藍(lán)　嵐，梁克紀(jì)，張羽飛，李厚忠

(1 黑龍江省牡丹江市衛(wèi)生局衛(wèi)生監(jiān)督所傳染病監(jiān)督科，黑龍江牡丹江　1570001；2牡丹江第一人民醫(yī)院血液科，黑龍江牡丹江　157011；3 牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江　157011；4牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理研究室，黑龍江牡丹江　157011)

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維生素A缺乏對(duì)缺鐵性貧血的影響
——體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究

藍(lán)嵐1，梁克紀(jì)2，張羽飛3，李厚忠4

(1黑龍江省牡丹江市衛(wèi)生局衛(wèi)生監(jiān)督所傳染病監(jiān)督科，黑龍江牡丹江1570001；2牡丹江第一人民醫(yī)院血液科，黑龍江牡丹江157011；3牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江157011；4牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理研究室，黑龍江牡丹江157011)

摘要：目的：研究維生素A缺乏對(duì)缺鐵性貧血的影響。方法：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將SD大鼠按體重隨機(jī)分為4組，分別為Fe+維生素A-Ⅰ組、Fe+維生素A-Ⅱ組、Fe+維生素A-Ⅲ組、Fe-維生素A-Ⅳ組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂飼8w后處死后取肝臟。體外實(shí)驗(yàn)將大鼠原代肝細(xì)胞按Seglen法分離后，隨機(jī)分為嚴(yán)重缺乏組A、邊緣性缺乏組B、正常生理組C、治療劑量組D，分別給予0、0.5、1.0、50μmol/L 的全反式視黃酸培養(yǎng)72h。用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR法)檢測肝臟的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)mRNA、鐵蛋白(Fn)mRNA的表達(dá)。結(jié)果：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)大鼠維生素A缺乏時(shí)，肝臟TFR mRNA表達(dá)增強(qiáng)，而Fn mRNA表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。結(jié)論：維生素A缺乏可以使大鼠肝臟 TFR mRNA表達(dá)增強(qiáng)而Fn mRNA表達(dá)下降，而補(bǔ)充維生素A后鐵缺乏造成的很多不利影響都顯著減輕了。

關(guān)鍵詞：維生素A缺乏；缺鐵性貧血；轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；鐵蛋白

大量流行病學(xué)觀察研究和臨床干預(yù)研究均證實(shí)了缺鐵性貧血與維生素A缺乏有關(guān)，補(bǔ)充維生素A有助于改善貧血，但對(duì)兩者的關(guān)系的作用原理還研究得很少且維生素A對(duì)鐵代謝的機(jī)制和基礎(chǔ)還沒有具體闡明[1]。轉(zhuǎn)鐵調(diào)節(jié)蛋白受體與鐵蛋白作為細(xì)胞鐵代謝的主要調(diào)節(jié)物，在調(diào)節(jié)鐵的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)上起到非常重要的作用，這種調(diào)控作用近年來受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。本實(shí)驗(yàn)通過大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)來研究維生素A作為一種營養(yǎng)輔助因子，如何能夠調(diào)節(jié)肝轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和鐵蛋白mRNA表達(dá)，進(jìn)而影響鐵代謝，為維生素A缺乏導(dǎo)致貧血提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

Ⅳ型膠原酶、Ⅰ型膠原、DMEM培養(yǎng)基，Gibco BRL，USA；PCR試劑TaKaRa Taq DNA Polymerase Kit，大連寶生物工程有限公司；引物，上海英駿生物技術(shù)有限公司提供合成等。

1.2大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

SD雄性21d齡的大鼠，52只，在飼養(yǎng)室適應(yīng)喂養(yǎng)1w后，按體重隨機(jī)分為4組，每組13只。Ⅰ組 Fe：35mg/kg 飼料、維生素A ：1 200μg/kg飼料；Ⅱ組 Fe：35mg/kg飼料、維生素A：0 μg/kg飼料；Ⅲ組 Fe ：35mg/kg飼料、維生素A ：120μg/kg飼料；Ⅳ組 Fe ：15mg/kg飼料、維生素A ：120μg/kg飼料。單籠常規(guī)喂養(yǎng)8w處死動(dòng)物，分離肝臟備檢[3]。

