明凱華　雷秀霞　鄒愉　楊娜　徐邦牢　黃子宜

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中國廣東地區(qū)漢族人群P選擇素糖蛋白配體?1 Met62Ile基因多態(tài)性與冠心病的相關性探討

明凱華★雷秀霞鄒愉楊娜徐邦牢黃子宜

［摘要］目的探討P選擇素糖蛋白配體?1（P?selectin glycoprotein ligand?1，PSGL?1）Met62Ile （M62I）基因多態(tài)性在中國廣東地區(qū)漢族人群中的分布特點及其與冠心?。╟oronary heart disease，CHD）的相關性。方法應用聚合酶鏈反應?限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction restriction?fragment length polymorphism，PCR?RFLP）分析方法檢測200名該地區(qū)冠心病患者和200名漢族健康人群PSGL?1 M62I基因型，計算并比較各組基因型頻率及等位基因頻率。結果200名冠心病組中P選擇素PSGL?1 M62I基因型以Met/Met（M/M）型發(fā)生頻率最高（73.0%），Met/Ile（M/I）型次之（27.0%），未檢測到Ile/Ile（I/I）型；M、I各型等位基因頻率分別為86.5%、13.5%，該位點基因多態(tài)性分布在男女間無顯著性差異（P>0.05）。200名正常對照組中P選擇素PSGL?1 M62I基因型以M/M型發(fā)生頻率最高（69.0%），M/I型次之（31.0%）未檢測到I/I型；M、I各型等位基因頻率分別為84.5%、15.5%，該位點基因多態(tài)性分布在男女間無顯著性差異（P>0.05）。兩組人群間各基因型及等位基因分布無顯著性差異（P> 0.05）。結論中國廣東地區(qū)冠心病患者和健康人群PSGL?1 M62I基因多態(tài)性在男女之間均無較大的差異。PSGL?1 M62I位點可能不是冠心病的易感基因。

［關鍵詞］PSGL?1；基因多態(tài)性；冠心病；性別

P選擇素糖蛋白配體?1（P?selectin glycoprotein ligand?1，PSGL?1）作為P選擇素的配體被發(fā)現(xiàn)的粘附分子，是一種跨膜的糖蛋白，具有同源二聚體的結構，具有廣泛的生物學活性，其單體分子量約為120 kD，表達于幾乎所有類型的白細胞表面［1］。分子生物學研究證實，PSGL?1基因存在多個位點多態(tài)性并影響其轉錄和表達［2］。且PSGL?1基因多態(tài)性可能與炎癥性疾病如冠心病等具有相關性。人類PSGL?1基因位于染色體的12q24區(qū)域，包含2個外顯子［3］。目前國外有一些關于PSGL?1基因多態(tài)性與疾病的研究報道，主要是M62I與可變數(shù)量的串聯(lián)重復序列（variable num?ber tandem repeat，VNTR）等位點與心腦血管疾病的相關研究［4-9］。這些基因多態(tài)性的存在可能影響PSGL?1基因表達和功能。由于國外的文獻均是以歐美洲地區(qū)人群為研究對象，而我國僅有VNTR基因多態(tài)性與冠心病方面的報道［10］，但結果并無相關性。而M62I位點則無相關報道，這可能由于與該位點多態(tài)性在亞洲人群中少見或者與心腦血管疾病相關性不強有關。因此，本文旨在通過探討我國廣東地區(qū)漢族人群PSGL?1 M62I基因多態(tài)性的分布特點及與冠心?。╟oronary heart disease，CHD）間的相關性，了解我國漢族人群PSGL?1 M62I基因多態(tài)性的分布情況，分析PSGL?1 M62I基因與冠心病間的易感性。

1　材料與方法

1.1主要材料

1.1.1試劑

人白細胞DNA提取試劑為中山大學達安基因股份有限公司產(chǎn)品；Permix Taq試劑為日本Ta?kara公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶Rsa I為美國Thermo公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。

1.1.2引物設計與合成

參照有關文獻［8］設計一對引物，P1：5′?CTT?GCCAGAAACGGAAGCTCCAGAAGT?3′，P2：5′?TTCCCCATGTTGGCCAGCTCCGT?3′。以上引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2實驗對象

冠心病組：200例，均來自2015年3月至10月廣州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科病房或冠心病監(jiān)護病房，病例均符合1979年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）關于缺血性心臟病的命名和診斷標準。男性151例，女性49例，年齡37~83歲，平均年齡（54.7±10.2）歲。正常對照組：200例，隨機選取廣州市第一人民醫(yī)院健康體檢者作為正常對照組，男性151例，女性49例，年齡32~79歲，平均年齡（42.6±8.5）歲。臨床、心電圖和實驗室檢查均正常，排除肝、腎、內(nèi)分泌和心腦血管疾病。所有研究對象均為自然人群、漢族且無血緣關系。

