況。如圖1所示，與青年組相比，老齡組卵母細(xì)胞受精后原核形成較為延遲，老齡組受精后5 h的原核形成率(33.62%)顯著低于青年組4 h的原核形成率(41.77%)；老齡組受精后6 h時(shí)原核形成率(59.56%)與青年組5 h時(shí)原核形成率(55.19%)差異不顯著。此外，表1所示，體外受精胚胎的卵裂率無顯著差異，但囊胚發(fā)育率存在顯著差異(61.98%±1.77 vs.70.95%±1.61，P<0.05)。

圖1　老齡和青年CD1小鼠卵母細(xì)胞體外受精后原核形成的動(dòng)態(tài)曲線

表1生殖老化對CD1小鼠MII期卵母細(xì)胞體外受精后發(fā)育能力的影響

卵母細(xì)胞/枚卵裂率(%±SE)囊胚發(fā)育率(%±SE)老齡組11688(75.93±2.19)a72(61.98±1.77)a青年組11390(79.73±1.07)a80(70.95±1.61)b

注：同列不同上標(biāo)小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2生殖老化對小鼠MII期卵母細(xì)胞基因表達(dá)的影響

a)差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)和篩選

選擇老齡組和青年組樣本信號均與背景有顯著差異的探針為有效探針，然后對有效探針對應(yīng)的基因再次進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)FC值≥2.0。

結(jié)果如表2所示，一共有30 606個(gè)探針為有效探針，其中1 737個(gè)基因的FC值≥2.0，表達(dá)上調(diào)基因609個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因1 128個(gè)；FC值≥3.0的基因共計(jì)104個(gè)(16個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和88個(gè)表達(dá)下調(diào)基因)；FC值≥5.0的基因共計(jì)33個(gè)(5個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和28個(gè)表達(dá)下調(diào)基因)，均為cDNA片段或產(chǎn)物為長鏈非編碼RNA(lincRNA)。因此生殖老化導(dǎo)致小鼠MII期卵母細(xì)胞中5.68%的基因表達(dá)顯著改變，其中64.9%的基因表達(dá)下調(diào)，35.1%的基因則表達(dá)上調(diào)。

參考Su等人的標(biāo)準(zhǔn)[4]，F(xiàn)shr、Has2和Ptgs2這三種卵丘顆粒細(xì)胞特有的基因FC值均小于5.0，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受顆粒細(xì)胞基因表達(dá)的干擾。

表2老齡和青年小鼠卵母細(xì)胞差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

有效探針差異表達(dá)顯著基因(%)表達(dá)上調(diào)基因FC≥2.0(%)FC≥3.0(%)FC≥5.0(%)表達(dá)下調(diào)基因FC≥2.0(%)FC≥3.0(%)FC≥5.0(%)306061737(5.68%)609(35.1%)1651128(64.9%)8828

b)差異表達(dá)基因分析

選擇FC≥3.0的基因在Gene Ontology分析結(jié)果中查找其功能。88個(gè)表達(dá)下調(diào)基因中，除57個(gè)基因?yàn)閏DNA片段或產(chǎn)物為lincRNA外，7個(gè)基因功能未知，24個(gè)基因參與的生理過程見表3；16個(gè)表達(dá)上調(diào)基因中，除10個(gè)基因?yàn)閏DNA片段或產(chǎn)物為lincRNA外，1個(gè)基因功能未知，5個(gè)基因參與的生理過程見表4。這些基因的FC在3.0以上，而且參與細(xì)胞代謝的多個(gè)過程，說明其轉(zhuǎn)錄水平的改變對卵母細(xì)胞的正常機(jī)能影響較大。

表3FC≥3.0的表達(dá)下調(diào)基因

基因FC值參與生理過程Was3.5328肌動(dòng)蛋白纖維聚合、解聚和維持Dmnt13.4574DNA表觀修飾Kif5a4.5493微管結(jié)合和驅(qū)動(dòng)Mdh1b3.0572氧化還原反應(yīng)Olfr6294.3944Olfr3194.2702Olfr11154.1717Olfr974.0493Olfr1223.8028Olfr4823.5418Olfr743.3624Olfr6353.3468Olfr3983.0456G蛋白偶聯(lián)受體信號傳導(dǎo)Bzrap14.8013苯二氮受體結(jié)合Scm143.2984基因轉(zhuǎn)錄Itk3.2545免疫應(yīng)答Defb193.7226防御細(xì)菌感染Cd383.3621炎癥反應(yīng)Rin14.7186細(xì)胞內(nèi)吞Arvcf4.1307鈣依賴性細(xì)胞間粘附Vangl23.1179WNT信號傳導(dǎo)Gabarapl23.7063高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)Rab374.5323小GTP酶介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)

