尹慶慶　王建宇　　陳強　　周曉紅★

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?綜述?

登革病毒治療性抗體的基礎研究進展

尹慶慶1王建宇1陳強2周曉紅1★

［摘要］近年來蚊媒性傳染病登革熱在全球呈現(xiàn)快速蔓延和上升流行趨勢，但目前仍沒有特異性的治療藥物和有效疫苗應用于臨床。登革病毒（dengue virus，DENV）治療性抗體的研發(fā)面臨抗體依賴性增強效應（antibody dependent enhancement，ADE）等方面的阻滯。本文就目前DENV治療性抗體主要靶向表位及ADE等基礎研究進行綜述，為治療性抗體和疫苗深入研究提供參考。

［關鍵詞］登革病毒；治療性抗體；抗體依賴性增強效應；人源中和抗體；E蛋白二聚體依賴性表位

登革熱（dengue fever，DF）是由登革病毒（den?gue virus，DENV）引起的一種蚊媒傳染性疾病，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，目前疫情已快速蔓延至100多個國家，全球超出1/3人口正面臨感染DENV的風險［1］。平均每年感染DENV的3.9億人口中近25%出現(xiàn)臨床癥狀［2］，可導致普通DF和重癥DF，重癥DF患者有嚴重出血、休克及嚴重臟器損傷等高危臨床表現(xiàn)［3］。2014年登革熱在我國尤其在廣東/廣州大規(guī)模暴發(fā)流行，疫情以DENVⅠ型為主，Ⅱ型、Ⅲ型散發(fā)，重癥病例顯著增多，其中血小板嚴重下降、多器官衰竭病例增多，結合近年來Ⅰ~Ⅳ型DENV均在廣州出現(xiàn)，再次感染尤其是出現(xiàn)交叉型別感染易增加病毒感染的抗體依賴性增強效應（antibody dependent enhancement，ADE），而登革熱目前仍沒有特異性治療藥物和有效疫苗，登革熱防控形勢依然嚴峻。因而，開展DENV中和性抗體相關研究一直是重要的防治研究方向，為治療性抗體的進一步研制奠定基礎，本文就其國內外基礎研究進展進行綜述。

1　登革病毒生物學特征

DENV是一種有包膜的單股正鏈RNA病毒，隸屬于黃病毒屬，其基因共編碼10種蛋白，其中3種結構蛋白（C、M、E蛋白）和7種非結構蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5蛋白）。病毒成熟期間，在furin蛋白酶作用下，前體蛋白（prM）可被切割為pr片段和膜結合蛋白（M），并使病毒顆粒表面的包膜蛋白（E）重排，形成含M蛋白的病毒顆粒。prM釋放初期，病毒顆粒開始具感染性，E蛋白結合到細胞受體，介導病毒和細胞膜的融合，致使病毒的RNA進入細胞內［4］。一個成熟的DENV外膜由90個E蛋白二聚體組合形成20面體結構。所有的E蛋白亞單位組成不相同的病毒表面蛋白結構、空間位置以及與其他因素的相互作用，導致E蛋白對受體亞單位和抗體的結合效應的時空動態(tài)性。E蛋白單體在中性pH條件下是一種維持亞穩(wěn)定狀態(tài)的可溶性蛋白，包括3個結構域：EDⅠ、EDⅡ和EDⅢ。EDⅠ對于穩(wěn)定E蛋白的氨基端和DⅡ的羧基端環(huán)狀結構起重要作用；EDⅡ包含疏水融合環(huán)（fusion loop，F(xiàn)L），促進弱酸性環(huán)境下與內體膜的融合［5］；EDⅢ是DENV與細胞膜受體結合的主要功能區(qū)域，EDⅢ空間構象改變或基因突變可能會影響與膜的融合，導致病毒毒力的減弱或致使病毒逃逸于機體的免疫中和效應。

DENV血清型分類是主要由E蛋白決定，分4種不同血清型（DENVⅠ~Ⅳ）。非結構蛋白中特別是NS1蛋白在病毒感染和機體免疫過程中起重要作用。

NS1蛋白是DENV中一種高度保守的糖蛋白。Kyung等［6］報道西尼羅病毒NS1蛋白也存在3個結構域：FR?Ⅰ、FR?Ⅱ和FR?Ⅲ，但具體結構尚未解析。人體血液循環(huán)中游離的NS1蛋白已被用來作為DENV感染急性期的血清標本檢測指標［7］。