1.3實驗儀器

美國伯樂公司BIO?RAD S1000型PCR擴增儀和BIO?RAD Power Pac電泳儀；日本TOMY公司KIT?MAN高速冷凍離心機；英國UVI凝膠成像系統(tǒng)。

1.3實驗方法

1.3.1取材

受檢者禁食12 h以上，次晨用EDTA?K2抗凝管采肘靜脈血，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2人類基因組白細胞DNA提取

按照人白細胞基因組提取試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司）的說明進行。

1.3.3方法

聚合酶鏈反應?限制性片段長度多態(tài)性（poly?merase chain reaction restriction?fragment length polymorphism，PCR?RFLP）。

1.3.4PCR擴增條件

參照相關文獻［9］進行。反應體系為25 mL，其中含Permix Taq 15 mL，引物P1、P2各20 pmol，模板DNA 2.0 mL，不足體積用滅菌雙蒸水補足至25 mL，置PCR儀中進行擴增。反應條件為94℃5 min；再按下列程序循環(huán)35次：94℃30 s，61℃30 s，72℃45 s；末次循環(huán)后，72℃5 min。

1.3.5擴增產(chǎn)物的限制性酶切

酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，通過英國UVI凝膠成像系統(tǒng)判斷結果。酶切條件見表1。

表1PSGL?1M62I酶切條件Table 1　Digestion conditions of PSGL?1M62I

1.4統(tǒng)計學方法

所有資料均以SPSS 12.0軟件包分析?；蛐秃偷任换蝾l率采用直接基因計數(shù)法計算。研究對象與Hardy?Weinberg平衡的符合程度、單個基因型及組間等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗。男女間基因頻率比較采用R×C列聯(lián)表χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1PSGL?1 M62I基因型檢測結果

冠心病組與正常組中均存在PSGL?1 M62I基因多態(tài)性：PCR擴增產(chǎn)物片段大小均為174 bp，根據(jù)限制性內(nèi)切酶Rsa I酶切片段的情況，基因型有2種，Met/Met（M/M）型（27 bp一條帶），Met/Ile（M/ I）型（27 bp、147 bp 2條帶），均未檢測到Ile/Ile（I/I）型（147 bp一條帶）。見圖1。

2.2PSGL?1 M62I基因多態(tài)性分布情況

在冠心病組各基因型分布中M/M型73.0%，M/I型27.0%，I/I型0；等位基因頻率分布為M型86.5%，I型13.5%。男女間基因型、等位基因頻率分布存在較大差異（P=0.07），但差異無顯著性（P> 0.05）（表2）。

表2 冠心病組男女PSGL?1M62I基因型及等位基因分布（%）Table 2　Distribution of CHD group PSGL?1M62Ipolymorphism genotype and allele frequencies in male and female（%）

在正常對照組各基因型分布中M/M型69.0%，M/I型31.0%，I/I型0；等位基因頻率分布為M型84.5%，I型15.5%。男女間基因型、等位基因頻率分布均無顯著性差異（P>0.05）（表3）。

2.3組間PSGL?1 M62I基因型頻率及等位基因攜帶頻率比較

排除年齡和性別影響后兩組間PSGL?1 M62I多態(tài)性相比較，發(fā)現(xiàn)PSGL?1 M62I基因型分布及等位基因攜帶頻率均無顯著差異（P> 0.05）（表4）。

3　討論

冠心病是由環(huán)境和遺傳等多種因素共同作用而導致的一類極其復雜的疾病，炎癥基因也被認為在冠狀動脈粥樣硬化形成中起了重要的作用。PSGL?1是體內(nèi)參與炎癥反應的重要粘附分子。PSGL?1是90年代初期發(fā)現(xiàn)的一種作為P?選擇素的配體的粘附分子，是一種I型跨膜的糖蛋白，選擇素及其配體PSGL?1可在血流狀態(tài)下介導白細胞在內(nèi)皮細胞上的起始粘附，進而引起一系列的級聯(lián)反應，最終促進了動脈粥樣硬化斑塊的形成［11］。因此，PSGL?1在冠心病發(fā)病機制中可能發(fā)揮一定的作用。

近些年，國外僅有幾篇關于PSGL?1 M62I基因多態(tài)性與心腦血管方面研究的文獻［2，4-5，9］，而國內(nèi)只有關于PSGL?1 M62I基因多態(tài)性與腦卒中方面研究［12］，心血管方面則無文獻報道。因此，本研究率先分析了中國廣東地區(qū)200名冠心病患者與200名正常對照人群PSGL?1 M62I基因多態(tài)性的遺傳分布特點，結果顯示CHD組和正常對照組各基因型和等位基因頻率分布幾乎一致，在我們所觀察的2組人群中M62I均只表現(xiàn)出2種基因型：M/M型和M/I型，這與國外文獻報道相符［2，5，9］。但并未發(fā)現(xiàn)I/I型，可能研究的樣本量還不夠。由此說明同其他國家和地區(qū)一樣在我國廣東地區(qū)漢族人群中存在M62I基因多態(tài)性，也證明基因多態(tài)性是人類基因組中非常普遍的現(xiàn)象。