表4FC≥3.0的表達(dá)上調(diào)基因

基因FC值參與生理過程Mpo4.3863炎癥反應(yīng)Pigb3.3760糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白合成和代謝Ndufv13.0008氧化磷酸化Ctla2b3.2678負(fù)向調(diào)控肽鏈內(nèi)切酶活性Hdac104.3969組蛋白表觀修飾(H3K9,H4K16)

3討論

雌性哺乳動(dòng)物隨著年齡增加，其生殖能力下降。研究證明，這種生殖老化乃至失去生殖力的現(xiàn)象表現(xiàn)在多個(gè)方面，包括生殖激素的水平下降或紊亂、卵巢卵泡庫儲備下降、卵母細(xì)胞數(shù)量持續(xù)減少、卵母細(xì)胞質(zhì)量下降以及子宮內(nèi)膜接受性減弱等[5，6]。以昆明白小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停x取6～8周、36周和48周分別定為青年組、中年組和老年組，各組進(jìn)行卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，老年組卵母細(xì)胞體外受精后原核形成的時(shí)間比青年組和中年組時(shí)間延遲1 h[7]；老年倉鼠自然交配后合子形成原核的時(shí)間較青年倉鼠也存在約1 h的延遲[8]；老化的牛卵母細(xì)胞與解凍后的精子進(jìn)行IVF，合子的原核也推遲出現(xiàn)[9]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，由老齡和青年CD1小鼠卵母細(xì)胞體外受精所得胚胎的囊胚發(fā)育率均具有顯著差異，且整體處理組卵母細(xì)胞形成原核的時(shí)間延遲約1 h，說明生殖老化導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，進(jìn)而影響后期發(fā)育能力，與前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[10～13]。

目前已有許多文獻(xiàn)報(bào)道以卵母細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料使用表達(dá)譜芯片技術(shù)進(jìn)行研究[14～16]，如Pan等人使用表達(dá)譜芯片對各個(gè)發(fā)育時(shí)期卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行分析，研究卵母細(xì)胞成熟過程中重要生理過程的機(jī)制。之前也有報(bào)道使用芯片技術(shù)研究生殖老化導(dǎo)致的染色體非整倍性等異常現(xiàn)象[2，3]。本實(shí)驗(yàn)中，老齡小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)約有5.68%的基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯變化，與Hamatani等人結(jié)果類似[2]，老齡小鼠卵母細(xì)胞DNA受ROS積累等不利因素影響而更容易被損傷[17，18]，組蛋白H3K9和H4K16等位點(diǎn)的乙酰化參與修復(fù)DNA損傷，從而保證受精后各種關(guān)鍵事件的按時(shí)發(fā)生[20]，組蛋白去乙?；窰DAC10能夠特異性對H3K9和H4K16進(jìn)行去乙酰化，而生殖老化對H3K9和H4K16乙?；綗o影響[21，22]，與HDAC10的作用不沖突。因此老齡小鼠卵母細(xì)胞Hdac10表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致H3K9和H4K16乙酰化水平降低，可能會降低合子內(nèi)母源組蛋白乙?；迯?fù)受損傷DNA的作用，推遲原核形成。

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cDNA Microarray-Based Analysis of Effects of Aging on Developmental Competence of Murine Oocyte

CHANG Zhuo1,2，F(xiàn)U Xiang-wei1，ZHU Shi-en1*

(1.College of Animal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.Beijing General Station of Animal husbandry，Beijing 100101，China)

Abstract：The purpose is to investigate the correlation between the old and young mouse oocyte early embryonic development and the molecular alteration of the old mouse oocyte.Compared with young mice oocytes，the early embryonic pronucleus formation of old mice oocytes after in vitro fertilization(IVF)delays 1 h，ratios of blastocysts appear significant difference(IVF：61.98% vs.70.95%，P<0.05).Furthermore，results of cRNA microarray-based analysis show that within the increasing of age，1737 genes expression showed significant difference(fold-change is not less than 2).Ratios of up-regulated and down-regulated genes are 64.9% and 35.1% respectively，which make oocyte quality decline.Therefore，differentially expression of genes which affected by the reproductive aging，such as Hdac10，makes oocyte quality decline，and has an great impact on the development competence ultimately.

Key words：oocyte；reproductive aging；meiosis；genetic expression；mouse

收稿日期：2016-04-26

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號31372307)

作者簡介：常卓(1989-)，女，碩士研究生，畜禽遺傳資源保護(hù)與利用。 通信作者：朱士恩(1956-)，男，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：zhushien@cau.edu.cn

中圖分類號：S814.3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-2739(2016)04-0007-05