DENV感染宿主的特點有：（1）初次感染某種血清型的DENV后，感染者能產生針對同型DENV長久免疫保護作用［8］；（2）當再次接觸異型DENV時，體內抗體與異型病毒會有短暫的交叉反應且特異結合能力弱，由于ADE效應導致感染加重［9］，ADE效應多發(fā)于二次感染；（3）對于感染過某種類型DENV孕婦，出生嬰兒若感染與母親同型DENV時，由于嬰兒體內抗體濃度較低，亦可能出現(xiàn)嚴重感染現(xiàn)象；（4）未完全成熟的DENV顆粒開始具有感染性。

2　登革中和性抗體研究現(xiàn)狀

目前DENV抗體研究，從抗體來源分鼠源、人源化和人源3種類型，人源化抗體與鼠源抗體相比具有的特點：（1）免疫原性低于鼠源抗體；（2）親和力弱于鼠源抗體，特異性優(yōu)于鼠源抗體；（3）人源化抗體Fc段能夠誘發(fā)機體的效應功能；（4）在體內半衰期長；（5）價格仍較昂貴。人源化抗體仍含有10%~30%的鼠源蛋白，在臨床應用時仍存在免疫排斥反應的潛在威脅，因而人源抗體是DENV治療性抗體的重要研發(fā)目標之一。構建全人抗體的方法主要有抗體庫技術和轉基因小鼠技術。但亦有報道對一些人源化和人源抗體進行序列比較分析，并沒有顯著性差異；人源化單抗與全人單抗的免疫原性之間的差異亦是微弱的；結合親和力往往與交叉反應性相關，即與靶位點結合非常強烈的單抗亦可與結構相似非靶蛋白結合，因而，抗體親和力增強也可導致特異性減弱［10］。

DENV抗體中和性研究是深入研發(fā)治療性抗體的重要基礎?？贵w中和活性檢測方法多樣，中和活性檢測的金標準是噬菌斑減少中和試驗，一種改進的基于酶聯(lián)免疫斑點技術的微中和試驗技術，使中和實驗更為便捷［11］。DENV抗體根據(jù)其識別特點，分為型特異性抗體和交叉反應性抗體?？贵w產生ADE效應的功能大于中和效應，稱為增強抗體。人體感染DENV后，產生的DENV抗體中有同時針對3種類型或4種類型的通用型抗體，亦有分別針對單一型別的特異性抗體，且部分抗體存在明確的ADE效應。由于NS1不是病毒顆粒的組成成分，因此認為抗NS1抗體一般不產生ADE效應。DENV中和抗體型別主要是IgG。大量體內、外實驗證明：中和抗體能有效阻止DENV的感染，不僅能發(fā)揮病毒感染前的預防作用，而且在病毒感染后的一段時期內，依然能發(fā)揮治療病毒感染的作用。

2.1DENV中和抗體主要靶向表位

DENV中和抗體對同型DENV的中和能力隨毒株的不同，甚至同種毒株基因型的不同而不同［12］。一般而言，對其誘發(fā)毒株的中和能力是最強的。DF流行末期中和抗體水平高于流行初期，輕癥DF患者中和抗體水平高于重癥患者［13］。理想的DENV治療性抗體是能同時針對4種血清型的廣譜中和抗體，又能避免ADE效應。人體感染DENV后體內可以針對不同的登革抗原表位產生多種單克隆抗體，其中就有多種是中和抗體。特異性的中和抗體大多在初次感染產生，而二次感染和恢復期患者的血清中有交叉反應抗體，同時也存在ADE效應。

目前研究認為，以90個密集的二聚體穿插分布在DENV膜表面的E蛋白是主要抗原，是治療性抗體和疫苗研發(fā)的主要靶標［14］。雖然研究表明單抗可結合到DENV E蛋白的所有3個結構域，但最高效的結合表位位于EDⅢ。EDⅢ存在2部分重疊區(qū)域，其旁一根突起的側脊是與中和抗體高效結合的表位區(qū)。DENV抗體研究靶向PrM和NS1亦有報道［15］。C蛋白為補體結合抗原，一般不誘導機體產生中和性抗體。E、PrM和NS1的相關抗體研究因抗原不同的特性而分別靶向中和作用、ADE效應、診斷效能3個不同的領域。目前全球有關中和抗體的研究簡況總結見表1。

