黃勛和，翁茁先，李威娜，陳潔波，鐘福生*， 唐壽桂，趙宇旗

(1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.衡山縣畜牧水產(chǎn)局，湖南 衡陽 421300；4.衡山湘旗農(nóng)牧有限責(zé)任公司，湖南 衡陽 421341)

基于線粒體DNA D–loop序列的黃郎雞遺傳多樣性與品種起源研究

黃勛和1，翁茁先2，李威娜1，陳潔波1，鐘福生1*， 唐壽桂3，趙宇旗4

(1.嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.衡山縣畜牧水產(chǎn)局，湖南 衡陽 421300；4.衡山湘旗農(nóng)牧有限責(zé)任公司，湖南 衡陽 421341)

摘 要：采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法對(duì)黃郎雞50個(gè)個(gè)體的線粒體DNA D–loop序列進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)黃郎雞周邊省份地方雞的進(jìn)化支地理分布特征。結(jié)果表明，黃郎雞具有較高的線粒體遺傳變異水平，檢測(cè)到 26個(gè)變異位點(diǎn)，核苷酸多樣性為0.012 54±0.000 94，核苷酸差異均數(shù)為6.569，單倍型多態(tài)性為0.886±0.035。在定義的23種單倍型中，13種單倍型為首次發(fā)現(xiàn)，單倍型落在A、B、C、E共4個(gè)進(jìn)化支，B為優(yōu)勢(shì)單倍群。系統(tǒng)進(jìn)化分析和進(jìn)化支的地理分布特征表明，黃郎雞起源于中國(guó)北方和西南地區(qū)，同時(shí)受鄰省地方雞基因交流的影響。

關(guān) 鍵 詞：黃郎雞；D–loop序列；遺傳多樣性；單倍型；地理分布

投稿網(wǎng)址：http://xb.ijournal.cn

地方家禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分，是經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化而形成的寶貴資源，是未來家禽品種改良和適應(yīng)生產(chǎn)條件變化、保持生產(chǎn)長(zhǎng)期持續(xù)發(fā)展的遺傳基礎(chǔ)，即使是低產(chǎn)量的品種，也可能因其對(duì)人們感興趣的性狀有所貢獻(xiàn)而成為未來育種的寶貴遺傳資源[1–2]。黃郎雞又稱湘黃雞，屬兼用型地方品種，原產(chǎn)地為湖南省衡南縣的泉溪、雙林、花橋，中心產(chǎn)區(qū)為衡陽市[3]。黃郎雞具有遺傳性能穩(wěn)定、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、肉質(zhì)鮮嫩等特點(diǎn)，深受當(dāng)?shù)厝说南矏?。黃郎雞生長(zhǎng)較慢，飼料轉(zhuǎn)化比

線粒體DNA(mtDNA)因具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、含量豐富、進(jìn)化快、嚴(yán)格的母系遺傳特點(diǎn)而被廣泛用于動(dòng)物群體遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化等研究[4–8]。本研究中應(yīng)用線粒體DNA D–loop序列對(duì)黃郎雞進(jìn)行遺傳多樣性分析，評(píng)估其品種遺傳資源現(xiàn)狀及保護(hù)潛力，探討其品種的起源分化，旨在為黃郎雞的科學(xué)保護(hù)和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃郎雞共50只，其中30只來源于衡山湘旗農(nóng)牧有限責(zé)任公司，20只來源于衡陽市畜牧局黃郎雞原種場(chǎng)。翅靜脈取黃郎雞血0.2～0.5 mL，2% EDTA抗凝–70 ℃保存。其余中國(guó)地區(qū)家雞及原雞的D–loop序列下載于 GenBank(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/)。使用試劑盒 HiPure Blood DNA Mini Kit(美基生物，廣州)提取樣品DNA，－20 ℃保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定