性別差異在心血管疾病的病理有尚未得到廣泛研究［13?15］。有證據(jù)表明性別特異性影響人類基因表型結構，包括生殖，生理和疾病特征［16-18］。本次研究顯示兩組人群中CHD PSGL?1 M62I基因多態(tài)性在男女間差異均無顯著性（P>0.05）。另外，本研究發(fā)現(xiàn)CHD組中PSGL?1 M62I M/M和I/I基因型在男女間存在較大差異（P=0.07），但未有顯著性差異，可能與樣本量不夠大有關。本研究結果與Volcik等［8］文獻報道并不相符，這種差別可能是導致冠心病在不同性別及種族間的發(fā)病率和臨床表現(xiàn)存在顯著不同的因素之一。

對M62I位點酶切多態(tài)性進行分析顯示：CHD 組M/M、M/I基因型構成比分別為73.0%和27.0%，對照組中分別為69.0%和31.0%，PSGL?1 M62I位點多態(tài)性在兩組間的分布無統(tǒng)計學差異（P> 0.05）。說明M62I位點可能不是CHD的易感基因，后期需加大兩組間的樣本量再進行比較。

另外，本研究結合國外相關文獻，將塞爾維亞［8］、德國［4］人群PSGL?1 M62I基因多態(tài)性研究結果與本研究進行對比分析，我們發(fā)現(xiàn)PSGL?1 M62I基因型和等位基因頻率與西方這些國家人群均分別存在顯著差異（P<0.001），M型等位基因頻率遠遠低于以上2個地區(qū)人群水平，而I型等位基因頻率則高于以上2個地區(qū)人群水平，說明M62I基因多態(tài)性在不同種族間呈現(xiàn)種族和地域的差異顯著。這一結果符合遺傳學規(guī)律，即親緣關系越遠，其基因型分布越顯著。

綜上，基因多態(tài)性是人類基因組中一個較為常見的現(xiàn)象，而心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展受到多種因素的影響。本文以PSGL?1 M62I基因作為研究對象，研究我國漢族人群中PSGL?1 M62I基因多態(tài)性的分布特點并探討該位點多態(tài)性與CHD的關系，從而為今后進一步研究我國漢族人群中某些疾病的發(fā)生發(fā)展與PSGL?1 M62I基因多態(tài)性的關系奠定基礎。

表3　正常組男女PSGL?1M62I基因型及等位基因分布（%）Table 3　Distribution of normal group PSGL?1M62Ipolymorphism genotype and allele frequencies in male and female（%）

表4CHD組與正常組間PSGL?1M62I多態(tài)性相比較（%）Table 4　Comparison of PSGL?1M62Ipolymorphisms between CHD group and normal group（%）

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基金項目：廣州市衛(wèi)生醫(yī)藥科技項目（20151A010009）

作者單位：廣州市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東，廣州510180★通訊作者：明凱華，E?mail：kz?1979@163.com

Investigate the relationship between P?selectin glycoprotein ligand?1M62Igene polymorphism and coronary heart disease in China Guangdong Han Population

MING Kaihua★，LEI Xiuxia，ZOU Yu，YANG Na，XU Banglao，HUANG Ziyi
（Department of Laboratory Medicine Section，Guangzhou First Municipal People’s Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，510180）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the different age groups distribution of P?selectin glycoprotein ligand?1(PSGL?1)Met62Ile(M/I)gene polymorphism in the Chinese Han population and the relationship between the polymorphism and coronary heart disease(CHD).MethodsPolymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCR?RFLP)analysis was used to detect the genotype and allele frequency of PSGL?1 M62I in 200 patients with CHD and then the genotype and allele frequencies were compared to a control population of 200 healthy,Han Chinese.ResultsIn the 200 CHD patients of Guangdong area,the highest frequency of PSGL?1 M62I genotype is M/M(73.0%),followed by M/I(27.0%).The I/I genotype was not detected;M,I allele frequencies were 86.5%and 13.5%.These gene polymorphisms had no significant difference between males and females(P>0.05).In the healthy control population,the highest frequency of PSGL?1 M62I genotype is M/M(69.0%),followed by M/I(31.0%).The I/I genotype was also not detected.The allele frequencies of M and I were 86.75%and 13.25%.These gene polymorphisms had no significant difference between males and females(P>0.05).There were no significant differences between CHDgroup and normal group(P>0.05).ConclusionBetween the CHD patients and healthy Han Chinese population of the Guangdong area in China,there were no significant differences in PSGL?1 M62I gene polymorphism.The PSGL?1 M62I gene may not be the susceptibility gene of CHD.

［KEY WORDS］PSGL?1;Genetic polymorphism;CHD;Gender