表1　具有DENV中和作用的單抗基礎研究情況一覽表Table 1　A list of the recent progress in basic research concerning the therapeutic anti?dengue antibodies

*本機構非該抗體的直接研發(fā)機構，開展了抗體中和作用等功能研究工作

E蛋白表面預測有180個潛在抗體結合位點［43］，有線性和立體構象型表位，并非均能成為抗體結合的有效表位。E蛋白的3個結構域對應的單抗：抗DEⅠ單抗具有群特異性的，由于空間位阻，抗EDⅡ抗體不具備或僅具備弱的中和作用［44］。EDⅢ參與病毒的感染過程，且該區(qū)相對保守，是E蛋白抗體的主要研究區(qū)域，抗EDⅢ抗體保護作用主要是阻斷DENV與宿主細胞的融合。EDⅢ在3個結構域中免疫原性最強，因而是DENV亞單位疫苗及DNA疫苗及中和抗體系列研究的重要靶標，可誘導中和抗體以及Thl為主的T細胞免疫反應的產生［45］。研究證實交叉保護性鼠源單抗主要識別位于EDⅠ和EDⅡ間的疏水口袋區(qū)及EDⅡ頂部的融合肽（FL）［46］，亞群特異性中和單抗識別EDⅢA strand［34］，具血清型特異性保護作用的抗體結合主要位于EDⅢ蛋白A鏈和側面的脊上重疊并且相鄰的表位［31-42］。

不同血清型對應EDⅢ區(qū)中和抗體結合表位不同，多項研究發(fā)現(xiàn)，含有單一血清型特異性（type?specific，TS）表位、針對2~3種血清型的亞復合體反應（sub?complex reaction，sCR）表位以及同時針對4種血清型的復合體反應（complex reaction，CR）表位，多株鼠源單克隆抗體也分別定位到這些表位。大多數(shù)抗DENVⅠ~ⅡEDⅡ鼠源中和性單抗表位集中E蛋白的A鏈和/或側脊表位。有研究表明幾個能產生免疫反應的弱中和性交叉反應抗體（5A2?7，13D4?1和E111）結合的氨基酸殘基是在EDⅢAB loop［34］。Rajamanonmani等［31］發(fā)現(xiàn)由DENV?2 rEDⅢ免疫小鼠制備中和4種血清型的高效中和性抗體9F12的識別表位為A?strand和BC?loop，9F12單抗主要是在病毒感染早期起預防保護作用，其具廣泛交叉中和病毒的能力，進行優(yōu)化和人源化后可作為治療嚴重登革病例的候選治療性抗體。

李孝權等［47?48］檢測107株E蛋白單抗中的94株具有抗EDⅢ中和活性，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗等篩選的單抗有42株為TS單抗、26株為sCR單抗及23株針為CR單抗，另有3株黃病毒交叉反應單抗。其中CR單抗大都特異性識別相同序列aa310?319，各血清型間在該位點高度保守且是免疫優(yōu)勢的復合體表位，進一步發(fā)現(xiàn)AB loop上的Q316、H317是該表位的關鍵殘基，但該位點單抗中和活性較弱。對鼠源抗EDⅢCR抗體靶位點的深入探究，發(fā)現(xiàn)15株能特異識別DENV?1 ED Ⅲaa309?320，但中和活性較弱，推測AB loop并不是一個良好的亞單位疫苗候選表位。2B11A35和2D73A7則是2株能強力中和DENV 4種血清型的單抗。單抗2B11A35結合表位的關鍵氨基酸殘基在EDⅢ蛋白AB loop、D strand區(qū)（315、316、317、318、356、368 aa）和EF loop、G strand區(qū)（372、374、391 aa）這2個區(qū)域附近，不與AB loop的線性多肽309~310 aa反應，因此推斷2B11A35所識別表位的關鍵位點應該在EF loop附近，同時跨越G strand部分區(qū)域；2D73A7所識別表位的關鍵氨基酸殘基也應該在EF loop附近，同時跨越CC'loop，而單抗2D73A7的表位暴露性優(yōu)于單抗2B11A35的表位。因而認為抗EDⅢ蛋白的交叉保護性中和抗體識別位于EF loop附近區(qū)域［37］。