1.3大鼠體外實(shí)驗(yàn)

參照Seglent法[4]分離原代肝細(xì)胞，接種于Ⅰ型膠原凝膠包被的培養(yǎng)板內(nèi)，經(jīng)過12h培養(yǎng)后，隨機(jī)分為A組(維生素A完全缺乏組)：培養(yǎng)液中只含有0.5%DMSO；B組(維生素A邊緣缺乏組)：0.5μmol/L atRA；C組(維生素A正常對(duì)照組)：1μmol/L atRA；D組(維生素A治療組)：培養(yǎng)液中含有0.5%DMSO、50μmol/L atRA。培養(yǎng)72h后收集肝細(xì)胞備檢。

1.4引物

內(nèi)參照(β-actin)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)、鐵蛋白(Fn)基因引物核酸序列為β-actin：GTGATGGTGGGAATGGGTCAG(上游5’→3’)、TTTGATGTCACGCACGATTTCC(下游5’→3’)；TfR：ACATGGACAGGAATACGTTC(上游5’→3’)、CAATCGGATGCTTTACGTCC(下游5’→3’)；Fn：GTCTCCCTCGCAAGTGCGCC(上游)、下游：TGCATTCAGCCCGCTCTCCC(5’→3’)。分子量分別為512、708、250。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR-100CRTMPCR儀上進(jìn)行，PCR條件為94 ℃預(yù)變性4min，94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸50 s，各指標(biāo)經(jīng)過35個(gè)循環(huán)。保持72℃10min，給予4℃儲(chǔ)存[5]。2%瓊脂糖凝膠電泳處理PCR產(chǎn)物，在凝膠圖象分析系統(tǒng)上掃描電泳結(jié)果，比較TFR、Fn產(chǎn)物的密度值，與β-actin的比。

1.5數(shù)據(jù)處理

2結(jié)果與分析

圖1—4中Ⅱ組、Ⅲ組和Ⅳ組結(jié)果顯示，TFR mRNA表達(dá)增強(qiáng)，Ⅰ組TFR mRNA的表達(dá)最低，F(xiàn)n mRNA的表達(dá)趨勢與之相反(P<0.05)；體外實(shí)驗(yàn)隨著atRA劑量的增加、TFR mRNA表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)n mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)?？梢姡诟渭?xì)胞維生素A缺乏時(shí)，TFR mRNA在肝臟表達(dá)增加，而Fn mRNA表達(dá)降低，提示，在維生素A缺乏時(shí)機(jī)體通過影響大鼠鐵代謝，肝細(xì)胞從血中攝取鐵增加，從而紅細(xì)胞因鐵的利用降低而導(dǎo)致貧血的發(fā)生。補(bǔ)充atRA可緩解這種改變，TFR mRNA在肝臟的表達(dá)減少，F(xiàn)n mRNA的表達(dá)增加，使貧血得到緩解。

圖1　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TFR mRNA的表達(dá)(708bp)

圖2　體外實(shí)驗(yàn)大鼠atRA作用后各組TFR mRNA的表達(dá)(708bp)

圖3　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟鐵蛋白mRNA的表達(dá)(250bp)

圖4　體外實(shí)驗(yàn)atRA作用后各組Fn mRNA的表達(dá)(250bp)