D–loop擴(kuò)增引物序列為 L16750(5'–AGGACT ACGGCTTGAAAAGC–3'[9])和H522(5'–ATGTGCC TGACCGAGGAACCAG–3'[10])。PCR反應(yīng)體系30 μL，含10×PCR Buffer 3 μL，dNTP mixture(2.5 mmol/L) 2.4 μL，引物各0.3 μL(20 μmol/L)，Taq DNA聚合酶(寶生物工程有限公司，大連)1.5 U，DNA模板100 ng。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性4 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸50 s)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送上海立菲生物技術(shù)有限公司(廣州)雙向測(cè)序。

1.2.2 序列分析

用BioEdit 7.2.5[11]軟件讀取測(cè)序序列，對(duì)每個(gè)序列進(jìn)行人工檢查校對(duì)。將所獲序列用Clustal X軟件[12]進(jìn)行比對(duì)排列后，以 NC_007235為參考序列，用DnaSP 5.0軟件[13]定義單倍型，并計(jì)算單倍型多樣性(haplotype diversity)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity)和核苷酸差異均數(shù)。統(tǒng)計(jì)湖南省和周邊省份已發(fā)表D–loop數(shù)據(jù)的家雞個(gè)體數(shù)及其在該省份的唯一單倍型數(shù)。通過NETWORK 4.6.1.3軟件[14]構(gòu)建中值連接網(wǎng)絡(luò)圖(Median-joining networks)，顛換/轉(zhuǎn)化的權(quán)重比設(shè)為 3∶1[15]。用 MEGA 6.0 軟件[16]中的Kimura 2–parameter (K2P)模型計(jì)算遺傳距離，采用鄰接法(neighbor–joining，NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，1 000步自檢舉(bootstrap)檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹各節(jié)點(diǎn)的置信值。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

表1列出了黃郎雞線粒體DNA D loop的單倍型及其在不同地區(qū)的共享單倍型數(shù)量。

表1 黃郎雞線粒體DNA D–loop的單倍型及其在不同地區(qū)的共享單倍型數(shù)量Table 1 Variable sites and shared haplotypes among the different sub-region in China

表1(續(xù))

除去 PCR引物序列，共獲得 524 bp mtDNA D–loop序列。50 個(gè)個(gè)體線粒體D–loop中共檢測(cè)到26個(gè)變異位點(diǎn)(24個(gè)轉(zhuǎn)換，2個(gè)顛換)，占分析位點(diǎn)的 4.96%，其中單一位點(diǎn)突變(singleton variable sites)7個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsimony informative sites)19個(gè)(表1)。T、C、A、G的平均含量分別為30.1%、30.0%、27.5%、12.4%。A+T 的含量為57.6%，高于 G+C 的含量(42.4%)。核苷酸多樣性為 0.012 54±0.000 94，核苷酸差異均數(shù)為6.569。在26個(gè)變異位點(diǎn)中定義了 23種單倍型，單倍型多態(tài)性為0.886±0.035，其中 13種單倍型為首次發(fā)現(xiàn)，B20為優(yōu)勢(shì)單倍型，其次是C66。

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從GenBank選擇代表主要單倍群的390種單倍型與黃郎雞的單倍型構(gòu)建無根鄰接樹(unrooted NJ tree)。無根鄰接樹分為13枝分化明顯的分支(A–I，W–Z)，黃郎雞主要落在進(jìn)化支A、B、C和E，其分布頻率分別為5/50、29/50、13/50、3/50，B為優(yōu)勢(shì)單倍群(表1、圖1)。在2 658個(gè)中國(guó)家雞中，與黃郎雞單倍群A共享單倍型的有315個(gè)，與B單倍群共享的有490個(gè)，與C單倍群共享的有99個(gè)，與E單倍群共享的有17個(gè)(表1)。將與湖南省及周邊地區(qū)進(jìn)一步劃為華東、華北、中南、西南4個(gè)地區(qū)[17]，與黃郎雞共享單倍群最多的為西南地區(qū)(347個(gè)，27.52%)，其次是中南地區(qū)(311個(gè)，43.02%)，第三是華東地區(qū)(244個(gè)，40.46%)，最后是華北地區(qū)(19個(gè)，26.76%)。

