祝　平，沈樹娜

(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

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子宮內(nèi)膜異位癥中Livin和Smac的表達(dá)及相關(guān)性研究

祝平，沈樹娜

(內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

[摘要]目的探討凋亡抑制蛋白家族的新成員Livin、第2個(gè)線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac在子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)中的表達(dá)及二者與月經(jīng)周期、EMs臨床分期的關(guān)系和相關(guān)性分析。方法選取2010年10月至2012年4月在內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科病房因EMs接受腹腔鏡手術(shù)或開腹手術(shù)，并且具有術(shù)后病理確診的EMs患者共60例作為研究組，收集子宮內(nèi)膜異位癥病患的在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織各30例(增生期各16例，分泌期各14例)，對(duì)照組為30例正常內(nèi)膜組織。采用免疫組化SP法檢測出各組標(biāo)本中Livin、Smac蛋白的表達(dá)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果EMs在位、異位內(nèi)膜組織中Livin的表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.510，P<0.05)；EMs在位、異位內(nèi)膜組織中Smac的表達(dá)強(qiáng)度均低于正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.530，P<0.05)。在EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中，Livin和Smac的表達(dá)均與臨床分期無關(guān)(χ2值分別為0.741、0.002，均P>0.05)；在EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中，Livin和Smac的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs值分別為-0.933、-0.867，均P<0.05)。結(jié)論Livin高表達(dá)以及Smac低表達(dá)使異位內(nèi)膜細(xì)胞增生及抗凋亡能力加強(qiáng)，導(dǎo)致了EMs的發(fā)生及發(fā)展。

[關(guān)鍵詞]子宮內(nèi)膜異位癥，凋亡抑制蛋白，胱氨酸蛋白酶激活劑，免疫組織化學(xué)

子宮內(nèi)膜異位癥(簡稱內(nèi)異癥，Endometriosis，Ems)指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔被覆內(nèi)膜及宮體肌層以外的其他部位，卵巢受累最多，其嚴(yán)重危害女性的健康[1]。凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的新成員Livin可通過多種途徑來發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用[2]；而第2個(gè)線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑(second mitochondrial activator of caspase，Smac)可通過阻止IAPs的作用發(fā)揮促凋亡作用[3]。本研究對(duì)Livin、Smac在EMs中的表達(dá)及各因子與月經(jīng)周期、EMs臨床分期的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析，探討兩者與EMs發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為EMs的臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供新的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2010年10月至2012年4月在內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科病房因EMs接受腹腔鏡手術(shù)或開腹手術(shù)，并且具有術(shù)后病理確診的EMs患者60例作為研究組，其中異位內(nèi)膜組織和在位內(nèi)膜組織各30例(增生期各16例，分泌期各14例)。研究組中分為EMs異位組和在位組，EMs異位組：年齡21～52歲，按照美國生育協(xié)會(huì)(American Fertility Society，R-AFS)1985年臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期16例；EMs在位組：EMs患者通過診斷性刮宮或者子宮切除后得到的在位內(nèi)膜，子宮內(nèi)膜的分期是根據(jù)各期內(nèi)膜形態(tài)學(xué)的特點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合月經(jīng)史做出判斷。隨機(jī)選取同期因子宮頸病變行子宮切除術(shù)患者的子宮內(nèi)膜，同時(shí)未合并子宮腺肌病及EMs行子宮切除手術(shù)，術(shù)后病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜的30例患者作為對(duì)照組。

所有入選對(duì)象具有完整的臨床病理資料，術(shù)前6個(gè)月均未服用過類固醇激素、未放置宮內(nèi)節(jié)育器，子宮內(nèi)膜無病理改變，月經(jīng)周期規(guī)律，無內(nèi)分泌疾病史。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組化SP法進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)各個(gè)視野中陽性細(xì)胞的平均百分率，作為該張切片陽性細(xì)胞的百分率，然后打分：陽性細(xì)胞的百分率>75%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，5%～25%為1分，<5%為0分；陽性強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)：深棕黃色為3分；棕黃色為2分；淡棕黃色為1分；無著色或著色很弱為0分。綜合分析判斷結(jié)果以兩者乘積>3分為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Excel 2000建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 16.0軟件包統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1凋亡抑制蛋白Livin基因的表達(dá)