目前全球報道的DENV中和抗體表位多與DENV E蛋白有關，Dejnirattisai等［36］2015年報道自DF患者血清分離獲得一類具有針對4種型別DENV的廣泛強中和效應的人源抗體，經X?射線晶體結構分析，揭示這些抗體與DENV E蛋白二聚體形成復合物，二者識別的決定性因素為E蛋白二聚體界面的DENV血清型別恒定區(qū)位，包括E蛋白的融合環(huán)主鏈和2個保守的糖鏈，識別表位為E蛋白二聚體依賴性表位（E?dimer?dependent epit?ope，EDE）。該廣譜中和抗體結合靶位點位于E蛋白2個保守的糖基化位點N67和N153，具有很強的中和能力，即使在低濃度下也有50%的中和率，并與抗FL中和抗體中和能力進行對比，發(fā)現(xiàn)該抗EDE抗體不能中和完全未成熟的DENV，但中和完全成熟和部分成熟DENV能力相當。在未成熟顆粒中，覆蓋在E蛋白FL上的prM與E蛋白的結合較弱，這就有利于抗FLE有效取代prM而與FL結合，這點在成熟微粒中就沒那么明顯，反而結合力有所減弱。且該抗EDE單抗ADE效應顯著低于抗FLE單抗產生的ADE效應，具90%的中和效價。

從上述有關E蛋白中和抗體基礎研究情況可以看到：（1）針對DENV EDⅡ：FL loop對應的交叉中和性抗體（E53）大都中和效率低且易產生ADE效應；針對BC loop的交叉中和抗體（1C19）不僅能高效中和DENV且還能與低效抗FL抗體競爭結合。（2）針對DENV EDⅢ：AB loop對應交叉中和抗體一般具弱中和性，EF loop附近形成的單抗（2B11A35/2D73A7）具高效交叉中和能力，A strand表位（單抗，DB32?6）具有高效中和活性；（3）針對EDE：單抗（EDE1/EDE2）是一類新型高效廣譜的人源中和抗體。

由于NS1蛋白不屬于病毒顆粒蛋白，體內產生的抗NS1抗體并不能直接與病毒接觸，具體機制還有待研究。目前國內外研究中，有諸多關于NS1蛋白的免疫原性及制備單抗研究，并應用于臨床DF的急性期診斷。

2.2DENV抗體與ADE

李孝權等［47］建立了通過抗原捕獲定量檢測培養(yǎng)上清中抗原ADE的檢測方法。DENV的ADE效應，目前研究表明主要發(fā)生在二次感染，抗體產生ADE的主要原因是抗體的交叉弱中和性，抗prM抗體是引起ADE的關鍵。在自然條件下，原發(fā)感染DENV，人體產生抗體中大部分具交叉弱中和性，僅有一小部分是型特異性高效中和抗體［42，49-50］。交叉反應型抗PrM抗體在初次感染就有出現(xiàn)，二次感染患者體內的prM抗體水平顯著升高。對于DENV，M蛋白開始出現(xiàn)時病毒始具感染性。無感染性的DENV在抗PrM抗體的作用下，也變得有感染力，抗prM抗體產生ADE不僅因為抗體的交叉性，還與PrM在病毒表面的存在有關。Dejnirattisai等［51］通過對抗NS1抗體、E抗體和prM抗體進行比較分析發(fā)現(xiàn)，只有抗prM抗體在抗體低濃度和高濃度時均促進ADE發(fā)生，而在DENV各血清型中均有很強的交叉反應，但即使在高濃度下也無法中和感染。推測病毒表面prM的部分裂解可減少病毒表面可中和病毒抗體的抗原密度，使DENV在存在抗prM抗體時更容易產生ADE。ADE不僅促進未成熟顆粒與FcγII受體結合使病毒進入細胞，而且增強病毒于細胞內的復制，調節(jié)細胞內抗病毒機制［52］。靶細胞內Furin蛋白酶的活性對內化的未成熟的登革病毒感染性至關重要，這些現(xiàn)象說明未成熟登革病毒存在潛在的高感染性和可能增強疾病的發(fā)生［53］。