圖1 390種從GenBank下載的家雞和紅原雞單倍型和23種黃郎雞單倍型構(gòu)建的無根鄰接樹Fig. 1 Unrooted neighbor–joining (NJ) tree of 390 haplotypes in domestic chickens and red jungle fowls downloaded from GenBank and 23 haplotypes in Huanglang

2.3 進(jìn)化支的地理分布

中國(guó)家雞主要進(jìn)化支的網(wǎng)絡(luò)圖和地理分布情況分別見圖2和表2。

圖2 主要進(jìn)化支的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network profiles of the major clades

表2 中國(guó)家雞主要進(jìn)化支的地理分布Table 2 Geographical distribution of the major clades in domestic chickens of China

在統(tǒng)計(jì)的2 658只家雞的單倍型中，進(jìn)化支A、B、C和E在所有省份均有分布，其中A和B為優(yōu)勢(shì)單倍群，占統(tǒng)計(jì)的59.74%，而D、F、G、H、Z只在部分省份分布(表2)。進(jìn)化支D只在河南省有分布(文獻(xiàn)[4]曾報(bào)道其在云南省有分布，但校正結(jié)果表明在云南分布的為單倍群H[17])，F(xiàn)只分布在四川貴州和廣西，G只分布在廣西和河南，H只分布在云南?？梢?，與一些家養(yǎng)動(dòng)物[18]相似，家雞表現(xiàn)出一定的地理分布特征[4]。有趣的是，在華東地區(qū)的浙江省發(fā)現(xiàn)了罕見的進(jìn)化支Z，該個(gè)體為江山烏骨雞。由于地理毗鄰，所以許多省份的單倍群組成相似，如云南、四川、貴州的與廣西的相似，福建、江西、浙江的與山東和河南的相似。

與中國(guó)其他地區(qū)相比，西南地區(qū)家雞遺傳資源更為豐富(這與西南地區(qū)為家雞的起源地之一[4,17]和生物多樣性理論[19]是相一致的)。單倍群A與B在中國(guó)華東、華北、中南、西南地區(qū)分布較為均勻(占所在地區(qū)分布數(shù)量的比例最低為9.86%，最高為37.65%，平均為27.54%)，單倍群F與G大部分分布在西南地區(qū)，極少部分分布在中南地區(qū)。雖然華北地區(qū)家雞數(shù)目較少，但部分單倍型所占比重較大，如C02、C25、C29和E32(圖2)。河北地方雞的單倍群C的比例占該地區(qū)單倍型達(dá)52.11%，與其接近的有安徽(55.17%)和湖北(45.45%)，而西南地區(qū)單倍型C的比例(云南1.33%、四川4.81%、貴州3.37%)遠(yuǎn)低于其他地區(qū)。

3 結(jié)論與討論

本研究中黃郎雞的遺傳多樣性高于寧都黃雞、萬載黃雞[20]、固始雞和白耳黃雞[21]等地方雞；并且在23種單倍型中，13種為首次發(fā)現(xiàn)，表明黃郎雞具有較高的遺傳保護(hù)潛力和開發(fā)利用價(jià)值。

黃郎雞A、B、C和E這4個(gè)單倍群在中國(guó)家雞群體中為優(yōu)勢(shì)單倍群，在華東、華北、中南、西南的所有省份均有分布。此外，沒有發(fā)現(xiàn)品種特異的母系分支，說明過去頻繁的人類遷徙擴(kuò)散，經(jīng)貿(mào)往來在家雞的馴化與品種形成中起著重要的作用，家雞遺傳組成逐漸融合，品種間差異逐漸減小[4,22]。黃郎雞單倍群B占總數(shù)的50%以上，與湖南省除研究區(qū)域之外的其他地方的單倍型組成相似，也與江西省、江蘇省、浙江省的單倍型組成接近。由地理毗鄰、頻繁的人類遷徙和貿(mào)易等使地方雞之間發(fā)生基因交流，這些地區(qū)地方雞對(duì)黃郎雞品種的形成具有一定的遺傳貢獻(xiàn)。