Livin表達(dá)主要在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，內(nèi)膜血管幾乎無表達(dá)，見圖1。

圖1　Livin在Ems在位子宮內(nèi)膜表達(dá)(100×)

Livin在對(duì)照組、在位組和異位組中的陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.510，P<0.05)。在EMs異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜中Livin陽性表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組(χ2值分別為11.280、6.690，均P<0.05)；Livin在EMs在位、異位內(nèi)膜中的陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.693，P>0.05)，見表1。無論是EMs研究組還是對(duì)照組，Livin的陽性表達(dá)在月經(jīng)的增生期與分泌期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

2.2第2個(gè)線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因的表達(dá)

Smac主要表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞的胞漿內(nèi)，內(nèi)膜血管幾乎無表達(dá)，見圖2。

圖2Smac在Ems在位子宮內(nèi)膜表達(dá)(100×)

Fig.2 Smac in eutopic endometrium

Smac在對(duì)照組、在位組和異位組中的陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.530，P<0.05)。在EMs異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜中Smac陽性表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照組(χ2值分別為19.461、5.554，均P<0.05)；Smac在EMs在位、異位內(nèi)膜中的陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.079，P<0.05)，見表1。Smac在EMs在位、異位內(nèi)膜中的陽性表達(dá)在月經(jīng)的增生期與分泌期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而在正常子宮內(nèi)膜中月經(jīng)分泌期的陽性表達(dá)高于增生期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1Livin和Smac在各組中的表達(dá)比較

Table 1 Comparison of Livin and Smac expressions among different groups

表2　　Livin和Smac在各組中增生期和分泌期的表達(dá)比較

2.3凋亡抑制蛋白Livin基因和第2個(gè)線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因的表達(dá)與子宮內(nèi)膜異位癥臨床分期的關(guān)系

EMs在位內(nèi)膜中，Livin在Ⅰ～Ⅱ期的表達(dá)與在Ⅲ～Ⅳ期之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.741，P>0.05)；Smac在Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.002，P>0.05)，見表3。

表3 Livin和Smac的表達(dá)與EMs臨床分期關(guān)系的比較

Table 3 Correlation of Livin and Smac expressions with

clinical staging of EMs

2.4凋亡抑制蛋白Livin基因和第2個(gè)線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因在子宮內(nèi)膜異位癥中的相關(guān)性

應(yīng)用Spearman相關(guān)分析得出：在EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中，Livin與Smac呈負(fù)相關(guān)，rs值分別為-0.933、-0.867，均P<0.05。