3討論

大量流行病學(xué)觀察研究和臨床干預(yù)研究均證實(shí)了貧血與維生素A缺乏有關(guān)，維生素A缺乏影響貧血癥狀的核心機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)鐵代謝，研究維生素A對(duì)鐵代謝影響及相關(guān)機(jī)制，不僅可以為維生素A缺乏如何導(dǎo)致貧血提供理論依據(jù)，對(duì)于制定合理的營養(yǎng)干預(yù)方案、預(yù)防和治療維生素A和鐵這2種營養(yǎng)素缺乏癥具有重要的指導(dǎo)意義。對(duì)機(jī)體鐵代謝相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，為從微觀水平研究維生素A對(duì)鐵代謝基因的影響提供了基礎(chǔ)。細(xì)胞鐵的穩(wěn)態(tài)主要被幾種蛋白所調(diào)控，這些蛋白包括完成細(xì)胞攝取功能的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、完成貯存功能的鐵蛋白和調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵濃度的中心蛋白—鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRP)，其數(shù)量直接關(guān)系到細(xì)胞鐵代謝的平衡，它們協(xié)作完成鐵在細(xì)胞內(nèi)的利用，確保在細(xì)胞需要時(shí)有足夠的鐵供給，但卻避免鐵毒性[6]。

本次體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果一致，表明大鼠維生素A缺乏時(shí)，肝臟鐵蛋白降低、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體升高，這種作用直接導(dǎo)致肝細(xì)胞對(duì)鐵的供給、需求增加，當(dāng)機(jī)體內(nèi)維生素A缺乏時(shí)鐵在各臟器中的分布發(fā)生改變，使機(jī)體在肝臟中鐵的含量增加，從而紅細(xì)胞中含量降低，使貧血更加嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)在補(bǔ)充atRA后，這種貧血的惡性癥狀得以緩解、減輕，結(jié)果提示，維生素A缺乏時(shí)可通過減少鐵蛋白、增加轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因的表達(dá)來調(diào)控鐵代謝，當(dāng)體內(nèi)維生素A缺乏時(shí)，會(huì)出現(xiàn)機(jī)體鐵分布異常，從而導(dǎo)致鐵利用障礙，這與Annet[7]的研究觀點(diǎn)相同。但維生素A缺乏是否影響鐵結(jié)合蛋白的結(jié)合活性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)—鐵蛋白(Fn)的表達(dá)還需要進(jìn)一步研究。◇

參考文獻(xiàn)

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(責(zé)任編輯李婷婷)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：30872107)；黑龍江省自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：D200641)。

作者簡介:藍(lán)嵐(1981—)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：傳染病防控。

Effects of VA Deficiency on Iron Deficiency Anemia in Vivo and in Vitro Experiments

LAN Lan1，LIANG ke-ji2，ZHANG Yu-fei3，LI Hou-zhong4

(1Health Supervision Institute of Mudanjiang Municipal Health Bureau，Mudangjiang 157000，China；2The First Hospitl of Mudanjing，Mudanjiang 157011，China；3Medical Research Center，Mudanjing Medical University，Mudanjian 157011，China；4Department of Pamacy，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China)

Abstract：ObjectiveTo study the effects of vitamin A (VA)deficiency on iron deficiency anemia in vivo and in vitro experiments in rats.MethodVivo study：Totally 52 male SD rats were divided randomly into 4 groups according to their body weights and every group including normal VA group(Ⅰ)，entire VA deficient group(Ⅱ)，slight VA deficient group(Ⅲ)，slight VA and iron deficient group(Ⅳ).After they were raised for 8 weeks，the rats were sacrificed.Vitro sturdy：Rat primary hepatocytes were isolated by two - step in situ collagenase perfusion method by Seglent，and treated with 0，0.5，1，and 50μmol/L atRA respectively for 72h.The level of liver and hepatic transferring receptor mRNA and ferritin mRNA expression were measured using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)method.ResultRat liver TFR mRNA levels were increased by VA deficiency，F(xiàn)n mRNA expression was decreased(P<0.05).ConclusionVA deficiency could change hepatic expression of TFR mRNA and Fn mRNA.AtRA supplementation inhibited these expressions，which in turn led to anemia.

Keywords：vitamin A deficiency；iron deficiency anemia；transferrin receptor；ferritin