現(xiàn)代家雞馴化的多起源學(xué)說已得到廣泛的認(rèn)可[4,5,7,17,23–24]。Xiang等[21]認(rèn)為中國(guó)北方地區(qū)是現(xiàn)代家雞的重要起源地和最早馴化地。在本研究中統(tǒng)計(jì)的中國(guó)家雞的單倍型中，河北地方雞的單倍群C占該地區(qū)單倍型的50%以上，與其接近的有安徽、湖北、湖南、河南、浙江、廣西，而西南地區(qū)單倍型C的比例遠(yuǎn)低于其他地區(qū)，表明河北等中國(guó)北方地區(qū)可能也是家雞的馴化地之一，這些地區(qū)對(duì)中國(guó)現(xiàn)代家雞的馴化和品種多樣性的形成有重要貢獻(xiàn)。本研究結(jié)果支持了Xiang等[25]的觀點(diǎn)。

綜上所述，黃郎雞起源于中國(guó)西南和華北地區(qū)，同時(shí)受鄰近地區(qū)家雞的影響，是在人工選育和特殊地理和人文環(huán)境中逐漸形成的具有地方特性的家雞品種。

感謝湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院李麗平副教授和許美解教授在采集樣品時(shí)提供了幫助。

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責(zé)任編輯：王賽群

英文編輯：王 庫(kù)

中圖分類號(hào)：S 831.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-1032(2016)01-0075-06

收稿日期：2015–08–05 修回日期：2016–01–05

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030307018)；嘉應(yīng)學(xué)院“創(chuàng)新強(qiáng)校工程”項(xiàng)目(CQX019)；廣東省公益研究與能力建設(shè)項(xiàng)目(2015A020208020)；國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2013GA780066)；嘉應(yīng)學(xué)院重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015KJM03)

作者簡(jiǎn)介：黃勛和(1982—)，男，廣東河源人，博士，主要從事中國(guó)地方雞遺傳多樣性與分子進(jìn)化研究；*通信作者，鐘福生，博士，教授，主要從事動(dòng)物生產(chǎn)與環(huán)境科學(xué)研究，zfs@jyu.edu.cn低，個(gè)體間差異較大，外來品種的大量引進(jìn)及規(guī)?；B(yǎng)殖也導(dǎo)致其品質(zhì)降低和遺傳多樣性下降，因此，探索黃郎雞的遺傳多樣性，對(duì)黃郎雞的品種起源和遺傳資源評(píng)價(jià)及種質(zhì)資源保護(hù)與利用都有重要的參考價(jià)值。

Genetic diversity and breed origin of Huanglang chicken inferred from mitochondrial DNA D–loop sequence

Huang Xunhe1, Weng Zhuoxian2, Li Weina1, Chen Jiebo1, Zhong Fusheng1*, Tang Shougui3, Zhao Yuqi4
(1.School of Life Sciences, Jiaying University, Meizhou, Guangdong 514015, China; 2.College of Animal Science & Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 3.Bureau of Animal Husbandry and Fisheries of Hengshan County, Hengyang, Hunan 421300, China; 4. Hengshan Xiangqi Agriculture and Animal Husbandry Co., Ltd., Hengyang, Hunan 421341, China)

Abstract:Fifty Huanglang chickens were selected to directly sequencing using the PCR products. Geographic distribution of the clades of chickens from China was analysis. The results showed that Huanglang had high levels of genetic diversity, with nucleotide diversity, nucleotide differences and haplotype diversity were 0.012 54±0.000 94, 6.569 and 0.886±0.035, respectively. In the 26 variable sites, 23 haplotypes were defined, 13 of which was new. These haplotypes were belonging to clade A, B, C and E, respectively, and E was dominated haplogroup. Phylogenetic analysis and geographic distribution of the clades suggested that Huanglang originated from north and southwest China, and the gene flow with neighbor chickens was contributed significantly to this breed formation.

Keywords:Huanglang chicken; DNA D–loop sequence; genetic diversity; phyletic evolution; geographic distribution