3討論

3.1凋亡抑制蛋白Livin基因與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系

IAPs家族的新成員Livin于2000年被發(fā)現(xiàn)[4]，其于人類第20號(hào)染色體q13.3上，包含7個(gè)外顯子及6個(gè)內(nèi)含子，全長約4.6kb。Livin蛋白的羧基末端包含1個(gè)RING環(huán)指結(jié)構(gòu)，由1個(gè)組氨酸(Histidine，His)和7個(gè)半胱氨酸(Cysteine，Cys)結(jié)合了2個(gè)鋅離子組成；N端包含1個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，是一種新型鋅指結(jié)構(gòu)，其中含有70個(gè)高度保守的氨基酸，BIR結(jié)構(gòu)域可能是Livin基因抗凋亡部位。近年來研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜中存在凋亡，其周期性的細(xì)胞增生及脫落是通過細(xì)胞凋亡和增殖失衡來實(shí)現(xiàn)的，這種周期性改變被促凋亡基因的水平調(diào)控[5]。有研究表明Livin可通過以下3種途徑抑制細(xì)胞凋亡[6-7]：①Livin可抑制半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(Cysteine-containing，aspartate-specificpr-oteases，Caspase)-3的活性，同時(shí)與未激活的Caspase-9、激活的Caspase-9及Caspase-9前體蛋白相結(jié)合，阻斷它們依次切割激活，并阻斷Caspase-3對(duì)Caspase-9前體的正反饋激活，從而產(chǎn)生抗凋亡作用；②Livin可與TAB1(TAK1 binding protein，TAK1蛋白結(jié)合蛋白)結(jié)合后使TAK1(TGF beta-activated kinase，激活轉(zhuǎn)化生長因子β蛋白激酶)被激活，而TAB1是TAK1的共同活化劑(coactivator)，具有促進(jìn)絲裂原活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)1的激活作用，從而通過TAB1/TAK1途徑激活JNK1對(duì)抗細(xì)胞發(fā)生凋亡；③Livin可阻止化療藥物致使的細(xì)胞DNA損毀作用導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，Livin在EMs異位、在位內(nèi)膜中的陽性表達(dá)顯著超過了正常子宮內(nèi)膜，Livin在前兩組內(nèi)膜中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。無論是EMs組還是正常對(duì)照組，Livin的陽性表達(dá)與月經(jīng)周期及臨床分期均無關(guān)聯(lián)。近年來國內(nèi)外有關(guān)Livin在正常內(nèi)膜及EMs的表達(dá)相關(guān)報(bào)道很少，王春芳等[8]使用免疫組化方法檢測了30例正常子宮內(nèi)膜及30例EMs在位及異位內(nèi)膜組織中Livin的表達(dá)，結(jié)果顯示Livin在正常組中的表達(dá)遠(yuǎn)低于在位和異位內(nèi)膜，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持本研究結(jié)果。目前己發(fā)現(xiàn)Livin在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。Livin在正常組織中表達(dá)量很少，但可在肺癌、乳腺癌、消化系統(tǒng)惡性腫瘤、膀胱癌、白血病及淋巴瘤等惡性腫瘤組織中高表達(dá)。

3.2第二個(gè)線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系

第2個(gè)線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑/低等電點(diǎn)IAP直接結(jié)合蛋白(Smac/DIABLO蛋白)是2000年在進(jìn)行HeLa細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的[9]。人類Smac基因定位于12號(hào)染色體的長臂，包含7個(gè)外顯子，其mRNA全長約1.5kb，編碼了239個(gè)氨基酸，其中N端55個(gè)氨基酸被稱為線粒體靶序列(mitochondrial targeting sequence，MTS)，其功能在于使未經(jīng)加工的Smac蛋白確保定位于線粒體，而在Smac移入線粒體后MTS被線粒體內(nèi)信號(hào)肽裂解，最終生成含有184個(gè)氨基酸殘基，未加工的Smac蛋白同時(shí)獲得凋亡活性。成熟的Smac蛋白以二聚體的形式存在于線粒體的膜間隙，當(dāng)受到凋亡誘導(dǎo)因子如抗癌藥物、化學(xué)或物理的凋亡信號(hào)等的作用時(shí)釋放入胞漿[3]。Smac因子促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制表現(xiàn)為[10-11]：①Smac的N-末端四肽與Caspase-9 N-末端四肽具有明顯的同源性，通過競爭方式解除對(duì)Caspase-9的抑制作用，激活Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的進(jìn)展；②Smac可促進(jìn)Pro-caspase-3裂解，促使其產(chǎn)物p24順利裂解得到產(chǎn)物p20/p17，后者能夠與p12共同構(gòu)成活化的Caspase-3，而活化的Caspase-3反過來又能激活Caspase-9酶原，形成正反饋通路進(jìn)一步達(dá)到促細(xì)胞凋亡作用；③Kim(2005年)研究發(fā)現(xiàn)Smac因子促進(jìn)細(xì)胞凋亡可能還存在非Caspase依賴方式，推測該方式可能比依賴Caspase途徑的效率更高。本研究結(jié)果顯示：Smac在正常子宮內(nèi)膜、EMs在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜的陽性表達(dá)明顯呈降低趨勢，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Smac在EMs在位和異位內(nèi)膜中的陽性表達(dá)與月經(jīng)周期及臨床分期無關(guān)(均P>0.05)，而在正常子宮內(nèi)膜中月經(jīng)分泌期的表達(dá)高于增生期(P<0.05)。這與子宮內(nèi)膜在分泌期凋亡加劇以促使內(nèi)膜剝脫的理論是一致的[12]。