有研究表明，型特異性抗體高濃度時在體外和動物模型內有很強的中和能力，而低濃度時也可能會增強病毒感染；一般情況下，交叉反應抗體中和能力較弱且能在一定條件下增強病毒感染表達Fc受體的細胞［49］。因此，找到一個具交叉反應且高效中和能力抗體的保守位點很有必要。如高效交叉中和抗體（1C19）識別的保守位點（BC loop），能競爭抑制低效抗FL單抗的結合，這種特性可能可以用來拮抗、避免ADE［41］。

為了避免ADE效應，有學者［39］通過基因工程技術構建具有廣譜中和活性的雙可變區(qū)抗體DVD1A1D?1G6并對介導ADE效應的Fc段缺失突變，該雙可變區(qū)抗體是將具有一定體內治療作用的鼠源特異性抗DV?4 EDⅢ抗體1G6的可變輕重鏈序列、DV1?3抗體1A1D?2［19］的輕重鏈可變區(qū)序列與人重鏈（Ig G1）和輕鏈（κ）恒定區(qū)連接構成全長人?鼠嵌合抗體。對黃病毒屬的西尼羅病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，在C1q和FcγR敲除小鼠中，抗體的體內保護活性不受影響，可能是由于抗體的中和能力發(fā)揮了比抗體后續(xù)效應功能重要得多的功能。通過抗體改造如進行Fc糖基化改造等也可在一定程度降低或消除ADE效應，但同時也會降低細胞的ADCC效應。對于PrM產生的ADE，進一步找到抗PrM抗體的ADE相關表位，亦是重要的研究方向。

3　結語

綜上所述，DENV抗體基礎研究歷時幾十年，已取得系列重要進展。DENV的E蛋白及其抗體的結構以及相互作用分子機制的解析，已逐步清晰定位中和抗體的作用靶位點，2015年報道的針對EDE的高效廣譜人源中和抗體，給深入的DENV治療性抗體研發(fā)提供了更為明晰的思路。有關抗PrM單抗激發(fā)ADE效應的系列研究以及后續(xù)需要重點關注的ADE靶向表位的相關研究，相信會進一步推進DENV治療性抗體的深入研發(fā)，而目前DENV治療性抗體展現(xiàn)的包含ADE在內的多重復雜的分子交互作用機制，以及與人體細胞免疫等出現(xiàn)的協(xié)同作用，仍需要深入研究。

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2.亞利桑那州立大學生物設計研究所和生命科學學院，亞利桑那州，坦佩AZ 85281

★通訊作者：周曉紅，E?mail：daizhouxh@163.com

基金項目：國家留學基金（留金發(fā)【2010】3009號）；廣州市對外科技合作專項（2012J5100026）；南方醫(yī)科大學交叉學科創(chuàng)新團隊培育計劃（B1012086）

作者單位：1.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院病原生物學系暨廣東普通高校新發(fā)傳染病防治重點實驗室，廣東，廣州510515

Recent progress in basic research concerning the therapeutic anti?dengue antibodies

YIN Qingqing1，WANG Jianyu1，CHEN Qiang2，ZHOU Xiaohong1★
(1.Key Laboratory of Prevention and Control for Emerging Infectious Diseases of Guangdong Higher Institutes,Department of Pathogen Biology,School of Public Health and Tropical Medicine,Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515;2.Biodesign Institute and School of Life Science,Arizona State University,Tempe,Arizona,USA,AZ 85281)

［ABSTRACT］Recently,dengue fever,the mosquito?borne infectious disease,spread rapidly all around the world.However,there is neither specific medicine nor effective vaccine which can be used in clinic.The studies concerning therapeutic?antibodies against dengue virus(DENV)are facing major blocks of antibody?dependent enhancement(ADE),etc.This review highlights the current basic research to figure out the targeted epitope of therapeutic?antibodies against dengue virus and the molecular mechanism involving in ADE.This paper will provide valuable insight for the further studies of dengue fever.

［KEY WORDS］Dengue virus;Therapeutic antibody;Antibody?dependent enhancement;Human?derived neutralizing antibody;E?dimer?dependent epitope