3.3凋亡抑制蛋白Livin基因和第2個(gè)線粒體來源的胱氨酸蛋白酶激活劑Smac基因的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，在EMs中Livin和Smac呈負(fù)相關(guān)。Livin和Smac蛋白均可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡在EMs的發(fā)生中發(fā)揮作用，二者可能是EMs發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)[8]，且二者的協(xié)同作用可能促使異位內(nèi)膜細(xì)胞的促凋亡能力減弱，抗凋亡能力增強(qiáng)，導(dǎo)致內(nèi)膜細(xì)胞在異域的增生失控。EMs患者在位和異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率低、增殖率高，具有生物活性的正常內(nèi)膜組織細(xì)胞隨經(jīng)血逆流入盆腹腔，在盆腔內(nèi)不發(fā)生凋亡反而繼續(xù)存活、種植，造成了異位病灶在此發(fā)生、發(fā)展。RNAi技術(shù)是新近發(fā)展的一種分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)與特異的mRNA結(jié)合使目的基因瓦解，利用這種沉默特定基因技術(shù)，為疾病的基因治療提供了新的發(fā)展方向。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：張冠軍]

[收稿日期]2016-01-20

[作者簡介]祝平(1980-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

[通訊作者]沈樹娜，主任醫(yī)師。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.04.017

[中圖分類號(hào)]R711.71

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-5293(2016)04-0466-04

Expressions of Livin and Smac and their correlation in endometriosis

ZHU Ping, SHEN Shu-na

(Department of Gynecology and Obstetrics, Inner Mongolia Baogang Hospital, Inner Mongolia Baotou 014010, China)

[Abstract]Objective To explore the expressions of new member of apoptosis inhibiting protein family Livin and second mitochondrial activator of caspase (Smac) in EMs and and analyze the relationship between their expressions and menstrual cycle as well as EMs clinical staging. Methods In the Third Affilated Hospital of Inner Mongolia Medical College, 60 cases of EMs confirmed by pathological results after lapascopic surgery or abdominal surgery were selected in study group. Thirty samples of ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs (16 samples in proliferative phases and 14 samples in secretive phases) were collected in study group and another 30 samples of normal endometrium tissues were collected in control group. The method of immunohistochemistry was used to determine the expressions of Livin and Smac proteins. All statistical analyses were carried out with SPSS16.0 software. Results The expressions of Livin in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs group were significantly higher than in the control group with statistical significance (χ2=12.510, P<0.05). But the expressions of Smac in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs group were significantly lower than in the control group with statistical significance (χ2=19.530,P<0.05). Both in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs group and the control group, the expressions of Livin and Smac were not correlated with clinical staging (χ2 value was 0.741 and 0.002, respectively, both P>0.05). In study group the expression of Livin was negatively correlated with that of Smac both in ectopic endometrium and eutopic endometrium of EMs (rs value was -0.933 and -0.867, respectively, both P<0.05). Conclusion The high expression of Livin and low expression of Smac strengthen the ability of hyperplasia of endometrial cells and antiapoptotic capacity, which leads to the occurrence and development of EMs.

[Key words]endometriosis (EMs); inhibitor of apoptosis proteins (IAPs); second mitochondrial activator of caspase (Smac); immunohistochemistry